沈力安?余汶潞?張彤

摘 要：為培養(yǎng)適用于混凝土自修復(fù)的微生物，本研究采用枯草芽孢桿菌、膠質(zhì)芽孢桿菌、“長安修復(fù)菌”對培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究。經(jīng)過分析，選取37 ℃作為培養(yǎng)溫度，營養(yǎng)物質(zhì)采用蛋白胨、牛肉浸出粉、氯化鈉、瓊脂來促進(jìn)微生物生長。在每1 000 mL培養(yǎng)基中加入錳離子，促進(jìn)枯草芽孢桿菌、膠質(zhì)芽孢桿菌和“長安修復(fù)菌”生成芽孢;離心機轉(zhuǎn)速采用5 000 r·min-1，最終成功培養(yǎng)出高純度的芽孢懸液。

關(guān)鍵詞：混凝土;微生物自修復(fù);培養(yǎng)條件;枯草芽孢桿菌;芽孢懸液

中圖分類號：TU528文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1003-5168（2021）05-0088-04

Abstract： In this study， Bacillus subtilis， Bacillus gelatinosus and "Chang'an repair bacteria" were used to study the culture conditions. After analysis， 37 ℃ was selected as the culture temperature， and peptone， beef extract powder， sodium chloride and agar were used to promote the growth of microorganisms. Manganese ion was added into every 1 000 mL medium to promote the spore formation of Bacillus subtilis， Bacillus gelatinosus and "Chang'an repair bacteria"; the centrifuge speed was 5 000 r·min-1， and finally the high-purity spore suspension was successfully cultivated.

Keywords： concrete;self-healing microorganism;culture condition;bacillus subtilis;spore suspension

近年來，采用微生物誘導(dǎo)礦化的混凝土自修復(fù)技術(shù)成為國際研究的熱點。微生物自愈合是一種通過微生物自身生命活動與周圍環(huán)境介質(zhì)發(fā)生酶化作用并產(chǎn)生方解石等礦物化合物來修復(fù)混凝土內(nèi)部或表面微裂縫的技術(shù)。同時，微生物誘導(dǎo)礦化自愈合的過程是一個綠色環(huán)保的裂縫修補過程，且可以在一定程度上改善混凝土本身的力學(xué)性能。

枯草芽孢桿菌和膠質(zhì)芽孢桿菌均屬于革蘭氏陽性菌。革蘭氏陽性菌目前被廣泛應(yīng)用于微生物自修復(fù)混凝土的實驗研究中。枯草芽孢桿菌在土壤和植物微生態(tài)中處于優(yōu)勢地位，繁殖速度快，營養(yǎng)要求簡單，代謝產(chǎn)物也具有很高的酶活性，對大自然環(huán)境無污染，也不會危害農(nóng)作物。作為一種有益的根際微生物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及農(nóng)作物病害預(yù)防上發(fā)揮了很大作用。目前，枯草芽孢桿菌在生產(chǎn)過程中的主要問題是芽孢的生產(chǎn)率較低，工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)條件較為困難，成本較高等。膠質(zhì)芽孢桿菌是一種廣泛分布于土壤和巖石中的細(xì)菌，具有一定的礦物分解能力，能夠分解出礦物中的鉀、硅、磷等元素，同時也具有溶磷、釋鉀和固氮功能，在生長繁殖的過程中產(chǎn)生有機酸等物質(zhì)。

為確定混凝土用微生物適宜培養(yǎng)條件，本文對枯草芽孢桿菌的生長培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，引入了膠質(zhì)芽孢桿菌和在土壤內(nèi)提取的細(xì)菌作為參照，將優(yōu)化后的培養(yǎng)條件用于三種菌株的培養(yǎng)，并檢查芽孢懸液培養(yǎng)成效。

1 原材料與實驗方法

1.1 微生物

本文所用微生物包括枯草芽孢桿菌、膠質(zhì)芽孢桿菌，均由上海保藏生物技術(shù)中心提供。另外，從長安大學(xué)校園花園苗圃土壤內(nèi)提取獲得一種潛在細(xì)菌，為便于描述，所提取細(xì)菌暫命名為“長安修復(fù)菌”。

1.2 菌種擴大培養(yǎng)

在超凈工作臺上對上述三類菌種進(jìn)行擴大培養(yǎng)。主要培養(yǎng)過程：0.5 mL無菌水振蕩，菌體溶液呈懸浮狀，無菌吸管吸出至斜面培養(yǎng)基中，放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行第一代培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為48 h。此后，采用劃線法對第一代菌株擴大培養(yǎng)，得到第二代菌株和第三代菌株。

