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        油茶籽仁中茶皂素的提取與分析

        2021-06-16 07:44:38張洺榛廖小麗
        現(xiàn)代食品 2021年7期
        關(guān)鍵詞:香草醛油茶籽皂素

        ◎ 張洺榛,廖小麗

        (1.湖北江曉環(huán)??萍加邢薰荆?武漢 430000;2.武漢海關(guān)技術(shù)中心,湖北 武漢 430000)

        油茶作為21世紀(jì)重要的木本油料作物之一,近年來(lái)一直被作為研究熱點(diǎn)為廣大學(xué)者所熱衷。油茶的主要利用部分為油茶果,油茶果主要由油茶外殼、油茶籽殼、油茶籽仁三大組分構(gòu)成[1],其中,油茶籽仁除含有大量的不飽和脂肪酸外,蛋白質(zhì)、糖類、茶皂素等也是其主要成分,同時(shí)油茶籽仁還含有植物甾醇、角鯊烯等微量活性成分。在這些組分當(dāng)中,茶皂素又是其中的熱點(diǎn)。茶皂素又被稱為茶皂苷,熔點(diǎn)約224 ℃,平均分子式為C57H90O26,相對(duì)分子質(zhì)量為1 200~2 800,是一種天然的糖苷化合物[2],同時(shí)也具備這一類物質(zhì)的通性——易溶于乙醇和甲醇,但是難溶于無(wú)水甲醇和無(wú)水乙醇,不溶于石油醚、苯等有機(jī)試劑。由于其具備抗菌、抗病毒、降血脂等諸多優(yōu)勢(shì),茶皂素被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)美、食品等領(lǐng)域[3]。

        油茶是我國(guó)的特色植物,在國(guó)外的種植較為稀少,所以國(guó)外學(xué)者對(duì)于油茶及其相關(guān)物質(zhì)的研究不多[4]。而國(guó)內(nèi)學(xué)者提取茶皂素的方法主要分為水提法和醇提法兩種,經(jīng)有關(guān)學(xué)者試驗(yàn)得知,水提法提出來(lái)的茶皂素相對(duì)于醇提法來(lái)說(shuō)雜質(zhì)多一些,但是水提法相對(duì)成本低廉,所以這兩種方法在實(shí)際的工業(yè)生產(chǎn)當(dāng)中都有所應(yīng)用[5]。本文采用80%熱乙醇溶液(75 ℃)進(jìn)行浸提,為了保證其得率,采用復(fù)提取的方法進(jìn)行提取。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        樣品采用湖南衡陽(yáng)產(chǎn)地曬干帶殼茶籽。茶皂素分析標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%,阿拉?。?。無(wú)水乙醇(AR)、硫酸(1.86 g·mL-1)、香草醛(AR)、石油醚(30~60 ℃,AR),試劑均為上海國(guó)藥集團(tuán)生產(chǎn);純水(滿足實(shí)驗(yàn)室三級(jí)水及以上),實(shí)驗(yàn)室常用材料及耗材。

        1.2 儀器與設(shè)備

        E7221型紫外-可見分光度計(jì)及其配套器材;me2041型電子天平(感量為0.000 1 g);HH-S1型恒溫水浴鍋;101-4B型鼓風(fēng)干燥機(jī);HU10300/40B型超聲清洗機(jī);2500型粉碎機(jī)。

        1.3 溶液配制

        80%乙醇溶液(V/V):4份無(wú)水乙醇加1份純水,充分混勻;1 mg·mL-1茶皂素標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱取100 mg樣品,用80%乙醇溶液溶解并定容至100 mL;77%硫酸溶液(V/V):將77.00 mL硫酸(1.86 g·mL-1)用玻璃棒緩慢引流至盛有23.00 mL純水的200 mL燒杯中;8%香草醛溶液(W/V):將4 g香草醛固體溶于50.00 mL的80%乙醇溶液中。

