劉 睿,劉欣然,珠 娜,郝云濤,康家偉,毛瑞雪,侯 超,張 黎,楊 嬌,李 勇

(北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生學(xué)院,北京 100191)

酒精會(huì)引起全身多臟器的損傷,誘發(fā)一系列酒源性疾病,其中對(duì)胃腸道的損傷最為直接和嚴(yán)重,此外還是腫瘤、神經(jīng)精神性疾病、糖尿病、高血壓、心血管疾病等多種慢性病的危險(xiǎn)因素。據(jù)統(tǒng)計(jì)酒精已造成了全球3.8%的死亡和4.6%的傷殘調(diào)整壽命年損失,急需引起人們的重視與關(guān)注[1]。作為一種常見(jiàn)的致潰瘍因子,高濃度的乙醇不僅可以直接腐蝕胃粘膜組織,同時(shí)還會(huì)引起大量自由基和炎性介質(zhì)生產(chǎn)與釋放,破壞胃黏膜屏障,引起炎癥滲出、水腫、糜爛、出血等損傷,引起胃潰瘍的產(chǎn)生[2]。酒精性胃潰瘍現(xiàn)已成為臨床上常見(jiàn)疾病,但現(xiàn)有臨床常用治療藥物副作用較多,不宜長(zhǎng)期服用。因此,從天然活性物質(zhì)中尋找安全、有效的胃黏膜保護(hù)劑具有重要的社會(huì)價(jià)值和科研意義。

核桃(JuglansregiaL.)是已知最古老的食物來(lái)源之一,與扁桃、腰果、榛子并列為世界四大干果。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織(Food and Agriculture Organization of United Nations,FAO)數(shù)據(jù)顯示,2017年全世界核桃產(chǎn)量達(dá)382.96萬(wàn)噸,中國(guó)產(chǎn)量192.54萬(wàn)噸,占世界總產(chǎn)量的50.28%,高居首位[3]。核桃具有豐富的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值,古時(shí)即有“萬(wàn)歲子”、“長(zhǎng)壽果”等美譽(yù),被歷代醫(yī)家和養(yǎng)生學(xué)家視為益壽精品,國(guó)外則稱為“二十一世紀(jì)超級(jí)食品”或“營(yíng)養(yǎng)堅(jiān)果”,在國(guó)際食品市場(chǎng)上占有重要地位[4-5]。核桃低聚肽(Walnut oligopeptides,WOPs)是利用生物酶解技術(shù)從核桃中提取的小分子生物活性肽,主要是由分子量很小但活性很高的短肽分子組成。目前研究已證實(shí)WOPs具有提高記憶力[6]、抗輻射[7]、抗疲勞[8]、提高性功能[9]等多種作用。但有關(guān)WOPs對(duì)酒精性胃潰瘍的研究尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道,值得進(jìn)一步探索研究。

因此,本研究在既往研究基礎(chǔ)上,擬采用無(wú)水乙醇誘導(dǎo)的胃潰瘍動(dòng)物模型,探討WOPs對(duì)乙醇誘導(dǎo)的胃潰瘍的保護(hù)及可其能機(jī)制,為WOPs在保健食品及醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雄性SD大鼠(體重200±20 g) 70只,購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(京)2016-0041,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2016-0010;核桃低聚肽(WOPs) 外觀為淡黃色固體粉末,是通過(guò)生物酶解技術(shù)從普通核桃中分離得到的小分子生物活性肽類混合物,購(gòu)自吉林肽谷生物工程有限責(zé)任公司。通過(guò)高效液相色譜法分析WOPs分子量及氨基酸組成,分子量小于1000的低聚肽占86.5%,小于2000的肽類總量占96.5%;無(wú)水乙醇(分析純) 購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司;奧美拉唑腸溶片(批準(zhǔn)文號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字H19990114) 北京太洋藥業(yè)股份有限公司;前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)、一氧化氮(Nitric oxide,NO)、髓過(guò)氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白介素-10(Interleukin-10,IL-10)試劑盒 購(gòu)自北京麥格泰克科技有限公司。

