郭志娟， 吉茹， 王振飛， 孟丹陽(yáng)， 王金花

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院 病理科, 內(nèi)蒙古 呼和浩特市 010010)

隨著手術(shù)、放療、化療及靶向治療的應(yīng)用，結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)患者的5年、10年生存率達(dá)到了65%和58%，但仍然導(dǎo)致腫瘤死亡的第三大癌癥[1-2]。復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移依然是CRC患者死亡的首要原因，因此CRC治療的關(guān)鍵是找到能早期發(fā)現(xiàn)疾病及監(jiān)測(cè)疾病病情進(jìn)展的方法。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTC)是在腫瘤形成和進(jìn)展過程中從原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落進(jìn)入血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，能夠真實(shí)反映腫瘤的情況，對(duì)研究腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制、判斷臨床治療效果、監(jiān)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)有重要作用[3]。有研究證實(shí)，腫瘤細(xì)胞在腫瘤形成早期甚至在原發(fā)病灶形成之前就播散到循環(huán)系統(tǒng)中，并先于原發(fā)腫瘤進(jìn)化成轉(zhuǎn)移病灶，而且這種腫瘤細(xì)胞的播散及進(jìn)化可能貫穿于腫瘤進(jìn)展的整個(gè)過程[3]。本研究以86例接受手術(shù)治療的CRC患者為研究對(duì)象，采用CyttelTM擴(kuò)增型CTC陰性富集技術(shù)分別于術(shù)前1天、術(shù)后第7及30天時(shí)進(jìn)行CTC檢查，使用χ2檢驗(yàn)和Spearman相關(guān)性分析CTC與其他腫瘤標(biāo)志物的相關(guān)性，采用KaPlan-Meier曲線及Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析患者的總體生存情況，探討外周血CTC在CRC患者中的變化及其對(duì)預(yù)后的影響。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究納入2018年1月—2019年12月在腹部外科接受手術(shù)的CRC患者86例，其中男45例、女41例，年齡(54.45±12.69)歲。納入標(biāo)準(zhǔn): (1)符合2007年世界衛(wèi)生組織關(guān)于CRC診斷標(biāo)準(zhǔn)[4];(2)所有原發(fā)病灶均為CRC;(3)均行腫瘤根治切除術(shù)治療、且術(shù)后經(jīng)病理學(xué)檢查確診。排除標(biāo)準(zhǔn): (1)存在肝腎功能異常以及心、腦和血液系統(tǒng)等疾病患者;(2)存在其他系統(tǒng)惡性腫瘤患者;(3)臨床資料不完整者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意(KY201903)，患者或家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1標(biāo)本采集 于術(shù)前1 d及術(shù)后第7及30天時(shí)，采集受檢患者外周血5.0 mL，采用檸檬酸葡萄糖(ACD)抗凝，室溫保存，24 h內(nèi)送檢。

1.2.2細(xì)胞富集 取上述全血加入50 mL離心管，補(bǔ)充緩沖液至45 mL，離心、棄上清液，輕搖混勻沉淀細(xì)胞；再加CS2至45 mL，混勻后離心、棄上清液。吸取適量磁微粒混懸液至2 mL EP管，置于磁力架上，待溶液澄清后、吸棄溶液，反復(fù)洗滌3次，用CS1重懸磁微粒補(bǔ)至原體積。取已經(jīng)預(yù)裝3 mL CS3的50 mL離心管，將上述液體輕輕疊加至CS3表層，配平后離心。吸取中間層全部液體，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，補(bǔ)充CS1，離心、棄上清，反復(fù)2次。加入CF1固定液100 μL，輕柔吹打混勻，涂片。

1.2.3熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization,FISH)操作 涂片完全干燥后，取CF2室溫固定8～10 min，小心洗去CF2后放置于已預(yù)熱的染色缸中靜置10 min。依次在染色缸Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ中靜置2～5 min，室溫晾干。之后避光條件下操作，加入探針10 μL、蓋片、封片。雜交儀76 ℃變性5 min、37 ℃雜交1.5 h。洗片、洗滌后將抗體加至標(biāo)本區(qū)，濕盒內(nèi)室溫下避光、孵育1～1.5 h。洗片后DAPI復(fù)染、蓋片。

