王艷鵬， 史磊， 韓雪， 李菁， 李傳印， 張新文， 楊凈思， 姚宇峰， 史荔， 劉舒媛

(中國醫(yī)學科學院 & 北京協(xié)和醫(yī)學院 醫(yī)學生物學研究所， 云南 昆明 650118)

疫苗是預防感染性疾病的最有效手段，但即使是已證實高度有效的傳統(tǒng)疫苗，也很難達到100%的保護效果。以脊髓灰質(zhì)炎疫苗為例，早期的報道顯示，脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗(inactivated poliomyelitis vaccine, IPV)或脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗(oral poliomyelitis vaccine, OPV)全程接種后，保護效果可達到90%以上[1]。而前期開展的IPV+兩價口服脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗(bivalent oral poliovirus vaccine, bOPV)序貫免疫接種臨床研究表明，2劑IPV和1劑bOPV免疫后，脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型抗體陽轉(zhuǎn)率分別為98.9%、79.5%及100%，而在非易感者中，Ⅱ型抗體陽轉(zhuǎn)率僅為39.3%[2]。另一方面，疫苗誘導產(chǎn)生的抗體滴度也顯示出極大的個體差異，可從0～16 384不等[3]。研究發(fā)現(xiàn)，中國和韓國人群接種乙腦減毒活疫苗后，血清保護率可達到94%以上[4-5]，但在印度人群中僅為67.2%[6]。新生兒、嬰幼兒在接種乙肝疫苗后，80%～90%的人可產(chǎn)生抗乙肝表面抗體；而2～5歲兒童中抗體陽轉(zhuǎn)率為91%，成年人中僅為30%～90%[7]。以上研究表明疫苗接種后的抗體反應是多種因素共同作用的結(jié)果，如年齡、性別、人種、疫苗抗原的種類等都可能影響疫苗的免疫效果，尤其是個體的遺傳因素在免疫應答中發(fā)揮著重要作用。一項對雙生子的研究發(fā)現(xiàn)，乙肝、脊髓灰質(zhì)炎、破傷風、白喉疫苗的抗原特異性應答與遺傳因素的關聯(lián)性分別為77%、60%、44%及49%，即60%的脊髓灰質(zhì)炎疫苗所誘導的抗體水平由遺傳因素決定[8]。疫苗接種后，需要經(jīng)主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex, MHC) Ⅰ類或Ⅱ類抗原呈遞通路誘導有效的細胞免疫和體液免疫應答，低相對分子量蛋白酶體(low molecular weight polypeptide, LMP)是Ⅰ類抗原呈遞通路的重要分子之一，又被稱為β蛋白酶體亞單位(proteasome subunit beta, PSMB)，包括LMP2和 LMP7。LMP主要作用是將內(nèi)源性或外源性抗原水解為合適的肽段，隨后抗原肽經(jīng)抗原相關轉(zhuǎn)運體(transporter associated with antigen processing, TAP)轉(zhuǎn)運至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與特異的MHC Ⅰ類分子結(jié)合形成Ⅰ類肽加工復合體(peptide loading complex, PLC)，表達于細胞表面供CD8+T細胞識別，進而啟動免疫應答。研究發(fā)現(xiàn)，敲除LMP2和LMP7基因的小鼠的CD8+T淋巴細胞數(shù)量降低到野生型小鼠的60%～70%，而細胞表面 MHC Ⅰ類分子的表達水平是野生型小鼠的55%～90%[9]。LMP基因位于MHC Ⅱ類基因區(qū)域內(nèi)[10]，其基因多態(tài)性與丙肝、結(jié)核等多種疾病的發(fā)生相關[11]。推測LMP基因變異可能改變LMP結(jié)構(gòu)，從而影響抗原肽的轉(zhuǎn)運以及與MHC Ⅰ類PCL的形成，而導致機體的免疫應答改變，單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNPs)是人類基因組中常見的遺傳變異。本研究選取LMP2基因SNPs 位點rs17587和LMP7基因的SNPs位點 rs2071543進行基因分型，首次開展了LMP基因多態(tài)性與脊髓灰質(zhì)炎疫苗誘導的抗體應答相關性研究，嘗試探討機體遺傳因素在脊髓灰質(zhì)炎疫苗誘導的免疫應答中的可能作用，為疫苗基因組學研究奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1研究對象 選取廣西壯族自治區(qū)357名2～3月齡健康未接種過脊髓灰質(zhì)炎疫苗的嬰幼兒進行研究，所有個體在接種前28 d內(nèi)均無其它疫苗接種史，并取得監(jiān)護人知情同意。