Adventurer TM通用型分析天平 美國(guó)奧豪斯國(guó)際貿(mào)易有限公司;Eppendorf高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)艾本德股份公司;電熱恒溫水浴鍋 北京天林恒泰科技有限公司;Nihon Kohden Celltac 2全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀 日本光電工業(yè)株式會(huì)社;FSH-2A可調(diào)高速電動(dòng)勻漿機(jī) 金壇市金南儀器廠;GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海創(chuàng)奕科教設(shè)備有限公司;FLUOstar Omega多功能酶標(biāo)儀 德國(guó) BMG LABTECH公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及干預(yù) 適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,將大鼠隨機(jī)分為6個(gè)劑量組:正常對(duì)照組,模型對(duì)照組,陽(yáng)性藥物對(duì)照組(奧美拉唑,劑量為20 mg/kg·bw),低、中、高WOPs劑量組(220、440、880 mg/kg·bw),每組10只。WOPs劑量設(shè)計(jì)依據(jù)為課題組前期研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)WOPs以440 mg/kg·bw劑量給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物灌胃干預(yù)時(shí),表現(xiàn)出較好的提高學(xué)習(xí)記憶、抗疲勞和增強(qiáng)免疫力的效果[6,8]。因此,本研究在此基礎(chǔ)上,以440 mg/kg·bw為中間劑量,設(shè)置了低、中、高三個(gè)WOPs劑量組,以進(jìn)一步探索WOPs的最佳干預(yù)劑量。大鼠每日經(jīng)口灌胃干預(yù),正常對(duì)照組和模型對(duì)照組給予蒸餾水,陽(yáng)性藥物對(duì)照組和WOPs劑量組給予相應(yīng)濃度受試物,灌胃量為1 mL/100 g。每周稱重兩次,灌胃干預(yù)時(shí)間為30 d。

1.2.2 模型制備 連續(xù)灌胃30 d后,全部動(dòng)物禁食24 h(不禁水)。給予大鼠無(wú)水乙醇5 mL/kg灌胃,以造成實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍模型,正常對(duì)照組給予等量生理鹽水灌胃。無(wú)水乙醇灌胃1 h后,用乙醚麻醉處死動(dòng)物,股動(dòng)脈采血,快速剖腹取出全胃,進(jìn)行下列指標(biāo)的檢測(cè)。

1.2.3 Guth改良法計(jì)算胃潰瘍指數(shù) 乙醚麻醉處死動(dòng)物后,開腹,取出全胃,沿著胃大彎剪開,冰凍生理鹽水洗凈胃內(nèi)容物,觀察胃黏膜潰瘍發(fā)生情況,并用游標(biāo)卡尺測(cè)量出血點(diǎn)或出血帶的長(zhǎng)度和寬度,釆用Guth改良法[10-11]計(jì)算胃潰瘍指數(shù),計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)如表1所示:

1.2.4 全血血常規(guī)檢測(cè) 快速取全血40 μL,加入提前接好4 mL稀釋液中,吹打均勻,用全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀測(cè)定大鼠血常規(guī)。主要檢測(cè)指標(biāo)包括:白細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、平均紅細(xì)胞體積、平均血紅蛋白量、平均血紅蛋白濃度、血小板計(jì)數(shù)、單核細(xì)胞百分比、淋巴細(xì)胞百分比。

1.2.5 胃組織PGE2、NO、MPO及炎癥因子水平的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取胃組織重量,按照重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入9倍體積勻漿介質(zhì),剪碎組織,冰水浴制備勻漿,3000 r/min,離心10 min,取上清即10%勻漿上清液貯藏于-20 ℃冰箱中。隨后根據(jù)試劑盒說(shuō)明書依次檢測(cè)勻漿中PGE2、NO、MPO的含量。

表1 胃潰瘍指數(shù)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)Table 1 The scoring criteria of gastric ulcer index

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 24.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。連續(xù)變量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,行單因素方差分析,采用LSD法進(jìn)行組間的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn);變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的數(shù)據(jù),采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。確定P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 一般情況

