勵(lì) 炯,江 海,吳 瓊,扈明潔,趙琪奇,金朦娜,邱紅鈺

(杭州市食品藥品檢驗(yàn)研究院,浙江杭州 310017)

畜禽類(lèi)肉制品是人們蛋白質(zhì)攝入的主要來(lái)源,中國(guó)居民平均每日肉類(lèi)攝入量為50～75 g[1]。畜禽類(lèi)肉制品一般以整只或者切割方式進(jìn)行銷(xiāo)售,消費(fèi)者可以通過(guò)感官進(jìn)行鑒別,但經(jīng)過(guò)粉碎、煙熏、腌制或者制成罐頭等處理的肉制品,會(huì)改變其原有的性狀特征[2],再加上不同肉類(lèi)的價(jià)格差異,一些不法商家就用低經(jīng)濟(jì)價(jià)值肉類(lèi)部分或者全部摻混到高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的肉制品中,通過(guò)添加香精香料或者其他佐料,使得消費(fèi)者只能通過(guò)外包裝的標(biāo)簽信息購(gòu)買(mǎi)其所需的肉制品[3]。2016年,Kane和Hellberg[4]的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),抽查的肉制品中有將近20%的畜禽類(lèi)肉制品所標(biāo)示的成分與實(shí)際檢驗(yàn)結(jié)果不符。其他一些研究也表明有20%～70%的肉制品,包括碎肉、熟肉制品、寵物食品以及肉干,檢驗(yàn)結(jié)果與其所標(biāo)示的肉類(lèi)品種不符合[5-6]。自從出現(xiàn)大規(guī)模的摻假肉制品事件后,歐洲各國(guó)已經(jīng)采取各種積極措施,避免肉類(lèi)摻假事件的發(fā)生,以保障消費(fèi)者的權(quán)益[7]。在美國(guó),雖然各政府部門(mén)嚴(yán)令禁止銷(xiāo)售摻假肉制品,但仍有研究發(fā)現(xiàn)將近有17%的碎肉制品種類(lèi)與標(biāo)簽的標(biāo)示不一致[8-9]。

經(jīng)過(guò)深加工處理的熟肉制品的摻假鑒別,一般采用DNA或者基于蛋白質(zhì)的分子生物學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)[10-12],包括ELISA[13-14]、PCR[15-17]、RFLP[18-19]和DNA測(cè)序[20]等方法。近年來(lái)有研究用質(zhì)譜手段來(lái)分析蛋白質(zhì)和多肽,但是由于質(zhì)譜設(shè)備的昂貴以及操作的復(fù)雜性,并未被廣泛應(yīng)用于肉類(lèi)摻假鑒別中[21-22]。

2003年加拿大生物學(xué)家Paul Hebert首次提出了DNA條形碼的概念,其原理就是利用標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對(duì)較短的DNA片段,這個(gè)片段在物種內(nèi)具有足夠的特異性和種間足夠的多樣性,能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)物種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確識(shí)別和鑒定,類(lèi)似于超市里識(shí)別商品的條形碼[23]。很多研究表明線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I(cytochrome C oxidase subunit I,COI)基因是肉類(lèi)制品DNA條形碼技術(shù)較為理想的目的基因,一般采用全片段DNA條形碼技術(shù)(full-length DNA barcoding)來(lái)對(duì)保存完好的新鮮樣本進(jìn)行鑒別,全片段DNA條形碼技術(shù)是以大約650 bp大小的COI基因片段為基礎(chǔ)來(lái)進(jìn)行鑒定[24]。但是熟肉制品經(jīng)過(guò)高溫、高壓等加工處理,大量的DNA在深加工過(guò)程中會(huì)被降解,導(dǎo)致一些肉罐頭之類(lèi)的肉制品在鑒別過(guò)程中,很難獲得全片段DNA條形碼[25]。2008年Meusnier等[26]報(bào)道了對(duì)DNA小片段的擴(kuò)增的DNA微條形碼技術(shù)(mini-DNA barcoding),設(shè)計(jì)了專(zhuān)門(mén)針對(duì)全片段DNA條形碼中部分小片段DNA的通用型引物。雖然肉類(lèi)的深加工會(huì)導(dǎo)致DNA片段的分解,但是可以利用DNA微條形碼技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)各種熟肉制品的COI基因片段的小片段(100～300 bp)的擴(kuò)增,然后進(jìn)行熟肉制品的肉的種類(lèi)的鑒別。

