□王兆芹 汪彤 崔海峰 趙正苗 萬宇平（通信作者）北京勤邦生物技術(shù)有限公司 北京市食品安全免疫快速檢測工程技術(shù)研究中心

□ 索金玉 灤州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局

引言

有機(jī)磷類農(nóng)藥與菊酯類農(nóng)藥是蔬菜與水果中常用的兩大類農(nóng)藥——對硫磷、毒死蜱、辛硫磷是有機(jī)磷類農(nóng)藥中的典型代表，甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯則是菊酯類農(nóng)藥中的典型代表，這兩類農(nóng)藥常常交替使用以降低害蟲產(chǎn)生抗藥性的幾率。然而，農(nóng)藥可經(jīng)消化道、呼吸道及完整的皮膚和粘膜進(jìn)入人體，從而對身體產(chǎn)生危害。因此，檢測果蔬產(chǎn)品中的對硫磷等有機(jī)磷類農(nóng)藥和甲氰菊酯等菊酯類農(nóng)藥具有必要性。

目前，檢測有機(jī)磷類農(nóng)藥和菊酯類農(nóng)藥的方法主要包括氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[1-4]、氣相色譜[5-8]、高效液相色譜法[9-11]、超高效液相色譜[12]、液相色譜法[13]等儀器方法，但此類方法的成本較高、用時(shí)較長，免疫化學(xué)檢測法則具有低成本、用時(shí)較短、特異性較強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[14-15]。本文制備出一種能夠同時(shí)檢測對硫磷、毒死蜱、辛硫磷、甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯這6種農(nóng)藥殘留的熒光免疫層析矩陣試紙條——消耗費(fèi)用及檢測時(shí)限均能夠滿足基層實(shí)驗(yàn)室的檢測需求，故具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

對硫磷、毒死蜱、辛硫磷、甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯等標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%），購自北京標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；抗體、包被原、羊抗鼠抗抗體、熒光分析儀，由北京勤邦生物技術(shù)有限公司提供；時(shí)間分辨熒光微球，購自蘇州為度生物技術(shù)有限公司；渦旋儀，購自湖南湘立科學(xué)儀器有限公司[14-15]。

1.2 方法

1.2.1 制備對硫磷、毒死蜱、辛硫磷、甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯殘留六合一熒光試紙條

對硫磷、毒死蜱、辛硫磷、甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯等藥物的抗體分別用熒光微球標(biāo)記，將標(biāo)記物分別噴涂到試紙條的核心結(jié)構(gòu)熒光免疫檢測芯片上，即在檢測線1（T1線）上包被對硫磷包被原、在檢測線2（T2線）上包被毒死蜱包被原、在檢測線3（T3線）上包被辛硫磷包被原、在檢測線4（T4線）上包被甲氰菊酯包被原、在檢測線5（T5線）上包被氯氰菊酯包被原、在檢測線6（T6線）上包被溴氰菊酯包被原，在質(zhì)控線（C線）上包被羊抗鼠抗抗體。組裝上述結(jié)構(gòu)，制備出對硫磷、毒死蜱、辛硫磷、甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯殘留六合一熒光試紙條。

1.2.2 檢測方法

用吸管吸取待檢樣品溶液垂直滴加2～3滴于加樣孔中，當(dāng)液體流動(dòng)時(shí)開始計(jì)時(shí)，反應(yīng)5min時(shí)通過熒光分析儀讀取檢測結(jié)果，其它時(shí)間判讀無效。

1.2.3 樣本檢測限

在空白柑橘、空白白菜樣本中添加對硫磷標(biāo)準(zhǔn)品至質(zhì)量濃度為0、0.01、0.02、0.04ppm；在空白柑橘、空白白菜樣本中添加毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)品至質(zhì)量濃度為0、0.25、0.5、1.0ppm；在空白柑橘、空白白菜樣本中添加辛硫磷標(biāo)準(zhǔn)品至質(zhì)量濃度為0、5、10、20 ppm；在空白柑橘樣本中添加甲氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品至質(zhì)量濃度為0、2.5、5、10ppm，在空白白菜樣本中添加甲氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品至質(zhì)量濃度為0、0.5、1、2ppm；在空白柑橘、空白白菜樣本中添加氯氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品至質(zhì)量濃度為0、0.25、0.5、1.0ppm；在空白柑橘樣本中添加溴氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品至質(zhì)量濃度為0、0.05、0.1、0.2ppm，在空白白菜樣本中添加溴氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品至質(zhì)量濃度為0、0.25、0.5、1.0ppm。按照“1.2.2”所述方法用3批試紙條進(jìn)行檢測，每個(gè)濃度重復(fù)5次，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定樣本檢測限[14-15]。

1.2.4 試紙條的特異性

分別配制10mg/kg的腐霉利、克百威、滅蠅胺等藥物，用試紙條重復(fù)檢測3次，判斷試紙條的特異性。

1.2.5 試紙條的準(zhǔn)確性

農(nóng)業(yè)部文件要求：以假陽性率和假陰性率表示熒光免疫層析法的準(zhǔn)確性[14-15]。取經(jīng)儀器確證的50份陰性果蔬樣品（質(zhì)量濃度小于檢測限）與50份陽性果蔬樣品（質(zhì)量濃度大于檢測限），用該試紙條檢測對硫磷、毒死蜱、辛硫磷、甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯的藥物殘留量，計(jì)算假陽性率和假陰性率[14-15]?！掇r(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》規(guī)定：試紙條假陽性率應(yīng)小于5%，假陰性率應(yīng)為零[14-15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本檢測限

按照“1.2.3”在空白樣本中添加藥物標(biāo)準(zhǔn)品至一定的質(zhì)量濃度，進(jìn)行檢測，并確定檢測限[14-15]。

2.2 特異性

采用該試紙條檢測10mg/kg的腐霉利、克百威、滅蠅胺等藥物，結(jié)果均呈陰性，表明該試紙條特異性較好。

2.3 準(zhǔn)確性

用試紙條檢測50份陰性果蔬樣品，檢測結(jié)果均為陰性，說明假陽性率低于5%；用試紙條檢測50份陽性果蔬樣品，試紙條檢測結(jié)果均為陽性，說明試紙條假陰性率為零，符合《農(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》的要求[14-15]。

3 討論

本文制備出試紙條的核心結(jié)構(gòu)——熒光免疫檢測芯片，研制出一種能夠同時(shí)檢測對硫磷、毒死蜱、辛硫磷、甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯這6種農(nóng)藥殘留的熒光免疫層析矩陣試紙條。按照《農(nóng)殘辦技術(shù)材料要求及審查程序》的要求對試紙條進(jìn)行了特異性、準(zhǔn)確性等性能測試，均符合要求。試紙條的檢測時(shí)間僅為5min，比現(xiàn)有文獻(xiàn)中的儀器方法用時(shí)更短，操作更簡便。試紙條的對硫磷檢測限為果蔬0.02mg/kg，毒死蜱檢測限為果蔬0.5mg/kg，辛硫磷檢測限為果蔬10mg/kg，甲氰菊酯檢測限為水果5mg/kg、蔬菜1mg/kg，氯氰菊酯檢測限為果蔬0.5mg/kg，溴氰菊酯檢測限為水果0.1mg/kg、蔬菜0.5mg/kg，靈敏度較高。

表1 對硫磷、毒死蜱、辛硫磷、甲氰菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯六合一試紙條的檢測限

表2 特異性測定