1.3 菌種芽孢培養(yǎng)

在超凈工作臺中，將第三代菌株劃線培養(yǎng)到促芽孢培養(yǎng)基上，于恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h，獲得枯草芽孢桿菌芽孢、膠質(zhì)芽孢桿菌芽孢、“長安修復(fù)菌”芽孢，并通過染色法在顯微鏡下完成芽孢鑒定。

1.4 芽孢懸液制備

用無菌水洗滌促芽孢培養(yǎng)基上的芽孢，并用無菌吸管轉(zhuǎn)移至離心管中，將離心管放置于離心機內(nèi)，在5 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心30 min，離心后保留下部沉淀部分，重新滴加無菌水并離心，重復(fù)以上步驟直至完成3次離心，最終制備出沉淀后的芽孢懸液。

2 微生物篩選與培養(yǎng)參數(shù)選擇

2.1 微生物篩選

應(yīng)用于自修復(fù)混凝土中的菌株必須滿足以下條件：①在混凝土內(nèi)部環(huán)境中存活;②具有在水泥基中沉淀碳酸鈣的能力，從而實現(xiàn)在混凝土出現(xiàn)裂縫時表現(xiàn)出足夠的自愈合能力?；炷恋膬?nèi)部環(huán)境復(fù)雜且具有很多限制因素，例如，pH值高、氧氣濃度較低及混凝土生產(chǎn)時的高溫、高壓及機械應(yīng)力。因此，篩選的菌株必須是耐高堿性的芽孢，使其可以在極端情況下生存。目前，微生物自修復(fù)混凝土主要使用革蘭氏陽性細(xì)菌，常見的有芽孢桿菌和短小芽孢桿菌。

基于此，本研究篩選了枯草芽孢桿菌和膠質(zhì)芽孢桿菌來復(fù)蘇并擴大培養(yǎng)。同時，在長安大學(xué)校園花圃中取土壤表層5～10 cm下的肥土100 g左右，把土壤放入無菌采樣袋中帶回實驗室分離、震蕩、密封，通過90 ℃恒溫水浴20 min，篩選出形成芽孢的細(xì)菌，制成1∶100濃度的土壤懸液。逐步稀釋，獲得10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的土壤懸液，吸取10-4、10-5、10-6土壤懸濁液0.2 mL，滴加到平板培養(yǎng)基上，于37 ℃恒溫培養(yǎng)1～2 d。從上述平板中分別挑取單菌落，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。

挑選顯微鏡下呈桿狀，菌落顏色、形狀、質(zhì)地、透明度均一致的菌體，進(jìn)行菌株初步鑒定。挑取疑似芽孢桿菌的菌落，進(jìn)行稀釋、涂片，通過孔雀綠番紅染色，用顯微鏡觀察革蘭氏染色情況，其中呈紫色的菌體即為革蘭氏陽性菌，并對該菌進(jìn)一步擴大培養(yǎng)。

2.2 培養(yǎng)溫度

溫度是影響細(xì)胞生長代謝的重要因素之一，它會影響各種酶反應(yīng)的速率，改變菌體代謝產(chǎn)物的合成方向，影響微生物的代謝調(diào)控機制和發(fā)酵液的理化性質(zhì)，進(jìn)而影響發(fā)酵的動力學(xué)特性和產(chǎn)物的生物合成[1]。

考慮到單因素篩選對培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，因此除溫度這一單一變量外，其他影響菌株生長的因素須保持一致。根據(jù)Sibel等學(xué)者的優(yōu)化實驗[2]，控制底物培養(yǎng)基濃度一致，在培養(yǎng)基接種完成后，設(shè)置培養(yǎng)溫度為28、31、34、37、40 ℃，在24 h后測定培養(yǎng)皿的OD600nm值。結(jié)果表明，當(dāng)恒溫培養(yǎng)的溫度為37 ℃ 時，菌體的生長量達(dá)到最高。溫度高于或低于37 ℃，含菌數(shù)都有所下降。因此，本研究采用37 ℃培養(yǎng)溫度對枯草芽孢桿菌、膠質(zhì)芽孢桿菌以及“長安修復(fù)菌”進(jìn)行培養(yǎng)。