        1.4 樣品預(yù)處理

        1.4.1 去殼處理

        將200 g左右茶籽裝在網(wǎng)袋中用木錘進(jìn)行捶打,使油茶籽殼與油茶籽仁分離,然后挑選出茶籽仁。在這個(gè)過(guò)程中需要將所有茶籽分離,保證樣品的均一性,同時(shí)在捶打過(guò)程中應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格控制好力度,防止樣品破碎導(dǎo)致出油率過(guò)高出現(xiàn)黏連等現(xiàn)象,引入過(guò)大的誤差。

        1.4.2 粉碎

        將步驟1.4.1中分離的油茶籽仁放入粉碎機(jī)中粉碎,粉碎后過(guò)20目篩,樣品過(guò)篩率要達(dá)到95%以上且不可以強(qiáng)行過(guò)篩,過(guò)篩完后將樣品混勻,裝袋備用。

        1.4.3 含水率測(cè)定

        通過(guò)重量法進(jìn)行含水率測(cè)定,在烘干、干燥、恒重后的鋁盒中加入步驟1.4.2中樣品(10.0±0.1)g,蓋上鋁盒放入烘箱烘干至恒重,以上遵循國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》(GB 5009.3—2016)。該步驟是為了能夠校正后面測(cè)定樣品的實(shí)際質(zhì)量,從而使結(jié)果誤差有效降低。

        1.4.4 索氏提取

        以石油醚做提取劑用感量為0.000 1 g的電子天平稱取步驟1.4.2中樣品(1.00±0.01)g,按照索氏提取的操作規(guī)程用濾紙將樣品包起來(lái),折成適宜大小放入虹吸管進(jìn)行索氏提取,時(shí)間為6 h。該步驟是為了充分將油清除,防止后面在顯色時(shí)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

        1.4.5 干燥

        將索氏提取完成后的濾紙包取出,放入鼓風(fēng)干燥機(jī)中(70±2)℃恒溫烘干30 min,將殘留的石油醚蒸發(fā)耗盡。

        1.4.6 乙醇提取

        將干燥后的濾紙包放入100 mL的錐形瓶中,加入50 mL的80%乙醇溶液,封上封口膜,在75 ℃的條件下恒溫水浴提取2 h,其間超聲3~5次,到時(shí)間后將燒瓶中的殘余液直接轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中,并用80%乙醇溶液清洗幾遍,清洗濾液也轉(zhuǎn)移至同一個(gè)250 mL容量瓶中。重復(fù)以上步驟進(jìn)行乙醇復(fù)提取。

        1.4.7 轉(zhuǎn)移、定容

        將兩次提取液最終都放置在一起,并按照定容相關(guān)操作用80%乙醇溶液定容至刻度線。期間,定容至250 mL容量瓶約2/3處進(jìn)行充分搖勻,定容結(jié)束后蓋上玻璃塞進(jìn)行上下?lián)u勻,再將玻璃塞旋轉(zhuǎn)180°后再度搖勻,確保溶液的均一性。

        1.5 實(shí)驗(yàn)方法

        1.5.1 上機(jī)前

        用移液管準(zhǔn)確吸取1 mL步驟1.5.7中定容后的溶液至玻璃試管中,加入0.5 mL的8%香草醛溶液,再加入5 mL的77%的濃硫酸溶液,充分混勻后60 ℃水浴15 min,緊接著冰水浴10 min。

        1.5.2 上機(jī)測(cè)試

        將步驟1.5.1中冰水浴后的樣品用紫外-可見分光光度計(jì)在533 nm進(jìn)行測(cè)試,記錄下吸光度A。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 提取次數(shù)確定

        在本次實(shí)驗(yàn)中,提取率與提取次數(shù)的關(guān)系如表1所示。

        表1 油茶中茶皂素提取率與提取次數(shù)的關(guān)系表

        假設(shè)在第4次茶皂苷提取完全,在第1~3次的相對(duì)得率分別為76.56%、94.36%、97.32%,出于綠色化學(xué)理念和實(shí)驗(yàn)成本等多方面進(jìn)行綜合考量,提取2次是最佳實(shí)驗(yàn)方案。