在30 d的試驗(yàn)周期內(nèi),各試驗(yàn)組大鼠外觀體征和行為活動(dòng)、糞便性狀、食量等均未見(jiàn)異常,無(wú)中毒體征及死亡。

表2 WOPs對(duì)大鼠白細(xì)胞和血小板的影響Table 2 Effect of WOPs on white blood cell and platelet of rats

2.2 WOPs對(duì)大鼠胃潰瘍指數(shù)的影響

本研究通過(guò)參考人類常見(jiàn)致胃黏膜損傷因素及發(fā)病機(jī)理,建立了無(wú)水乙醇誘導(dǎo)的胃黏膜損傷模型來(lái)探討WOPs對(duì)胃黏膜損傷性疾病的可能保護(hù)作用。在使用無(wú)水乙醇5 mL/kg灌胃后,各組大鼠胃黏膜均呈現(xiàn)不同程度的損傷,損傷發(fā)生率達(dá)到100%,可判定造模成功。胃損傷指數(shù)如圖1所示,模型對(duì)照組胃潰瘍指數(shù)最高,與模型對(duì)照組相比,WOPs低、中、高劑量組胃潰瘍指數(shù)明顯降低(P<0.05)。陽(yáng)性藥物(奧美拉唑)對(duì)照組的干預(yù)劑量是根據(jù)藥物說(shuō)明書按人推薦服用劑量體重比進(jìn)行轉(zhuǎn)化的,WOPs高劑量組胃潰瘍指數(shù)顯著低于陽(yáng)性藥物對(duì)照組(P<0.05)。以上研究結(jié)果表明WOPs在一定程度上可以改善乙醇引起的胃損傷,對(duì)無(wú)水乙醇誘導(dǎo)的胃潰瘍具有較好的保護(hù)作用。

圖1 WOPs對(duì)無(wú)水乙醇模型大鼠 胃黏膜損傷積分指數(shù)的影響Fig.1 Effect of WOPs on gastric ulcer index in ethanol-treated rats注:*表示各組與正常組相比,差異顯著(P<0.05), #表示各組(除正常對(duì)照組外)與模型組相比, 差異顯著(P<0.05),&表示劑量組與陽(yáng)性藥物 對(duì)照組相比,差異顯著(P<0.05)。

2.3 WOPs對(duì)無(wú)水乙醇誘導(dǎo)胃潰瘍大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響

血常規(guī)是通過(guò)血液細(xì)胞形態(tài)分布及數(shù)量變化,及早發(fā)現(xiàn)或診斷疾病的一種指標(biāo),白細(xì)胞、紅細(xì)胞及血紅蛋白等相關(guān)指標(biāo)是血常規(guī)檢測(cè)的核心內(nèi)容。白細(xì)胞包括中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞,在機(jī)體受到有害因素刺激及機(jī)體出現(xiàn)炎癥等情況下,體內(nèi)白細(xì)胞數(shù)目會(huì)明顯增加[12]。當(dāng)機(jī)體在急性感染、受傷或者其他的原因引起血管破損時(shí),血液血小板含量會(huì)升高,并釋放出促使血管收縮和血液凝固的物質(zhì)。紅細(xì)胞是血液中含量最多的血細(xì)胞,其數(shù)量與形態(tài)直接影響體內(nèi)外氣體交換以及正常機(jī)體免疫功能。血紅蛋白是紅細(xì)胞的主要組成部分,能與氧結(jié)合,運(yùn)輸氧和二氧化碳,在血液氣體運(yùn)輸方面扮演著重要的角色。