2.3 氧氣濃度

芽孢桿菌是屬于需氧或者兼性厭氧的細(xì)菌，氧氣在芽孢的培養(yǎng)過程中起著非常重要的作用，是影響培養(yǎng)效率的關(guān)鍵因素。有效氧濃度的增加，可以促進(jìn)細(xì)菌、孢子和代謝物數(shù)量的增加，而有效氧的缺乏或減少，會限制生物的生命活動過程，影響發(fā)酵，導(dǎo)致孢子囊的溶解。根據(jù)Elsayed等的研究結(jié)果可知，枯草芽孢桿菌在限制氧氣的條件下不會產(chǎn)生孢子，而在通氣量為2 L/min時產(chǎn)芽孢量最高[3]。

2.4 培養(yǎng)基配方篩選

促進(jìn)枯草芽孢桿菌產(chǎn)生芽孢的培養(yǎng)基應(yīng)該由碳源、氮源、無機鹽、生長因子和滿足細(xì)菌代謝所需要的附加物質(zhì)組成，且這些組成物質(zhì)相互作用，在不同情況下對最終細(xì)菌孢子的產(chǎn)量具有不同程度的影響，所以促芽孢培養(yǎng)基需要營養(yǎng)物質(zhì)的不同組合來優(yōu)化和培養(yǎng)芽孢桿菌孢子。

不同種類和數(shù)量的碳氮源對枯草芽孢桿菌有著不同的影響。根據(jù)Elsayed等人的研究可知，20 g·L-1葡萄糖、2.5 g·L-1硫酸銨條件下枯草芽孢桿菌孢子濃度達(dá)到最大。Kardziani等人發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為2 g·L-1時孢子產(chǎn)量最高，較高的葡萄糖濃度會抑制產(chǎn)孢。Chen等人使用10種不同的碳氮源來探究產(chǎn)芽孢量的關(guān)鍵營養(yǎng)來源，發(fā)現(xiàn)利用玉米淀粉、麥麩、玉米粉、玉米漿、大豆粉和酵母提取物等制備的營養(yǎng)成分可高效生產(chǎn)枯草芽孢桿菌。

無機鹽和微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)是枯草芽孢桿菌產(chǎn)生芽孢的關(guān)鍵條件，不同類型的無機鹽對菌體生長和出芽的影響程度也不一樣。在維生素和微量元素的影響下，枯草芽孢桿菌產(chǎn)生孢子的效果更好[3]。錳離子是芽孢形成的關(guān)鍵微量元素，郭夏雨通過實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Mn2+的濃度為2.4 mmol·L-1時，芽孢數(shù)量達(dá)到最高，隨著Mn2+不斷增加，芽孢數(shù)量逐漸減少，當(dāng)Mn2+濃度為6 mmol·L-1時，幾乎不能產(chǎn)生芽孢。雖然錳離子對芽孢的形成有顯著的作用，但是錳離子對于細(xì)菌增殖沒有明顯作用[4]。

細(xì)菌和芽孢的生長都需要一個相對合適的酸堿度環(huán)境，而大部分菌體都能在中性環(huán)境下正常生長。pH值一方面可以影響細(xì)胞膜的電荷，引起原生質(zhì)膜對個別離子透性的變化，同時也會影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、酶的形成等。研究表明，最適合枯草芽孢桿菌芽孢生長的pH值為7.0，且隨著pH的不斷增加，細(xì)菌數(shù)量和芽孢數(shù)量會不斷下降。

根據(jù)上文分析，本實驗的菌種最適宜的培養(yǎng)基組成是：玉米漿16.18 g·L-1、大豆粉17.53 g·L-1、酵母膏8.14 g·L-1、 （K2HPO4+KH2PO4）0.5 g·L-1，MnSO4·H20 0.2 g·L-1;產(chǎn)芽孢的底料初始pH值為7.0。

2.5 離心機轉(zhuǎn)速

當(dāng)對枯草芽孢桿菌、膠質(zhì)芽孢桿菌、“長安修復(fù)菌”培養(yǎng)三代之后，將對其進(jìn)行芽孢培養(yǎng)，制作芽孢懸液。在制作芽孢懸液前，需要多次對枯草芽孢桿菌、膠質(zhì)芽孢桿菌及“長安修復(fù)菌”進(jìn)行無菌水洗滌沖洗和離心。然而，離心機轉(zhuǎn)速的大小會影響芽孢的離心狀態(tài)。根據(jù)趙甜宇等的實驗研究可知，在優(yōu)化制備菌劑的工藝時均采用5 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速來離心菌液，能成功得到離心良好的菌泥[5]。因此，本研究選擇離心機轉(zhuǎn)速為5 000 r·min-1。

