摘要：抗凍蛋白是具有熱滯活性，能改變冰晶的形態(tài)和抑制冰重結(jié)晶的一類蛋白質(zhì)。本文介紹了各種抗凍蛋白的結(jié)構(gòu)、功能、活性及作用機(jī)制，并對其在冷凍食品領(lǐng)域中的應(yīng)用進(jìn)行了系統(tǒng)的綜述。

關(guān)鍵詞：抗凍蛋白；食品；應(yīng)用

中圖分類號：Q511；TS972.24 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A

文章編號：1001—4942(2010)11—0089—04

抗凍蛋白(Antifreeze Proteins，AFPs)是一類能抑制冰晶生長的特殊蛋白質(zhì)，它能夠非依數(shù)性地降低水溶液的冰點(diǎn)，但對熔點(diǎn)的影響甚微，從而導(dǎo)致水溶液的熔點(diǎn)和冰點(diǎn)之間出現(xiàn)差值，這種差值稱為熱滯活性(Thermal Hysteresis Activity，THA)，因而AFPs亦稱為熱滯蛋白(Thermal Hys—teresis Prioteins，THPs)，具有三個基本特征：熱滯效應(yīng)、冰晶形態(tài)效應(yīng)、重結(jié)晶抑制(Recrystalliza-tion Inhibition，RI)效應(yīng)。 1969年，DeVeries在南極海峽的一種魚(Nototheneniid)的血液中首先發(fā)現(xiàn)了具有這種性質(zhì)的蛋白。其后幾十年里研究對象遍及極區(qū)魚類、昆蟲到植物材料及細(xì)菌、真菌等。魚類抗凍蛋白的研究較為深入；昆蟲抗凍蛋白的研究也可追溯到20世紀(jì)60年代；而植物抗凍蛋白的發(fā)現(xiàn)較晚?？箖龅鞍淄ㄟ^吸附到冰晶表面，由于開爾文效應(yīng)使冰晶的生長處于熱力學(xué)上不利的狀態(tài)，從而抑制冰晶的生長，保護(hù)避免結(jié)冰或者對結(jié)冰敏感的生命有機(jī)體免受結(jié)冰引起的傷害。由于抗凍蛋白具有阻止冰晶生長而不破壞細(xì)胞的特點(diǎn)，因而，有望在食品原料的冷處理、冷凍食品的保鮮等方面發(fā)揮重大作用。

1 抗凍蛋白的分類及結(jié)構(gòu)分析

按抗凍蛋白的來源分，主要有魚類抗凍蛋白、植物抗凍蛋白、昆蟲抗凍蛋白以及其他來源的抗凍蛋白。

1.1 魚類抗凍蛋白

迄今為止在魚類中共發(fā)現(xiàn)了5種抗凍蛋白，分別是抗凍糖蛋白(AFGPs)、I型抗凍蛋白(AFPI)、Ⅱ型抗凍蛋白(AFPⅡ)、Ⅲ型抗凍蛋白(AFPⅢ)和Ⅳ型抗凍蛋白(AFPⅣ)。AFGPs于1969年首先由DeVeries在魚(Trematomus boro—hgrevinki)的血液中發(fā)現(xiàn)，肽鏈?zhǔn)怯葾la—Ala—Thr三肽單位重復(fù)組成，分子量從2.7-32ku，活性隨分子量的增加及重復(fù)數(shù)的增多而提高。AFP I由Duman和DeVries于1974年在北大西洋沿海的美洲擬鰈(Pseudopleuronectes americanus)(俗稱冬鰈)的血清中發(fā)現(xiàn)，分子量為3.3—4.5ku，其二級結(jié)構(gòu)全為α－螺旋。AFPⅡ僅發(fā)現(xiàn)于少數(shù)幾種魚類(如海渡鴉、胡爪魚和鯡魚等)的血清中，其重要特征在于富含半胱氨酸(海渡鴉中8.3％、大西洋鯡中9.3％)。在大洋條鱈(Macrozoacreesamericnus)中發(fā)現(xiàn)的AFPⅢ既不富含丙氨酸，也沒有半胱氨酸，分子量約6ku。用NMR和x一射線衍射技術(shù)分析表明：其二級結(jié)構(gòu)主要由9個β一折疊組成，其中8個β－折疊組成三明治夾心結(jié)構(gòu)，另一個β－折疊則游離在其外。AFPⅣ是從長角杜文魚(Longhomsculpin，Myoxocephalusoctodecimspinosis)血清中分離到的一種新型抗凍蛋白(LS-12)，該抗凍蛋白含有108個氨基酸，分子量約為12.3 ku，并且含有高達(dá)17％的Glu。