本文采用基于COI序列的DNA微條形碼技術(shù)(mini-barcoding),通過(guò)優(yōu)化樣品前處理方法,利用通用引物COI-A對(duì)11種熟肉的DNA進(jìn)行擴(kuò)增,將擴(kuò)增后的片段經(jīng)克隆測(cè)序并將結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)Blast比對(duì),成功的對(duì)熟肉制品中11種肉類(lèi)進(jìn)行摻假鑒別研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

研究所用的11種肉類(lèi)(包括豬、牛、羊、雞、鴨、鴿子、馬、驢、鵝、兔、鼠等)為了保證其沒(méi)有摻假,購(gòu)買(mǎi)沒(méi)有加工過(guò)的完整的生鮮肉,作為本研究用的純?nèi)?研究所用的熟肉制品 部分來(lái)自2019年杭州市市場(chǎng)監(jiān)管局監(jiān)督抽樣,部分采購(gòu)于超市,包括牛肉、羊肉、鴿子肉、鵝肉、兔肉等共5種熟肉制品,共計(jì)30批次,其產(chǎn)品包括肉干、肉罐頭、肉串、肉丸、肉醬、肉餡、肉粒等;血液與組織DNA提取試劑盒 德國(guó)QIAGEN公司;PCR產(chǎn)物及DNA片段回收試劑盒、T4連接試劑盒、pGEM-T載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞 天根生化科技有限公司;即用PCR擴(kuò)增試劑 上海生工公司。

高速離心機(jī) 德國(guó)sigma公司;干式恒溫器 杭州奧盛儀器有限公司;Veriti 96孔梯度PCR儀 美國(guó)ABI公司;EYELA FDU-1100真空冷凍干燥器 日本東京理化公司;PowerPac Basic電泳儀 美國(guó)Bio-Rad公司;Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司;NanoDrop 1000微量核酸蛋白測(cè)定儀 美國(guó)Thermo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 生鮮肉:經(jīng)過(guò)高溫煮沸20 min,將煮熟的純?nèi)饬栏珊蠓湃肓侠頇C(jī)粉碎處理后備用。

熟肉制品:取30批次的熟肉制品的肉部分,用料理機(jī)處理后,將打碎的樣品置于250 mL燒杯中,加入150 mL去離子水,超聲處理30 min,去掉水溶液,肉沫殘?jiān)鼈溆?。將?jīng)料理機(jī)粉碎處理后的11種純熟肉以及30批次經(jīng)處理的殘?jiān)饽庞?40 ℃冰箱進(jìn)行預(yù)冷4 h,將預(yù)冷后的樣品放在真空冷凍干燥箱中,在真空度低于1×10-4Pa,溫度-50 ℃條件下真空冷凍干燥24 h,真空冷凍干燥后的樣品經(jīng)中藥粉碎機(jī)粉碎后,置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA提取 本文采用DNeasy血液與組織提取試劑盒對(duì)經(jīng)1.2.1預(yù)處理的熟肉制品進(jìn)行DNA提取和純化。取真空冷凍干燥后的樣品粉末0.5 g置于10 mL離心管中,加入2 mL ATL緩沖溶液和200 μL蛋白酶K,漩渦振蕩30 s,經(jīng)56 ℃裂解3 h,每隔30 min進(jìn)行漩渦振蕩一次。取裂解液250 μL上柱,DNA經(jīng)AW1和AW2緩沖液洗柱膜后,用37 ℃預(yù)熱的AE緩沖液洗脫DNA,并將其儲(chǔ)存在-20 ℃。同時(shí)做試劑空白。

