◎ 張辰辰，程紅艷

（1.濟(jì)寧市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 濟(jì)寧 272000；2.辰欣藥業(yè)股份有限公司，山東 濟(jì)寧 272000）

在我國(guó)畜禽養(yǎng)殖業(yè)中抗生素濫用問(wèn)題一直比較嚴(yán)重，濫用抗生素勢(shì)必會(huì)導(dǎo)致其在畜禽體內(nèi)殘留，不僅會(huì)給動(dòng)物性食品安全帶來(lái)潛在隱患，更會(huì)對(duì)人類的健康、環(huán)境造成危害[1]。地塞米松和甲硝唑?yàn)槌Ｒ?jiàn)的易殘留獸藥，長(zhǎng)期食用此類藥物殘留的食品，會(huì)造成其在人體內(nèi)蓄積，可能產(chǎn)生多種慢性疾病。

國(guó)內(nèi)外食品中地塞米松和甲硝唑的檢測(cè)方法較多，但都是單一檢測(cè)其中的一種殘留量[2-3]，且前處理方法繁瑣，檢測(cè)周期長(zhǎng)，本文旨在建立一種可同時(shí)檢測(cè)畜禽肉中地塞米松、甲硝唑的UPLC-MS/MS法，可望用于畜禽肉中獸藥的快速檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

Exion LC-triple quad 3500液質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)SCIEX）；高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀）；全自動(dòng)平行濃縮儀（美國(guó)Labtech）；超純水儀（美國(guó)Millipore）；XSE104天平（梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（中國(guó)）有限公司）。

1.2 材料與試劑

試驗(yàn)所用樣品購(gòu)自超市及農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)品（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中心，100 μg·mL-1，甲醇）、地塞米松標(biāo)準(zhǔn)品（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，100 μg·mL-1，甲醇）；乙腈、甲醇（色譜純，美國(guó)Fisher）；甲酸（分析純，上海阿拉?。?；固相萃取柱（Waters Oasis HLB 3 mL/60 mg）。

地塞米松、甲硝唑混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：吸取地塞米松和甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，加空白基質(zhì)溶液制成 1.0 ng·mL-1、2.5 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1和50.0 ng·mL-1的混合基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 色譜和質(zhì)譜條件

色 譜 柱：Agilent Eclipse Plus C18（1.8 μm，100 mm×2.1 mm）；流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液（v/v），流動(dòng)相B：甲醇（含0.1%甲酸），梯度洗脫：0～1 min，90%A；1～6 min，90%→5%A；6～8 min，5%A；8～8.1 min，5%→90%A；流速：0.3 mL·min-1，進(jìn)樣量：10 μL，柱溫：40 ℃。掃描模式：MRM，ESI正負(fù)離子同時(shí)掃描，電噴霧電壓：5 500 V（+）/4 500 V（-）；霧化器壓力：0.345 MPa；氣簾氣壓力：0.069 MPa；離子源溫度：550 ℃。噴霧氣壓力：50 psi；輔助氣壓力：50 psi。在上述條件下優(yōu)化去簇電壓（DP）和碰撞氣能量（CE），結(jié)果見(jiàn)表1。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

在濟(jì)寧本地超市及農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)進(jìn)行采樣，共計(jì)30份，包括豬肉、羊肉、雞肉。樣品通過(guò)粉碎機(jī)打碎成肉泥，冷藏待用。稱取10.00 g樣品于50 mL具塞離心管中，加80%乙腈溶液（含0.2%甲酸）10.0 mL，渦旋混勻，8 000 r·min-1離心10 min，取上清液待凈化。取Oasis PRiME HLB固相萃取柱，將上清液過(guò)固相萃取柱，棄去約1 mL初濾液，收集后續(xù)濾液5.0 mL于40 ℃水浴N2流下吹干，加1.0 mL初始流動(dòng)相復(fù)溶，過(guò)0.22 μm濾膜至進(jìn)樣瓶中，供上機(jī)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方法的優(yōu)化