1.2 昆蟲抗凍蛋白

1964年，Ramsay在研究黃粉甲(Tenebriomolitor)幼蟲時，發(fā)現(xiàn)體液的冰點(diǎn)明顯低于熔點(diǎn)；1968年，Gfimstone等證明黃粉甲幼蟲能夠產(chǎn)生抗凍蛋白。隨后，科學(xué)家們在多種昆蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了抗凍蛋白的存在。2004年，Duman等分別檢測了生活在美國阿拉斯加州的75種昆蟲和6種蜘蛛的血淋巴，結(jié)果在18種昆蟲和3種蜘蛛的血淋巴中檢測到抗凍蛋白的存在；Kristiansen等在Longhorn beetle(Rhagium inquisitor)血淋巴中發(fā)現(xiàn)6種抗凍蛋白，這一結(jié)果說明抗凍蛋白在昆蟲中是比較普遍存在的。Gramham等發(fā)現(xiàn)黃粉甲的AFP活性是魚類的100倍。自此昆蟲抗凍蛋白的研究引起世界各國專家的普遍關(guān)注。

目前，昆蟲抗凍蛋白的研究對象以黃粉甲(Tenebrio molitor)、云杉卷葉蛾(Choristoneura fu-miferana)和赤翅甲(Dendroides canadensis)三種昆蟲為代表，它們體內(nèi)都包含多種結(jié)構(gòu)相似、長度相同或不相同的抗凍蛋白同系物。

黃粉甲抗凍蛋白是具有右手平行β-螺旋結(jié)構(gòu)的小分子蛋白，通過多個二硫鍵交連，螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)包含串聯(lián)重復(fù)的由12個氨基酸殘基(TCTX-SXXCXXAX)組成的環(huán)。云杉卷葉蛾抗凍蛋白(cfAFP)具有左手β-螺旋結(jié)構(gòu)，每環(huán)由15個氨基酸殘基組成。赤翅甲抗凍蛋白(DcAFP)也具有右手β-螺旋結(jié)構(gòu)，氨基酸序列包含由12或13個氨基酸殘基組成的重復(fù)序列：Cys—Thr—X3—Ser—X5—Cys—X8—X9—Ala—X1l—Thr—X13，在成熟蛋白質(zhì)中每隔6個氨基酸有一個半胱氨酸，這與黃粉甲抗凍蛋白類似。

1.3 植物抗凍蛋白

到目前為止被研究的植物材料多達(dá)40余種，現(xiàn)已陸續(xù)在冬小麥、燕麥、冬黑麥、黑麥草、歐白英、胡蘿卜、沙冬青、桃樹、唐古特紅景天、甜楊等至少26種高等植物中獲得具有熱滯活性的AFP，其中，有6種代表性植物即冬黑麥、歐白英、沙冬青、桃樹、胡蘿卜及冬麥草的AFPs已被提純。這些AFPs在分子量、氨基酸組成及同源性上都不盡相同。它們的熱滯值(通常為0.2－0.5℃)較極區(qū)魚(通常為0.7—1.5℃)、昆蟲(通常為3－6℃)低。

2000年7月，英國York大學(xué)的科學(xué)家們在低溫誘導(dǎo)的黑麥草(Lolium perenne)中發(fā)現(xiàn)具有熱穩(wěn)定性AFP，這種蛋白由118個氨基酸組成，分子量為11.77ku，其熱滯值(0.1－0.45℃)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于魚類和昆蟲，但對冰晶重晶化的抑制效應(yīng)是大洋條鱈的抗凍蛋白(TypeⅢ)的200倍，在100℃時仍穩(wěn)定存在。

Huang等從冬季歐白英中克隆得到一種熱滯蛋白基因sthp-64，并得到了全長的熱滯蛋白STHP-64。該蛋白與WRKY蛋白極為相似，WRKY蛋白在植物中是調(diào)節(jié)病原菌相關(guān)蛋白(Pathogen Related Protein)翻譯的重要因子，由此推測AFPs和抗病蛋白存在著某種聯(lián)系，可能具有抗凍和抗病雙重功能，而且這些低溫誘導(dǎo)的病原相關(guān)蛋白可能起著改變植物體液的結(jié)冰特性或冰晶結(jié)合位點(diǎn)的作用。

2001年，在冰緣植株珠芽蓼(Polygonumviviparum)葉片中提取的蛋白中發(fā)現(xiàn)AFPs，分子量為15.2-72.3ku，均為AFGP。熱滯值可達(dá)0.3℃(7.8mg/m1)，是迄今為止在動植物中得到的分子量最大的AFP。

2002年，Nelly等從Boreogadussaida中分離純化得到一種N端被甲基化的AFGP。通過13C核磁共振和傅立葉變換紅外光譜儀對其動力學(xué)構(gòu)象進(jìn)行研究表明：AFGP無論在什么條件下基本上都保持著一種相似的三維折疊結(jié)構(gòu)。該AFGP的水化作用和相對穩(wěn)定的主鏈構(gòu)象在抑制冰晶生長中發(fā)揮著重要作用。

2005年，Bravo等發(fā)現(xiàn)：南極海區(qū)的植物Deschampsia antarctica經(jīng)過冷誘導(dǎo)后，AFPs的量增加，活性增強(qiáng)，而且有很寬的pH值范圍，SDS—PAGE顯示有13個多肽。

最近，Zhou等利用魚類的抗凍蛋白(TypeⅢ)作為抗體，與經(jīng)過冷誘導(dǎo)的常青地被植物Ter-minalis Sieb，＆Zucc中產(chǎn)生的蛋白進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果免疫反應(yīng)發(fā)生，這是關(guān)于魚類抗凍蛋白和植物蛋白具有免疫反應(yīng)的第一次報(bào)道。