1.2.4CTC診斷 熒光顯微鏡下由2位經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)檢驗(yàn)人員進(jìn)行CTC鑒定及計(jì)數(shù)、并拍照。CTC定義為表面磁珠不超過2個(gè)，CEP8/7探針≥3個(gè)信號(hào)，核染陽(yáng)性(DAPI+)，白細(xì)胞共同抗原陰性(CD45-)的細(xì)胞； CTC數(shù)目≥2，提示患者體內(nèi)存在惡性腫瘤細(xì)胞，體內(nèi)懷疑存在惡性腫瘤病灶，存在潛在轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)或已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，視為CTC陽(yáng)性；CTC數(shù)目<2提示本次未檢測(cè)到CTC或者CTC水平趨于正常，病灶性質(zhì)為良性傾向，視為CTC陰性。

1.2.5病理診斷 手術(shù)標(biāo)本由有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師取材，脫水、制片后，由2位副主任醫(yī)師及以上診斷醫(yī)師出具診斷報(bào)告，按美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)(AJCC)和國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)第8版TNM系統(tǒng)進(jìn)行分期。

1.3 觀察指標(biāo)

使用χ2檢驗(yàn)和Spearman法分析CTC檢出率與患者一般臨床特征、腫瘤分化程度、腫瘤病理組織學(xué)類型及腫瘤標(biāo)志物的關(guān)系，比較患者3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的外周血CTC計(jì)數(shù)，比較CTC陽(yáng)性和CTC陰性患者預(yù)后及生存情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CRC患者一般臨床特征及基線CTC計(jì)數(shù)

86例CRC患者中CTC陽(yáng)性例數(shù)為55例，檢出率為63.95%，共檢出745個(gè)CTC。如表1結(jié)果所示，CTC檢出率與患者TNM分期和分化程度有關(guān)(P<0.05)，與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床特征無關(guān)(P>0.05)。見表1。

表1 86例CRC患者的一般臨床特征及基線CTC計(jì)數(shù)

2.2 不同分化程度CRC患者的基線CTC計(jì)數(shù)

結(jié)果顯示，與中、低分化組比較，高分化組患者基線CTC陰性患者的比例明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；中、低分化組患者基線CTC陰性患者的比例比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同分化程度CRC患者的基線CTC計(jì)數(shù)比較

2.3 不同病理組織學(xué)類型CRC患者基線CTC計(jì)數(shù)

結(jié)果顯示，不同病理組織學(xué)類型的基線CTC計(jì)數(shù)陽(yáng)性與陰性CRC患者比例比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 不同病理組織學(xué)類型CRC患者的基線CTC計(jì)數(shù)比較

2.4 不同腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果與CRC患者基線CTC計(jì)數(shù)的相關(guān)性

結(jié)果顯示，腫瘤標(biāo)志物中陽(yáng)性率最高的為癌胚抗原，達(dá)51.16%(44/86)，與CTC陽(yáng)性率的63.95%最為接近，χ2檢驗(yàn)和SPearman分析顯示，CTC陽(yáng)性率與癌胚抗原有相關(guān)性(P<0.05)，與CA199和CA125無明顯相關(guān)性(P>0.05)。見表4。

表4 不同腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果與CTC檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性

2.5 外周血CTC變化

結(jié)果顯示，CRC患者手術(shù)前1 d及手術(shù)后第7及30天時(shí)的外周血CTC計(jì)數(shù)分別為13.34±9.59、9.39±9.39及5.46±6.18；與手術(shù)前1 d比較，手術(shù)后第7及30天時(shí)的外周血CTC計(jì)數(shù)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。預(yù)后分析結(jié)果顯示，CTC陽(yáng)性組較CTC陰性組患者部分緩解(PR)和穩(wěn)定(SD)比例下降，總生存時(shí)間縮短(P<0.05)。