2.3.1 WOPs對(duì)大鼠白細(xì)胞和血小板的影響 無(wú)水乙醇模型大鼠血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果結(jié)果如表2所示,模型對(duì)照組大鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)、單核細(xì)胞百分?jǐn)?shù)較正常對(duì)照組顯著升高(P<0.05)。白細(xì)胞計(jì)數(shù)在WOPs中劑量和高劑量組,單核細(xì)胞百分?jǐn)?shù)在陽(yáng)性藥物對(duì)照組和WOPs低、中、高劑量組均顯著低于模型對(duì)照組(P<0.05)。血小板計(jì)數(shù)水平在奧美拉唑組顯著高于其他各組(P<0.05)。淋巴細(xì)胞比例在各組間未觀察到明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。以上研究結(jié)果說(shuō)明無(wú)水乙醇激發(fā)了大鼠體內(nèi)白細(xì)胞的大量產(chǎn)生,而WOPs可以有效對(duì)抗酒精刺激引起的白細(xì)胞水平的升高。

表3 WOPs對(duì)大鼠紅細(xì)胞和血紅蛋白的影響Table 3 Effect of WOPs on red blood cell and hemoglobin of rats

表4 WOPs對(duì)大鼠胃組織PGE2、MPO和NO活性的影響Table 4 Effect of WOPs on the activities of PGE2,MPO,NO of gastric tissues in rats

2.3.2 WOPs對(duì)大鼠紅細(xì)胞和血紅蛋白的影響 如表3所示,陽(yáng)性藥物對(duì)照組紅細(xì)胞計(jì)數(shù)水平高于正常對(duì)照組和模型對(duì)照組(P<0.05);與正常對(duì)照組相比,其它各組的紅細(xì)胞平均體積水平顯著降低(P<0.05);平均紅細(xì)胞血紅蛋白量水平在陽(yáng)性藥物對(duì)照組顯著低于正常對(duì)照組組和模型對(duì)照組(P<0.05),在WOPs高劑量組高于奧美拉唑組(P<0.05);血紅蛋白、平均紅細(xì)胞血紅蛋白濃度在各組間未觀察到明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。陽(yáng)性藥物對(duì)照組紅細(xì)胞計(jì)數(shù)增加,平均血紅蛋白水平下降,這可能與長(zhǎng)期服用該藥物造成的不良反應(yīng)有關(guān),而WOPs干預(yù)則無(wú)此不良反應(yīng)。

2.4 WOPs對(duì)大鼠胃組織PGE2、NO、MPO活性的影響

本研究結(jié)果如表3所示,在無(wú)水乙醇灌胃造模后,與正常對(duì)照組相比,模型對(duì)照組PGE2水平顯著降低,MPO、NO水平升高(P<0.05),這與Saeed等[21]的研究結(jié)果一致。與模型對(duì)照組相比,MPO、NO活性在奧美拉唑組和WOPs各組均顯著下降,PGE2含量顯著增加(P<0.05)。與陽(yáng)性藥物對(duì)照組相比,WOPs各組MPO、NO含量均升高,差異具有顯著性(P<0.05)。以上研究結(jié)果表明WOPs干預(yù)可明顯改善乙醇攝入導(dǎo)致的胃黏膜PGE2合成的減少,抑制中性粒細(xì)胞在胃組織的聚集浸潤(rùn)和iNOS介導(dǎo)的NO的產(chǎn)生,從而發(fā)揮防護(hù)酒精引起的胃潰瘍的作用。

3 結(jié)論

WOPs可顯著降低大鼠胃潰瘍指數(shù),改善血白細(xì)胞水平的異常升高,并能通過(guò)增加胃組織PGE2水平,降低MPO、NO濃度起到對(duì)酒精性胃潰瘍的防護(hù)作用,表明WOPs對(duì)酒精性胃潰瘍的發(fā)生與發(fā)展具有一定的防護(hù)作用,具備被開發(fā)為新型輔助治療酒精性胃損傷功能保健品的潛力,這為WOPs應(yīng)用于胃黏膜損傷性疾病的預(yù)防和臨床輔助治療提供了科研依據(jù)。但目前對(duì)WOPs的研究還處在基礎(chǔ)研究階段,但其胃保護(hù)作用的深層機(jī)制有待進(jìn)一步研究和探討,相應(yīng)的結(jié)果還需要進(jìn)一步的人群實(shí)驗(yàn)與臨床研究去證實(shí)。