1.1.2主要儀器和試劑 QIAamp全血基因組 DNA 提取試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit，QIAGENE公司，德國)，基因分型試劑(TaqMan Genotyping Master Mix，ABI公司，美國)，TaqMan探針分型試劑盒(rs17587探針試劑盒編號為C___8849004_1_，rs2071543探針試劑盒編號為C__15869253_10，ABI公司，美國)，ND-2000微量紫外可見分光光度計(Thermo Fisher Scientific公司，美國)，QuantStudio 6實時熒光定量PCR儀(ABI公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1疫苗接種和樣本收集 采用0、1及2月齡免疫程序，對研究個體接種2劑IPV和1劑bOPV。免疫前和3針免疫后第28天采集空腹靜脈血2.5 mL，3 000 r/min離心5 min分離血清，-20 ℃保存供抗體檢測用；同時采集空腹靜脈血5 mL，EDTA 抗凝，供DNA提取用。

1.2.2中和抗體檢測 采用微量中和試驗檢測脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型中和抗體滴度，計算抗體陽轉(zhuǎn)率和中和抗體幾何平均滴度(geometric mean titer, GMT)，中和抗體效價經(jīng)log2轉(zhuǎn)換后進行分析比對。

1.2.3DNA提取 采用DNA提取試劑盒提取外周血基因組DNA。使用超微量紫外可見分光光度計進行DNA濃度和純度檢測后，-80 ℃保存。

1.2.4LMP基因SNPs分型 采用TaqMan探針基因分型法對LMP2基因的SNPs位點rs17587(G>A)和LMP7基因的SNPs位點rs2071543(G>T)的進行基因分型(位點信息見表1)。PCR反應體積為5 μL，包括Mix 2.5 μL、雙蒸水 1.25 μL、引物0.25 μL、DNA樣本1 μL，反應條件為95 ℃預變性10 min，92 ℃變性15 s、60 ℃退火延伸1 min，共40個循環(huán)，最后40 ℃長延伸5 min。使用TaqMan Genotyper Software軟件對結(jié)果進行分析，選取每個位點不同基因型的樣本進行測序驗證。

表1 LMP基因2個SNPs位點的相關信息

1.3 統(tǒng)計學方法

使用PLINK軟件(Shaun Purcell研發(fā), 1.9版本)進行樣本哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinbergequilibrium)檢驗，計算每個SNPs位點的等位基因和基因型頻率。采用GraphPad Prism 7軟件(Graphpad公司, 7.0版本)進行統(tǒng)計學分析，采用unpairedttest分析性別及等位基因間脊髓灰質(zhì)炎病毒中和抗體GMT水平差異，采用One-way ANOVA分析基因型間脊髓灰質(zhì)炎病毒中和抗體GMT水平差異。每個SNPs的統(tǒng)計學差異均采用Bonferroni校正，當統(tǒng)計學結(jié)果中P<0.025(0.05/n,n=2)，說明差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象基本情況

本研究共選取357名嬰幼兒，其中男197例、女160例，3種型別的脊髓灰質(zhì)炎病毒中和抗體GMT水平在男女嬰幼兒間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同性別嬰幼兒的3種型別的脊髓灰質(zhì)炎病毒中和抗體GMT水平比較

2.2 樣本的代表性檢驗

結(jié)果顯示， rs17587位點(P=0.202)和rs2071543位點(P=0.259)的基因型頻率在人群中的分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)，表明所選取的樣本具有群體代表性。