本文選擇乙腈水溶液為提取溶劑，考察了純乙腈、80%乙腈、60%乙腈水溶液對(duì)樣品提取效果的影響，結(jié)果顯示80%乙腈溶液共提取物較少，響應(yīng)值高。有文獻(xiàn)報(bào)道[4]在乙腈中加入適量甲酸有利于樣品中蛋白質(zhì)沉淀，故考察了體積分?jǐn)?shù)為0.05%、0.1%、0.2%、0.5%甲酸乙腈溶液的提取效果，結(jié)果顯示以0.2%甲酸乙腈水溶液提取時(shí)各組分回收率較高，因此最終選擇含0.2%甲酸的80%乙腈溶液為最終提取液。所得提取液利用PRiME HLB固相萃取柱直接凈化去磷脂，濃縮后檢測(cè)分析。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

試驗(yàn)采用50 ng·mL-1混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，依次用甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相，用注射泵連續(xù)進(jìn)樣進(jìn)行質(zhì)譜條件的優(yōu)化。分別在ESI-、ESI+兩種模式下進(jìn)行Q1掃描，發(fā)現(xiàn)0.1%甲酸有利于增強(qiáng)離子強(qiáng)度，地塞米松形成[M+CH3COO]-、甲硝唑形成[M-H]+，其m/z分別為437.2、172.0。再對(duì)母離子進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，優(yōu)化去簇電壓和碰撞電壓，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 監(jiān)測(cè)離子對(duì)優(yōu)化參數(shù)表

2.3 色譜條件的優(yōu)化

本文比較了甲醇、乙腈與含0.05%、0.1%和0.2%甲酸水溶液的水相體系對(duì)待測(cè)物峰型、靈敏度等方面的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相為甲醇體系且甲酸含量為0.1%時(shí)，定量離子的響應(yīng)值及峰型最佳，故選擇甲醇水體系（含0.1%甲酸）為流動(dòng)相；并在此基礎(chǔ)上優(yōu)化梯度洗脫程序，使待測(cè)物出峰能夠良好分離。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

參照《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》（GB/T 27404—2008）對(duì)本方法線性、回收率、精密度和定量限進(jìn)行了評(píng)價(jià)[5]。實(shí)驗(yàn)以空白樣品基質(zhì)提取液配制濃度1.0～50 ng·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在上述優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下，以峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（ng·mL-1）為橫坐標(biāo)，采用外標(biāo)法繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，結(jié)果表明地塞米松和甲硝唑在0.2～10 μg·kg-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r依次為0.997 8和0.999 1。以10倍信噪比計(jì)算定量限，二者定量限均低于0.5 μg·kg-1，滿足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)要求。選擇兩類陰性樣品基質(zhì)添加3個(gè)濃度水平（2.5 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1）的混標(biāo)溶液，每個(gè)水平 6 個(gè)平行，考察方法的回收率和精密度，結(jié)果見(jiàn)表2。從表中可看出，兩種組分在不同基質(zhì)中的加標(biāo)回收率為89.3%～101.7%，RSD為0.9%～4.5%。

表2 不同基質(zhì)中地塞米松、甲硝唑回收率和精密度表（n=6）

2.5 樣品測(cè)定

采用本法測(cè)定了30批本地市售的畜禽肉（豬肉、羊肉、雞肉3種基質(zhì)，每種基質(zhì)各10份），均未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性樣品。

3 結(jié)論

本研究采用了甲酸化乙腈溶液為提取液，并沉淀蛋白，所得上清液直接通過(guò)Oasis PRiME HLB固相萃取柱凈化去磷脂，流出液在N2流下吹干，加1.0 mL初始流動(dòng)相復(fù)溶，以ESI源正負(fù)同掃的離子化模式，建立了多種畜禽肉中地塞米松、甲硝唑的UPLC-MS/MS快速檢測(cè)方法。該方法較國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法前處理簡(jiǎn)便、分析時(shí)間短，可滿足多種畜禽肉中地塞米松和甲硝唑殘留量的同時(shí)檢測(cè)。