3 研究結(jié)果

3.1 微生物擴大培養(yǎng)結(jié)果

培養(yǎng)流程如圖1所示，第一、二、三代為在37 ℃培養(yǎng)溫度下，以蛋白胨、牛肉浸出粉、氯化鈉、瓊脂為營養(yǎng)物質(zhì)，培養(yǎng)后可觀察到培養(yǎng)皿內(nèi)已有大量微生物長出且生長狀況良好。可見，37 ℃培養(yǎng)溫度及此類營養(yǎng)物質(zhì)非常適合枯草芽孢桿菌的生長。

圖2為在校園土壤內(nèi)提取微生物的樣品。用無菌設(shè)備對花壇下的土壤進(jìn)行取樣，并制備土壤懸液，對土壤懸液進(jìn)行梯度稀釋后，獲得分別稀釋10-4、10-5、10-6后的液體，并對其進(jìn)行涂布培養(yǎng)。其中，稀釋[10-6]的土壤懸液單菌落分離，平板培養(yǎng)基內(nèi)生長出了4個微生物。如圖3所示，A、B、C分別為枯草芽孢桿菌、膠質(zhì)芽孢桿菌及“長安修復(fù)菌”。其中，“長安修復(fù)菌”為挑選的疑似芽孢桿菌的菌落，通過革蘭氏鑒定，菌體呈紫色。

3.2 芽孢鑒定

圖4為在促芽孢培養(yǎng)基中提取的少量芽孢染色后的顯微鏡觀察圖，A、B、C分別為枯草芽孢桿菌芽孢、膠質(zhì)芽孢桿菌芽孢和“長安修復(fù)菌”芽孢。通過觀察可發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中含有大量綠色顆粒及少許紫色顆粒，綠色顆粒即生成的芽孢，而紫色顆粒則為未生成芽孢的微生物?？梢姡挎吲囵B(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)配比可以有效促進(jìn)枯草芽孢桿菌、膠質(zhì)芽孢桿菌和“長安修復(fù)菌”生成芽孢且芽孢生成率較高。

3.3 芽孢培養(yǎng)結(jié)果

圖5中A、B、C分別為離心后的枯草芽孢桿菌芽孢懸液、膠質(zhì)芽孢桿菌芽孢懸液和“長安修復(fù)菌”芽孢懸液?？梢姡? 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心30 min可以有效去除雜質(zhì)且芽孢均離心密實，表明該轉(zhuǎn)速下可以離心得到較高純度的枯草芽孢桿菌芽孢。

4 結(jié)論

結(jié)果表明，本研究確定的37 ℃培養(yǎng)溫度、營養(yǎng)物質(zhì)組成（蛋白胨、牛肉浸出粉、氯化鈉、瓊脂）適宜枯草芽孢桿菌、膠質(zhì)芽孢桿菌和“長安修復(fù)菌”生長。同時，以玉米漿、大豆粉、酵母膏為營養(yǎng)物質(zhì)并加入一定量（K2HPO4+KH2PO4）、MnSO4·H20制成的促芽孢培養(yǎng)基順利地制備了枯草芽孢桿菌、膠質(zhì)芽孢桿菌和“長安修復(fù)菌”芽孢。采用5 000 r·min-1的離心轉(zhuǎn)速，順利實現(xiàn)了三類微生物的芽孢提純。

參考文獻(xiàn)：

[1]上官文菲，陳合，陳婧，等.響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵乳桿菌產(chǎn)γ-氨基丁酸的培養(yǎng)條件[J].中國釀造，2019（12）：87-91.

[2] UZUNER S ， CEKMECELIOGLU D . Enhanced pectinase production by optimizing fermentation conditions of Bacillus subtilis growing on hazelnut shell hydrolyzate[J]. Journal of Molecular Catalysis B Enzymatic，2015（1）：62-67.

[3] MONTEIRO S，CLEMENTE J J，CARRONDO M， et al. Enhanced Spore Production of Bacillus subtilis Grown in a Chemically Defined Medium[J].Advances in Microbiology，2014（8）：444-454.

[4]郭夏麗，狄源寧，王巖.枯草芽孢桿菌產(chǎn)芽孢條件的優(yōu)化[J].中國土壤與肥料，2012（3）：99-103.

[5]趙甜宇，潘朝陽，張朝輝，等.固態(tài)枯草芽孢桿菌菌劑的制備工藝研究[J].食品工業(yè)科技，2020（19）：104-111，120.