圖1 CRC患者手術(shù)前后的外周血CTC變化

3 討論

近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)，外周血CTC在肺癌、乳腺癌以及CRC等惡性腫瘤的診斷和預(yù)后評(píng)估中具有重要的作用，具有方便、快捷且創(chuàng)傷低的優(yōu)勢(shì)，有極大的臨床應(yīng)用潛力[5-7]。Aggarwal等[8]通過對(duì)50例小細(xì)胞肺癌(SCLC)患者行前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，CTC<50的患者較CTC≥50患者的無進(jìn)展生存期(PFS)和總生存時(shí)間(OS)明顯增長(zhǎng)顯著相關(guān)，提示CTC與SCLC患者的疾病階段和生存相關(guān)，這表明CTC可用作臨床反應(yīng)的替代生物標(biāo)志物。Chudasama等[9]研究發(fā)現(xiàn)，與低增殖CTC的患者相比，具有高增殖(Ki-67)狀態(tài)的CTC的患者的PFS(P=0.001 1)和總體生存率(P=0.009 5)明顯降低。Adriana等[10]通過利用對(duì)行化療治療的結(jié)腸癌患者于化療1周后檢測(cè)CTC發(fā)現(xiàn)，CTC陽(yáng)性率與患者預(yù)后密切相關(guān)，且CTC可作為結(jié)腸癌患者制定個(gè)體化治療方案的參考指標(biāo)。目前，有關(guān)CTC的研究主要涉及外周血中的RNA和DNA表達(dá)、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑以及血清生物標(biāo)志物[11-14]。在一些醫(yī)院中已經(jīng)開展了外周血CTC的臨床檢測(cè)[15]，但是，主要用作對(duì)手術(shù)及化療進(jìn)行初步分析和評(píng)估的工具[16-18]，缺乏較大樣本量的臨床CTC研究，且很少有研究探討外周血CTC數(shù)目與原發(fā)性惡性腫瘤及其病理組織學(xué)特征的相關(guān)性。

本研究對(duì)于CRC患者手術(shù)前CTC的數(shù)目，及其與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小以及化療效果和OS等關(guān)系進(jìn)行了研究，并且比較了手術(shù)前以及手術(shù)后第7天和30天的CTC數(shù)目。本研究結(jié)果顯示，86例結(jié)腸癌患者中CTC陽(yáng)性例數(shù)為55例，檢出率為63.95%，共檢出CTC數(shù)745個(gè)，其中橫結(jié)腸癌CTC檢出率最高，達(dá)100%，且結(jié)腸癌CTC檢出率74.46%(35/47)明顯高于直腸癌51.28%(20/39)，這與汪棟等[19]研究報(bào)道類似。相關(guān)性分析顯示，CTC檢出率與患者TNM分期和分化程度有關(guān)(P<0.05)，與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、病理組織學(xué)類型以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床特征無關(guān)(均P>0.05)。復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致結(jié)腸癌患者死亡的最主要因素[20-23]，因此，作為與轉(zhuǎn)移高度相關(guān)的CTC，推測(cè)其在預(yù)測(cè)結(jié)腸癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移具有重要的臨床意義。此外，在對(duì)CTC檢出率與不同類型腫瘤標(biāo)志物相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤標(biāo)志物中陽(yáng)性率最高的為癌胚抗原，達(dá)51.16%(44/86)，與CTC陽(yáng)性率的63.95%最為接近，且CTC陽(yáng)性率與癌胚抗原相關(guān)性密切(P<0.05)，而與CA199和CA125無明顯相關(guān)性(P>0.05)。因此，對(duì)于結(jié)腸癌患者，可行癌胚抗原和CTC聯(lián)合檢測(cè)，以提高預(yù)測(cè)預(yù)后的準(zhǔn)確性。

此外，本研究結(jié)果顯示，與手術(shù)前1 d比較，手術(shù)后第7天及30天的外周血CTC計(jì)數(shù)均明顯降低(P<0.01)，提示外周血CTC可以作為評(píng)估手術(shù)效果和預(yù)后的臨床指標(biāo)。Liu等[24]的一項(xiàng)分析結(jié)果顯示，外周血CTC數(shù)目與腫瘤體積相關(guān)。腫瘤體積過小與無法檢測(cè)到外周血CTC有關(guān)。本研究中的所有患者均接受了腫瘤根治性切除術(shù)。絕大多數(shù)腫瘤細(xì)胞已經(jīng)被清除，最大限度地減少了CTC從腫瘤原發(fā)灶釋放進(jìn)入外周血[25]。本研究觀察到的術(shù)后第7 天和30天的外周血CTC計(jì)數(shù)顯著減少可能可以作為評(píng)估手術(shù)效果和患者預(yù)后的重要指標(biāo)之一。

綜上所述，CRC患者外周血中可以檢測(cè)到較高的CTC計(jì)數(shù)。外周血CTC計(jì)數(shù)與CRC的低分化相關(guān)，從一定程度上反映了腫瘤的惡性程度。此外，術(shù)后第7天和30天外周血CTC計(jì)數(shù)顯著降低，提示動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)CRC患者外周血CTC對(duì)于評(píng)估治療效果和患者預(yù)后具有重要意義，未來還應(yīng)該進(jìn)行更大樣本量和長(zhǎng)期隨訪，來進(jìn)一步確定外周血CTC計(jì)數(shù)的臨床意義。