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        結(jié)直腸癌患者外周血CTC改變與預后的關系*

        2021-06-16 02:31:12郭志娟吉茹王振飛孟丹陽王金花
        貴州醫(yī)科大學學報 2021年5期
        關鍵詞:基線結(jié)腸癌外周血

        郭志娟, 吉茹, 王振飛, 孟丹陽, 王金花

        (內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬人民醫(yī)院 病理科, 內(nèi)蒙古 呼和浩特市 010010)

        隨著手術、放療、化療及靶向治療的應用,結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)患者的5年、10年生存率達到了65%和58%,但仍然導致腫瘤死亡的第三大癌癥[1-2]。復發(fā)、轉(zhuǎn)移依然是CRC患者死亡的首要原因,因此CRC治療的關鍵是找到能早期發(fā)現(xiàn)疾病及監(jiān)測疾病病情進展的方法。循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells,CTC)是在腫瘤形成和進展過程中從原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落進入血液循環(huán)的腫瘤細胞,能夠真實反映腫瘤的情況,對研究腫瘤轉(zhuǎn)移機制、判斷臨床治療效果、監(jiān)測腫瘤復發(fā)有重要作用[3]。有研究證實,腫瘤細胞在腫瘤形成早期甚至在原發(fā)病灶形成之前就播散到循環(huán)系統(tǒng)中,并先于原發(fā)腫瘤進化成轉(zhuǎn)移病灶,而且這種腫瘤細胞的播散及進化可能貫穿于腫瘤進展的整個過程[3]。本研究以86例接受手術治療的CRC患者為研究對象,采用CyttelTM擴增型CTC陰性富集技術分別于術前1天、術后第7及30天時進行CTC檢查,使用χ2檢驗和Spearman相關性分析CTC與其他腫瘤標志物的相關性,采用KaPlan-Meier曲線及Cox比例風險模型分析患者的總體生存情況,探討外周血CTC在CRC患者中的變化及其對預后的影響。

        1 對象與方法

        1.1 研究對象

        本研究納入2018年1月—2019年12月在腹部外科接受手術的CRC患者86例,其中男45例、女41例,年齡(54.45±12.69)歲。納入標準: (1)符合2007年世界衛(wèi)生組織關于CRC診斷標準[4];(2)所有原發(fā)病灶均為CRC;(3)均行腫瘤根治切除術治療、且術后經(jīng)病理學檢查確診。排除標準: (1)存在肝腎功能異常以及心、腦和血液系統(tǒng)等疾病患者;(2)存在其他系統(tǒng)惡性腫瘤患者;(3)臨床資料不完整者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準同意(KY201903),患者或家屬均知情同意并簽署知情同意書。

        1.2 方法

        1.2.1標本采集 于術前1 d及術后第7及30天時,采集受檢患者外周血5.0 mL,采用檸檬酸葡萄糖(ACD)抗凝,室溫保存,24 h內(nèi)送檢。

        1.2.2細胞富集 取上述全血加入50 mL離心管,補充緩沖液至45 mL,離心、棄上清液,輕搖混勻沉淀細胞;再加CS2至45 mL,混勻后離心、棄上清液。吸取適量磁微?;鞈乙褐? mL EP管,置于磁力架上,待溶液澄清后、吸棄溶液,反復洗滌3次,用CS1重懸磁微粒補至原體積。取已經(jīng)預裝3 mL CS3的50 mL離心管,將上述液體輕輕疊加至CS3表層,配平后離心。吸取中間層全部液體,轉(zhuǎn)移至15 mL離心管,補充CS1,離心、棄上清,反復2次。加入CF1固定液100 μL,輕柔吹打混勻,涂片。

        1.2.3熒光原位雜交技術(fluorescence in situ hybridization,FISH)操作 涂片完全干燥后,取CF2室溫固定8~10 min,小心洗去CF2后放置于已預熱的染色缸中靜置10 min。依次在染色缸Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ中靜置2~5 min,室溫晾干。之后避光條件下操作,加入探針10 μL、蓋片、封片。雜交儀76 ℃變性5 min、37 ℃雜交1.5 h。洗片、洗滌后將抗體加至標本區(qū),濕盒內(nèi)室溫下避光、孵育1~1.5 h。洗片后DAPI復染、蓋片。