凍融作用對(duì)土工程性質(zhì)的影響是由于分凝冰的出現(xiàn)改變了土骨架的結(jié)構(gòu)所造成的, 因此影響分凝冰或者分凝勢(shì)的因素也必然影響凍融后土的工程性質(zhì)，如孔隙率和干密度。Chamberlain等[6]認(rèn)為,凍融通過(guò)改變土的結(jié)構(gòu)性，如土中產(chǎn)生大孔隙、縱向微裂隙等, 從而使其垂直方向的滲透性增大。反復(fù)凍融不僅破壞了土顆粒間的聯(lián)結(jié)力, 同時(shí)使土顆粒得以重新排列。目前，廣泛認(rèn)為凍融循環(huán)可以從多方面改變土的工程性狀,而這些都是通過(guò)改變土的結(jié)構(gòu)性實(shí)現(xiàn)的。一些研究還發(fā)現(xiàn)土的滲透性和密度經(jīng)3～5次凍融循環(huán)后趨于穩(wěn)定[1，6-7]。

1.2.3 COI基因的擴(kuò)增 本文選用王爽等[27]公開(kāi)發(fā)表的一對(duì)引物(COI-A,詳細(xì)序列見(jiàn)表4),引物上連接M13,引物合成由杭州擎科生物技術(shù)有限公司完成。

從每批樣品中提取的DNA模板進(jìn)行微型片段的PCR擴(kuò)增。每個(gè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)管包含以下試劑(25 μL體系):12.5 μL即用PCR擴(kuò)增試劑,9.5 μL ddH2O,0.5 μL 10 μmol/L正向引物,0.5 μL 10 μmol/L反向引物,2 μL DNA模板。DNA微條形碼片段擴(kuò)增程序:95 ℃ 2 min;95 ℃ 1 min,46 ℃ 1 min,72 ℃ 30 s,循環(huán)5次;95 ℃ 1 min,53 ℃ 1 min,72 ℃ 30 s,循環(huán)35次;最后72 ℃保持10 min。將擴(kuò)增片段儲(chǔ)存于-20 ℃。

1.2.4 PCR擴(kuò)增片段的確認(rèn)及DNA測(cè)序 采用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離進(jìn)行電泳PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,將所需的目標(biāo)片段經(jīng)切膠回收純化后,送公司(杭州擎科生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序 PCR產(chǎn)物中挑選不同陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序分析。純化后的PCR產(chǎn)物與pGEM-T載體連接后,導(dǎo)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞。36 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h,經(jīng)過(guò)藍(lán)-白篩選后,挑取10個(gè)不同的白色菌落接種到LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜(36 ℃,150 r/min搖床),取菌液1 mL提取質(zhì)粒DNA,送杭州擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.6 測(cè)序結(jié)果分析 將1.2.3和1.2.4所得的測(cè)序結(jié)果經(jīng)刪除兩端引物和質(zhì)粒序列后,提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì),同時(shí)利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)樣品的COI序列進(jìn)行鑒定和相似度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品預(yù)處理方式的選擇

肉摻假樣品的前處理方式非常關(guān)鍵,特別是混合預(yù)處理,如果處理方式選擇不當(dāng),會(huì)引起漏檢或者誤檢,所以選擇一種能使所得樣品具有可靠性和代表性的預(yù)處理方式非常重要。一般的預(yù)處理方式是用料理機(jī)或者粉碎機(jī),將樣品打碎混合均一,或者采用液氮研磨法進(jìn)行處理,本文采用真空冷凍干燥法,即取200 g的樣品組織,進(jìn)行冷凍干燥,將干燥后的樣品經(jīng)粉碎機(jī)粉碎均勻。本文采用牛肉摻假豬肉模式(其中豬肉的摻假比例為10%,經(jīng)煮沸20 min處理),對(duì)料理機(jī)粉碎處理、液氮研磨法以及真空冷凍干燥法三種預(yù)處理方式進(jìn)行可靠性考察,各選用20份摻假樣品,每份樣品取0.5 g,分別經(jīng)上述三種預(yù)處理方式進(jìn)行處理后,進(jìn)行摻假檢測(cè),結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 3種預(yù)處理方式對(duì)牛肉摻假 豬肉模式(10%)的檢出情況Table 1 Detection of beef adulterated pork model(10%)by three pretreatment methods