2.3 不同脊髓灰質(zhì)炎病毒血清型、不同等位基因嬰幼兒中和抗體GMT水平

結(jié)果顯示，攜帶rs17587-A等位基因個體的脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型中和抗體GMT水平與攜帶G等位基因個體的中和抗體GMT水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；攜帶rs2071543-G等位基因個體的脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型中和抗體GMT水平與攜帶T等位基因的中和抗體GMT水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 不同脊髓灰質(zhì)炎病毒血清型、不同等位基因嬰幼兒中和抗體GMT水平比較

2.4 不同脊髓灰質(zhì)炎病毒血清型、不同基因型嬰幼兒中和抗體GMT水平

結(jié)果顯示，LMP基因rs17587-AA基因型攜帶者的脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅱ型中和抗體GMT高于AG和GG基因型攜帶者(P<0.05)，但經(jīng)Bonferroni校正后，LMP基因rs17587-AA基因型攜帶者的脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅱ型中和抗體GMT高于GG基因型攜帶者，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；rs17587位點和rs2071543位點不同基因型攜帶者的脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅰ、Ⅲ型中和抗體GMT水比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 不同脊髓灰質(zhì)炎病毒血清型、不同基因型嬰幼兒中和抗體GMT水平

2.5 LMP基因2個SNPs位點與脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅱ型抗體陽轉(zhuǎn)的相關性

脊髓灰質(zhì)炎疫苗基礎免疫1月后，脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅰ、Ⅲ型抗體完全陽轉(zhuǎn)，而Ⅱ型陽轉(zhuǎn)率為79.8%。因此，將樣本分為Ⅱ型抗體陽轉(zhuǎn)組[包括免疫前血清Ⅱ型脊髓灰質(zhì)炎病毒中和抗體陰性(血清脊髓灰質(zhì)炎病毒中和抗體效價<1 ∶8)，免疫后血清脊髓灰質(zhì)炎病毒中和抗體為陽性(血清脊髓灰質(zhì)炎病毒中和抗體效價≥1 ∶8)的個體，以及免疫前血清Ⅱ型脊髓灰質(zhì)炎病毒中和抗體陽性且免疫后血清中和抗體≥4倍增長的個體]和非陽轉(zhuǎn)組(包括免疫前Ⅱ型脊髓灰質(zhì)炎病毒中和抗體為陰性且免疫后血清中和抗體效價仍為陰性的個體以及免疫前血清Ⅱ型脊髓灰質(zhì)炎病毒中和抗體為陽性且免疫后血清中和抗體效價<4倍增長的個體)，比較2組間2個SNPs位點的等位基因及基因型頻率。結(jié)果顯示，不同等位基因以及基因型攜帶者的脊髓灰質(zhì)炎病毒中和抗體陽轉(zhuǎn)率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表5。

表5 Ⅱ型脊髓灰質(zhì)炎病毒抗體陽轉(zhuǎn)率與LMP基因多態(tài)性的相關性

2.6 LMP基因SNPs與免疫前脊髓灰質(zhì)炎病毒抗體水平的關系

前期研究發(fā)現(xiàn)，母傳抗體可影響脊髓灰質(zhì)炎疫苗接種后的抗體應答。脊髓灰質(zhì)炎疫苗接種后，脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅱ型抗體在接種1劑sIPV+2劑bOPV組、接種2劑sIPV+1劑bOPV組，Ⅲ型抗體在接種2劑sIPV+1劑tOPV組易感者(免疫前抗體陰性)和非易感者(免疫前抗體陽性)中差異具有統(tǒng)計學意義。因此，本研究將樣本分成免疫前陰性組和免疫前陽性組，比較其等位基因及基因型頻率在2組間的分布差異。結(jié)果顯示，LMP基因SNPs位點rs17587和rs2071543的等位基因及基因型頻率在2組中比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表6。

表6 免疫前抗體陽性組和陰性組LMP基因2個SNPs位點的等位基因和基因型頻率比較

3 討論

MHC在疫苗誘導的抗體應答中起到了重要的作用。研究表明MHC與乙肝疫苗反應的相關性占據(jù)了所有遺傳因素的40%[12]；而在風疹疫苗誘導的抗體反應中則占據(jù)了20%[13]。此外，MHC等位基因的多態(tài)性影響著麻腮風疫苗、乙腦疫苗、乙肝疫苗等誘導的抗體水平[13-16]。除MHC外，MHC區(qū)域的多個SNPs多態(tài)性也與乙肝、肺炎球菌等疫苗接種后特異性抗體及血清IgG、IgM水平有關[9]。