        1.2.4CTC診斷 熒光顯微鏡下由2位經(jīng)過專業(yè)培訓檢驗人員進行CTC鑒定及計數(shù)、并拍照。CTC定義為表面磁珠不超過2個,CEP8/7探針≥3個信號,核染陽性(DAPI+),白細胞共同抗原陰性(CD45-)的細胞; CTC數(shù)目≥2,提示患者體內(nèi)存在惡性腫瘤細胞,體內(nèi)懷疑存在惡性腫瘤病灶,存在潛在轉(zhuǎn)移風險或已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移,視為CTC陽性;CTC數(shù)目<2提示本次未檢測到CTC或者CTC水平趨于正常,病灶性質(zhì)為良性傾向,視為CTC陰性。

        1.2.5病理診斷 手術標本由有經(jīng)驗的醫(yī)師取材,脫水、制片后,由2位副主任醫(yī)師及以上診斷醫(yī)師出具診斷報告,按美國癌癥聯(lián)合會(AJCC)和國際抗癌聯(lián)盟(UICC)第8版TNM系統(tǒng)進行分期。

        1.3 觀察指標

        使用χ2檢驗和Spearman法分析CTC檢出率與患者一般臨床特征、腫瘤分化程度、腫瘤病理組織學類型及腫瘤標志物的關系,比較患者3個時間點的外周血CTC計數(shù),比較CTC陽性和CTC陰性患者預后及生存情況。

        1.4 統(tǒng)計學分析

        2 結(jié)果

        2.1 CRC患者一般臨床特征及基線CTC計數(shù)

        86例CRC患者中CTC陽性例數(shù)為55例,檢出率為63.95%,共檢出745個CTC。如表1結(jié)果所示,CTC檢出率與患者TNM分期和分化程度有關(P<0.05),與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床特征無關(P>0.05)。見表1。

        表1 86例CRC患者的一般臨床特征及基線CTC計數(shù)

        2.2 不同分化程度CRC患者的基線CTC計數(shù)

        結(jié)果顯示,與中、低分化組比較,高分化組患者基線CTC陰性患者的比例明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001);中、低分化組患者基線CTC陰性患者的比例比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

        表2 不同分化程度CRC患者的基線CTC計數(shù)比較

        2.3 不同病理組織學類型CRC患者基線CTC計數(shù)

        結(jié)果顯示,不同病理組織學類型的基線CTC計數(shù)陽性與陰性CRC患者比例比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

        表3 不同病理組織學類型CRC患者的基線CTC計數(shù)比較

        2.4 不同腫瘤標志物檢測結(jié)果與CRC患者基線CTC計數(shù)的相關性

        結(jié)果顯示,腫瘤標志物中陽性率最高的為癌胚抗原,達51.16%(44/86),與CTC陽性率的63.95%最為接近,χ2檢驗和SPearman分析顯示,CTC陽性率與癌胚抗原有相關性(P<0.05),與CA199和CA125無明顯相關性(P>0.05)。見表4。

        表4 不同腫瘤標志物檢測結(jié)果與CTC檢測結(jié)果相關性

        2.5 外周血CTC變化

        結(jié)果顯示,CRC患者手術前1 d及手術后第7及30天時的外周血CTC計數(shù)分別為13.34±9.59、9.39±9.39及5.46±6.18;與手術前1 d比較,手術后第7及30天時的外周血CTC計數(shù)降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見圖1。預后分析結(jié)果顯示,CTC陽性組較CTC陰性組患者部分緩解(PR)和穩(wěn)定(SD)比例下降,總生存時間縮短(P<0.05)。