從表1可以看出,三種預(yù)處理方式中,真空冷凍干燥法的可靠性最高,在20份摻假模式中均檢出豬肉成分;而料理機(jī)粉碎處理的可靠性最低,檢出率僅為25%,說(shuō)明該預(yù)處理方式?jīng)]有把樣品充分混勻;而液氮研磨法,其檢出率只有60%,經(jīng)液氮研磨后的樣品,雖然已經(jīng)粉碎,但是還是含有一定量的水分,造成樣品的不均一性。所以本文采用真空冷凍干燥法作為熟肉制品中摻假鑒定的預(yù)處理方式。

2.2 DNA提取方式的選擇

樣品取樣的可靠性和代表性在熟肉制品摻假檢測(cè)中也非常關(guān)鍵,其中如果樣品取樣量太少,代表性不足,也會(huì)引起漏檢,并且在肉制品加工過(guò)程中,設(shè)備中殘留的上一批次的其他肉類(lèi)會(huì)帶入下面一批次的肉制品中,沒(méi)有代表性的取樣也會(huì)引起實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤判。DNeasy血液與組織提取試劑盒建議取樣量為10～25 mg,但這個(gè)取樣量是針對(duì)純的樣品,如果要提取摻混樣品,顯然這個(gè)取樣量太小。本文采用牛肉摻假豬肉模式(其中豬肉的摻假比例為10%,經(jīng)開(kāi)水煮沸20 min),對(duì)摻假樣品的取樣量的可靠性進(jìn)行研究。樣品經(jīng)真空冷凍干燥處理后,取樣品粉末分別為25 mg、0.1 g和0.5 g,分別取20份,經(jīng)過(guò)前處理和檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2,當(dāng)取樣量為25 mg時(shí),陽(yáng)性檢出率只有45%,但取樣量為0.1 g時(shí),檢出率提高至85%,但還是會(huì)有漏檢的比例,所以當(dāng)取樣量增至0.5 g時(shí),檢出率達(dá)到100%。所以本文最終選取樣量0.5 g對(duì)肉制品樣品DNA進(jìn)行提取。

表2 3種取樣量對(duì)牛肉摻假豬肉模式(10%)的檢出情況Table 2 Detection of beef adulterated pork model(10%)by three sample weights

表3 11種純的熟肉DNA提取純度Table 3 Purification of 11 cooked samples found to contain one species

2.3 DNA微條形碼序列片段的擴(kuò)增條件優(yōu)化

通過(guò)查閱文獻(xiàn),參考了三對(duì)通用引物COI-A,COI-B和COI-C(具體引物序列詳見(jiàn)表4),并分別考察了三對(duì)通用引物對(duì)11種熟肉的擴(kuò)增效率。11種經(jīng)煮沸處理的肉DNA經(jīng)柱膜法提取后,分別加入三對(duì)通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),通用引物COI-B雖然能擴(kuò)增出大部分的熟肉類(lèi)的DNA,但是雞肉和鼠肉的條帶非常淺,擴(kuò)增效率非常低;而通用引物COI-C在熟羊肉、馬肉和驢肉三種肉DNA擴(kuò)增失敗,沒(méi)有條帶;而引物COI-A擴(kuò)增目標(biāo)片段為130 bp左右,能成功擴(kuò)增出11種熟肉的微條形碼DNA片段,三種引物的擴(kuò)增結(jié)果圖詳見(jiàn)圖1。所以本文最終采用COI-A作為熟肉制品中11種肉摻混研究的通用引物。

圖1 11種純的熟肉DNA微條形碼的PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 Electrophoresis images of DNA mini-barcoding fragments amplified by PCR from 11 species of cooked meat 注:A:COI-A;B:COI-B;C:COI-C;M:Marker:100～600 bp;0:陰性對(duì)照;1:PCR產(chǎn)物(豬);2:PCR產(chǎn)物(牛);3:PCR產(chǎn)物(羊);4:PCR產(chǎn)物(鴨);5:PCR產(chǎn)物(雞);6:PCR產(chǎn)物(馬);7:PCR產(chǎn)物(鴿子);8:PCR產(chǎn)物(驢);9:PCR產(chǎn)物(鵝);10:PCR產(chǎn)物(兔);11:PCR產(chǎn)物(鼠)。