        2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作與確定

        選取6支玻璃試管,編號(hào)1、2、3、4、5和6,用移液管分別準(zhǔn)確吸取0.0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL的1 mg·mL-1的茶皂素標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別加入80%乙醇溶液0.8 mL、0.6 mL、0.4 mL、0.2 mL、0.0 mL;再分別加入0.5 mL的8%香草醛溶液,然后再加入5 mL的77%的濃硫酸溶液,充分混勻后60 ℃水浴15 min,緊接著冰水浴10 min。

        最大吸收波長(zhǎng)的選擇:將2、4、6號(hào)管的溶液在400~780 nm,間隔1 nm區(qū)間進(jìn)行光譜掃描,最終確定533 nm為最大吸收波長(zhǎng),即實(shí)驗(yàn)測(cè)定波長(zhǎng)。

        按照以上操作,以吸光度為縱坐標(biāo),以茶皂素濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示,回歸方程為y=0.796 7x-0.004 2,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6。

        圖1 茶皂素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

        2.3 油茶籽仁中茶皂素含量測(cè)定

        測(cè)得樣品濃度分別為16.05%、16.18%、16.14%,平均濃度為16.12%。經(jīng)過(guò)測(cè)定,茶籽含水率為5.73%,則茶皂素的實(shí)際濃度為17.10%。

        2.4 精密度試驗(yàn)

        經(jīng)過(guò)計(jì)算,相關(guān)數(shù)據(jù)相對(duì)平均偏差為0.33%,符合化學(xué)分析相關(guān)要求,即數(shù)據(jù)證明有效。

        2.5 加標(biāo)回收率

        重新選擇6根玻璃試管,分別加入0.0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL樣品,再分別加入0.1 mL的1 mg·mL-1茶皂素標(biāo)準(zhǔn)溶液,用80%乙醇溶液補(bǔ)到1 mL,再加入0.5 mL的8%香草醛溶液,然后再加入5 mL的77%的濃硫酸溶液,充分混勻后60 ℃水浴15 min,緊接著冰水浴10 min。經(jīng)測(cè)定,該方法的加標(biāo)回收率為95.8%~101.3%如表2所示,符合化學(xué)分析相關(guān)要求,即數(shù)據(jù)證明有效。

        表2 加標(biāo)回收率測(cè)試原始數(shù)據(jù)表

        3 結(jié)論

        通過(guò)香草醛-濃硫酸法測(cè)定茶皂素含量,雖然在整個(gè)過(guò)程中會(huì)受到油脂的干擾以及反應(yīng)時(shí)間的影響,但是相對(duì)于HPLC測(cè)定茶皂素來(lái)說(shuō),此方法更為便捷、消耗時(shí)間也更少,不需要進(jìn)行過(guò)多的操作,為后續(xù)的類似實(shí)驗(yàn)處理提供了便捷途徑。

        本方法各項(xiàng)指標(biāo)均符合化學(xué)分析的相關(guān)要求,但由于實(shí)驗(yàn)影響因素較多,所以導(dǎo)致部分細(xì)節(jié)方面有待商榷,在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中,應(yīng)該更加注重一些細(xì)節(jié)性的問題,使油茶果中茶皂素的提取和測(cè)定更加精確。同時(shí),由于茶皂素物質(zhì)組成較為復(fù)雜,導(dǎo)致該實(shí)驗(yàn)不一定是最佳的測(cè)試條件,這也是茶皂素目前為止沒有制定統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的原因之一。對(duì)于茶皂素測(cè)定的進(jìn)一步規(guī)范化,還有待其他學(xué)者的進(jìn)一步深入研學(xué),從而找到一個(gè)公認(rèn)的優(yōu)良方法。

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