作為MHC Ⅰ類抗原呈遞基因通路的重要組成部分，LMP2和LMP7在MHC Ⅰ類CD8+T細胞通路的內(nèi)源性和外源性抗原提呈中發(fā)揮著重要的作用[17]。在疫苗免疫應答過程中，機體抗原遞呈系統(tǒng)基因的多態(tài)性可通過影響疫苗相關抗原的提呈，進而影響機體的免疫應答，形成不同的抗體反應。多項研究表明抗原通路基因的多態(tài)性會對疫苗的抗體應答產(chǎn)生影響[18-19]。

LMP2基因rs17587位點G>A的改變可導致精氨酸變成組氨酸，此改變會對蛋白酶體活性有影響，其中GG基因型與GA基因型相比，蛋白酶體活性增加。例如，Mishto等[20]發(fā)現(xiàn)rs17587會影響腦組織中的蛋白酶體活性。據(jù)報道，rs17587位點的A等位基因可能與更高的宮頸癌風險相關(P=0.001)[21]。LMP2基因的多態(tài)性與非小細胞肺癌的關聯(lián)性研究中發(fā)現(xiàn)，rs17587單倍型rs1351383-rs17587-rs2127675 G-C-G在非小細胞肺癌組中以及肺腺癌分層組中的分布顯著高于對照組[22]。本研究中，rs17587-AA基因型攜帶者的脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅱ型中和抗體GMT水平高于rs17587-AG基因型攜帶者(P=0.023，Padj=0.046)，但rs17587-AA與rs17587-GG的基因型比較差異無統(tǒng)計學意義。在脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅱ型抗體陽轉(zhuǎn)率的分析中也未見差異。提示rs17587的多態(tài)性可能不是影響脊髓灰質(zhì)炎疫苗抗體應答的遺傳因素。

LMP7基因rs2071543位點G>T的改變同樣導致了氨基酸的變化，即甘氨酸變成賴氨酸。有研究表明，LMP7中的rs2071543位點的氨基酸的變化會導致非極性氨基酸取代了帶電荷的急性氨基酸，可能會造成LMP功能的改變，改變蛋白酶體的活性，影響降解效率[23]。在一項關于宮頸癌的研究中發(fā)現(xiàn)，rs2071543位點宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變和宮頸癌有關[21]。在一項薈萃分析中發(fā)現(xiàn)，rs2071543位點TT基因型增加了患乳腺癌、結(jié)直腸癌、膠質(zhì)母細胞瘤、胰腺癌以及黑色素瘤的風險，攜帶TT基因型的個體患癌癥的風險是攜帶GG基因型個體的2倍[24]。但在本研究中并未發(fā)現(xiàn)攜帶rs2071543不同等位基因或基因型的個體在脊髓灰質(zhì)炎疫苗免疫后脊髓灰質(zhì)炎病毒3種型別的中和抗體GMT水平的差異有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

母傳抗體對疫苗免疫應答的干預是疫苗接種的常見問題。高雅楠等[25]發(fā)現(xiàn)，免疫前抗體水平可干擾IPV接種后Ⅰ、Ⅱ型抗體的應答，免疫前陰性者的應答效果優(yōu)于免疫前陽性者。在IPV、OPV序貫免疫中也發(fā)現(xiàn)了同樣現(xiàn)象[18]。本研究對LMP基因的關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，rs17587和rs2071543位點的等位基因頻率和基因型頻率在脊髓灰質(zhì)炎病毒3種型別的免疫前抗體陰性組和免疫前抗體陽性組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示LMP基因多態(tài)性與脊髓灰質(zhì)炎疫苗誘導的抗體應答不相關。

綜上，LMP基因雖然在MHC Ⅰ類抗原呈遞中發(fā)揮重要作用，但rs2071543位點和rs17587位點的多態(tài)性與脊髓灰質(zhì)炎疫苗免疫后抗體應答無相關性，不是影響脊髓灰質(zhì)炎疫苗誘導的抗體應答的遺傳因素。