確定11種熟肉DNA微條形碼序列擴(kuò)增用的通用引物之后,本文對(duì)PCR的擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序進(jìn)行優(yōu)化。本文的目的是在高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的肉類(lèi)(牛、羊、鴿子、鵝、兔等)中檢出摻假的低經(jīng)濟(jì)價(jià)值的肉類(lèi)(豬、雞、鴨、馬、驢、鼠等),所以擴(kuò)增條件優(yōu)化的目的是:在該擴(kuò)增條件下,使低經(jīng)濟(jì)價(jià)值肉類(lèi)的擴(kuò)增效率相對(duì)較高,而高經(jīng)濟(jì)價(jià)值肉類(lèi)的擴(kuò)增效率相對(duì)低,這樣有利于提高檢測(cè)靈敏度。

在PCR擴(kuò)增體系中,DNA模板的濃度會(huì)影響擴(kuò)增效率,濃度過(guò)高過(guò)低均會(huì)降低其效率,在25 μL擴(kuò)增體系中,本文考察DNA模板的不同使用量(1、2、3 μL),當(dāng)DNA模板的加入量為2 μL時(shí),11種熟肉的DNA條帶均比較明顯,而且低經(jīng)濟(jì)價(jià)值的肉類(lèi)(豬、雞、鴨、馬、驢、鼠等)的條帶比高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的肉類(lèi)(牛、羊、鴿子、鵝、兔等)的條帶明顯,擴(kuò)增效率高。

PCR擴(kuò)增程序中的退火溫度對(duì)DNA微條形碼序列的擴(kuò)增效率影響非常大,本文考察了三個(gè)退火溫度(50、53以及57 ℃)對(duì)11種熟肉的DNA微條形碼序列的擴(kuò)增效率,結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)退火溫度為53 ℃時(shí),11種熟肉的擴(kuò)增效率較好,電泳跑膠條帶較明顯,低經(jīng)濟(jì)價(jià)值的肉類(lèi)(豬、雞、鴨、馬、驢、鼠等)的條帶比高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的肉類(lèi)(牛、羊、鴿子、鵝、兔等)的條帶明顯,擴(kuò)增效率高,能滿(mǎn)足本研究摻假模式的建立以及目標(biāo)摻假肉類(lèi)的檢測(cè),擴(kuò)增產(chǎn)物電泳跑膠結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1A中可以看出,11種肉在100～200 bp之間均有一條較明顯的擴(kuò)增條帶。然后將11種肉的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生物公司進(jìn)行克隆測(cè)序,測(cè)序結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 11種純的熟肉DNA微條形碼檢測(cè)結(jié)果Table 5 DNA mini-barcoding results for 11 cooked samples found to contain one species

2.4 熟肉摻假模式建立

本研究主要設(shè)定兩種肉的摻假模式,采用高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的肉類(lèi)(牛、羊、鴿子、鵝、兔)與低經(jīng)濟(jì)價(jià)值肉類(lèi)(豬、雞、鴨、馬、驢、鼠)的摻混模式,具體見(jiàn)表6。

表6 熟肉類(lèi)摻假模式Table 6 Cooked meat adulteration model

本文考察了5種高經(jīng)濟(jì)價(jià)值熟肉類(lèi)的摻假的可能性,一共建立18個(gè)摻假模式,然后分別加入5%、10%、15%和20%的摻假比例來(lái)考察本方法的最低檢出比例(檢測(cè)靈敏度),結(jié)果發(fā)現(xiàn),本方法在牛肉和羊肉的熟肉制品中的摻假的檢出靈敏度較高,除了雞肉,其他5種摻假肉類(lèi)的檢出靈敏度為5%,牛肉和羊肉中的雞肉摻假的最低檢出比例為10%;而鴿子肉、鵝肉、兔肉的摻假模式中,各種肉類(lèi)的最低檢出比例均為10%,本方法能滿(mǎn)足日常的檢測(cè)要求。