        圖1 CRC患者手術前后的外周血CTC變化

        3 討論

        近年來,大量研究發(fā)現(xiàn),外周血CTC在肺癌、乳腺癌以及CRC等惡性腫瘤的診斷和預后評估中具有重要的作用,具有方便、快捷且創(chuàng)傷低的優(yōu)勢,有極大的臨床應用潛力[5-7]。Aggarwal等[8]通過對50例小細胞肺癌(SCLC)患者行前瞻性研究發(fā)現(xiàn),CTC<50的患者較CTC≥50患者的無進展生存期(PFS)和總生存時間(OS)明顯增長顯著相關,提示CTC與SCLC患者的疾病階段和生存相關,這表明CTC可用作臨床反應的替代生物標志物。Chudasama等[9]研究發(fā)現(xiàn),與低增殖CTC的患者相比,具有高增殖(Ki-67)狀態(tài)的CTC的患者的PFS(P=0.001 1)和總體生存率(P=0.009 5)明顯降低。Adriana等[10]通過利用對行化療治療的結(jié)腸癌患者于化療1周后檢測CTC發(fā)現(xiàn),CTC陽性率與患者預后密切相關,且CTC可作為結(jié)腸癌患者制定個體化治療方案的參考指標。目前,有關CTC的研究主要涉及外周血中的RNA和DNA表達、細胞信號傳導途徑以及血清生物標志物[11-14]。在一些醫(yī)院中已經(jīng)開展了外周血CTC的臨床檢測[15],但是,主要用作對手術及化療進行初步分析和評估的工具[16-18],缺乏較大樣本量的臨床CTC研究,且很少有研究探討外周血CTC數(shù)目與原發(fā)性惡性腫瘤及其病理組織學特征的相關性。

        本研究對于CRC患者手術前CTC的數(shù)目,及其與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小以及化療效果和OS等關系進行了研究,并且比較了手術前以及手術后第7天和30天的CTC數(shù)目。本研究結(jié)果顯示,86例結(jié)腸癌患者中CTC陽性例數(shù)為55例,檢出率為63.95%,共檢出CTC數(shù)745個,其中橫結(jié)腸癌CTC檢出率最高,達100%,且結(jié)腸癌CTC檢出率74.46%(35/47)明顯高于直腸癌51.28%(20/39),這與汪棟等[19]研究報道類似。相關性分析顯示,CTC檢出率與患者TNM分期和分化程度有關(P<0.05),與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、病理組織學類型以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床特征無關(均P>0.05)。復發(fā)轉(zhuǎn)移是導致結(jié)腸癌患者死亡的最主要因素[20-23],因此,作為與轉(zhuǎn)移高度相關的CTC,推測其在預測結(jié)腸癌復發(fā)和轉(zhuǎn)移具有重要的臨床意義。此外,在對CTC檢出率與不同類型腫瘤標志物相關性研究發(fā)現(xiàn),腫瘤標志物中陽性率最高的為癌胚抗原,達51.16%(44/86),與CTC陽性率的63.95%最為接近,且CTC陽性率與癌胚抗原相關性密切(P<0.05),而與CA199和CA125無明顯相關性(P>0.05)。因此,對于結(jié)腸癌患者,可行癌胚抗原和CTC聯(lián)合檢測,以提高預測預后的準確性。

        此外,本研究結(jié)果顯示,與手術前1 d比較,手術后第7天及30天的外周血CTC計數(shù)均明顯降低(P<0.01),提示外周血CTC可以作為評估手術效果和預后的臨床指標。Liu等[24]的一項分析結(jié)果顯示,外周血CTC數(shù)目與腫瘤體積相關。腫瘤體積過小與無法檢測到外周血CTC有關。本研究中的所有患者均接受了腫瘤根治性切除術。絕大多數(shù)腫瘤細胞已經(jīng)被清除,最大限度地減少了CTC從腫瘤原發(fā)灶釋放進入外周血[25]。本研究觀察到的術后第7 天和30天的外周血CTC計數(shù)顯著減少可能可以作為評估手術效果和患者預后的重要指標之一。

        綜上所述,CRC患者外周血中可以檢測到較高的CTC計數(shù)。外周血CTC計數(shù)與CRC的低分化相關,從一定程度上反映了腫瘤的惡性程度。此外,術后第7天和30天外周血CTC計數(shù)顯著降低,提示動態(tài)監(jiān)測CRC患者外周血CTC對于評估治療效果和患者預后具有重要意義,未來還應該進行更大樣本量和長期隨訪,來進一步確定外周血CTC計數(shù)的臨床意義。

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