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

熟肉制品加工過(guò)程中,經(jīng)過(guò)粉碎、煙熏、腌制或者制成罐頭食品等處理,可能會(huì)加入高含量的食用油和鹽,會(huì)改變?cè)械男誀钜约案泄偬卣?除此之外,可能會(huì)加入一些香精香料色素等添加劑,以來(lái)掩飾其摻入的其他低經(jīng)濟(jì)價(jià)值的肉類(lèi)。按照本文建立的方法,對(duì)30批次熟肉制品進(jìn)行摻假鑒別,具體結(jié)果詳見(jiàn)表7。

表7 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果Table 7 Results of samples

本文利用建立的DNA微條形碼技術(shù),對(duì)30批次的高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的熟肉制品進(jìn)行摻假鑒定,其中包括18批次的牛肉制品、8批次的羊肉制品、2批次的兔肉制品、1批次的鴿子肉制品和1批次的鵝肉制品。樣品經(jīng)DNA提取和擴(kuò)增,除了2批次的牛肉丸和2批次的羊肉丸,經(jīng)凝膠電泳分離后均能得到清晰的條帶,4個(gè)批次的肉丸沒(méi)有條帶,未檢出肉或者羊肉成分。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生物公司進(jìn)行克隆測(cè)序,結(jié)果發(fā)現(xiàn)1批次的牛肉干、1批次的牛肉串、1批次的牛肉醬以及1批次的羊肉串均檢出鴨肉成分,而1批次的牛肉罐頭、2批次的牛肉餅的餡料均檢出豬肉成分。18批次牛肉制品中,有6批次為摻假豬肉或者鴨肉成分,2批次為未檢出牛肉成分,不合格率為44%;8批次的羊肉制品中,有一批次檢出鴨肉成分,2批次未檢出羊肉成分,不合格率為38%;2批次的兔肉制品、1批次的鴿子肉制品以及1批次的鵝肉制品均未檢測(cè)出摻假肉類(lèi);30批次的熟肉制品中,一共有7批次有摻假情況,4批次沒(méi)有添加其所宣稱(chēng)的肉類(lèi),不合格率為37%。同時(shí),為了驗(yàn)證本檢測(cè)方法的可靠性,對(duì)上述7批次的摻假樣品和4批次的肉丸產(chǎn)品采用農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)NY/T 3309-2018《肉類(lèi)源性成分鑒定 實(shí)時(shí)熒光定性PCR法》進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果與本方法一致。從上述結(jié)果可以看到,兩類(lèi)高經(jīng)濟(jì)價(jià)值熟肉制品(牛肉和羊肉)的摻假率比較高,會(huì)摻入豬肉成分或鴨肉成分,由于在深加工過(guò)程中改變了其原有的肉的感官性狀和添加食用油和鹽等調(diào)料,不法商家還會(huì)加入一些添加劑(色素、香精香料等)等手段來(lái)掩飾摻入的其他低經(jīng)濟(jì)價(jià)值肉類(lèi),消費(fèi)者很難用憑感官來(lái)辨別,也導(dǎo)致市售熟肉制品的摻假率居高不下。

3 結(jié)論

本文建立了基于COI的DNA微條形碼技術(shù)對(duì)熟肉制品中的11種肉摻假鑒定方法,采用真空冷凍干燥技術(shù)對(duì)肉制品進(jìn)行前處理,并優(yōu)化了DNA提取和PCR擴(kuò)增條件。樣品經(jīng)超聲、-40 ℃冰箱進(jìn)行預(yù)冷4 h處理后,于真空度低于1×10-4Pa,溫度-50 ℃條件下真空冷凍干燥24 h。預(yù)處理后的樣品經(jīng)DNeasy血液與組織提取試劑盒提取和純化后的DNA模板,采用引物COI-A 進(jìn)行PCR擴(kuò)增,目標(biāo)擴(kuò)增物經(jīng)切膠純化后進(jìn)行克隆測(cè)序,并將測(cè)序結(jié)果提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)Blast比對(duì)。與其他檢測(cè)技術(shù)相比,本方法更加簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、高效,能夠滿(mǎn)足日常熟肉質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)的需求。