2 抗凍蛋白的活性

抗凍蛋白具有兩種效應(yīng)，一種效應(yīng)稱為熱滯效應(yīng)，抗凍蛋白能夠非依數(shù)地降低溶液或者體液的冰點(diǎn)，但是不改變?nèi)埸c(diǎn)，二者之差稱為熱滯值；另一種效應(yīng)是重結(jié)晶抑制效應(yīng)。重結(jié)晶指已經(jīng)形成的冰晶顆粒之間進(jìn)行生長重分配，有的增大，有的減小，或者小冰晶聚合成大的冰晶。重結(jié)晶抑制效應(yīng)是指抗凍蛋白對重結(jié)晶的抑制，避免形成體積過大的冰晶而對組織造成機(jī)械損傷?？箖龅鞍椎幕钚砸话阒杆臒釡钚?，用熱滯值表示。

3 抗凍蛋白的功能

抗凍蛋白的主要功能是保護(hù)生命有機(jī)體安全順利度過低溫脅迫的生存環(huán)境，通過吸附抑制機(jī)制，限制冰晶生長，從而保護(hù)生命有機(jī)體免受結(jié)冰引起的傷害?？箖龅鞍字挥绊懡Y(jié)冰過程，幾乎不影響熔化。抗凍蛋白的功能除了能產(chǎn)生熱滯效應(yīng)外，還能改變冰晶的形態(tài)，能夠結(jié)合并抑制冰晶生長，降低血漿的冰點(diǎn)；它還能顯著抑制冰晶生長速率，極低濃度就能抑制重結(jié)晶，防止小的冰晶凝聚成大的冰晶；另外，AFP能阻斷Ca²⁺、K⁺通道，維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，抑制冰晶對細(xì)胞膜的損傷；AFP還可能與昆蟲體內(nèi)水分平衡有關(guān)，可增強(qiáng)細(xì)胞或體液的保水能力。

4 抗凍蛋白的作用機(jī)制

在動植物中發(fā)現(xiàn)的AFPs結(jié)構(gòu)各異，沒有共同的演化規(guī)律，因此認(rèn)為不同的AFPs的抗凍機(jī)理也不盡相同。有關(guān)魚類抗凍蛋白抗凍機(jī)制的研究已有較多的報(bào)道，曾提出多種假說，如結(jié)合水學(xué)說、空間屏障及吸附抑制機(jī)制等。目前對昆蟲抗凍蛋白的作用機(jī)制還不十分明確，一般認(rèn)為它們不是作為溶質(zhì)使昆蟲血淋巴的滲透壓增加而使冰點(diǎn)下降，而是吸附于冰晶表面阻止冰晶的進(jìn)一步增長，從而降低血淋巴的冰點(diǎn)，即所謂的吸附抑制理論。吸附抑制理論認(rèn)為抗凍蛋白吸附在冰晶表面，通過Kenlin效應(yīng)抑制其生長。機(jī)制的模型為：一般晶體的生長垂直于晶體的表面，假如雜質(zhì)分子吸附于冰生長通途的表面，那么需要再外加一推動力(冰點(diǎn)下降)，促使冰在雜質(zhì)間生長。由于曲率增大，邊緣的表面積也增加。因表面張力的影響，增加表面積將使體系的平衡狀態(tài)發(fā)生改變，從而冰點(diǎn)降低。

5 抗凍蛋白的基因工程

Holmberg等把編碼煙草致病相關(guān)蛋白先導(dǎo)序列的基因和編碼成熟云杉卷葉蛾抗凍蛋白的主要序列融合，把合成基因?qū)藷煵莼蚪M。轉(zhuǎn)基因成功的煙草表現(xiàn)出較強(qiáng)抗凍能力。

尹明安等以寧夏吳忠胡蘿卜、陜西華縣胡蘿卜和陜西漢中胡蘿卜3個地方品種為材料，克隆了中國胡蘿卜的抗凍蛋白基因。2001年，尹明安等又以PCR法在體外擴(kuò)增出胡蘿卜抗凍蛋白基因，并構(gòu)建成胡蘿卜AFP的植物表達(dá)載體pBAF，為進(jìn)一步利用其轉(zhuǎn)化番茄、甜椒等作物奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

2004年，Marshall等通過基因工程方法，在由84個氨基酸組成的黃粉甲抗凍蛋白基因序列的基礎(chǔ)上減去或者加上螺旋環(huán)，分別構(gòu)建了包含6－11個螺旋環(huán)的重組基因，表達(dá)產(chǎn)物通過親和層析剔除了錯誤折疊的蛋白質(zhì)。結(jié)果表明9個螺旋環(huán)的蛋白活性最強(qiáng)。但當(dāng)螺旋環(huán)增加到10-11時，活性開始下降。這與Liu等最近的研究結(jié)果一致，即在一定范圍內(nèi)，隨著串聯(lián)重復(fù)的螺旋環(huán)數(shù)量的增加，抗凍蛋白的β-螺旋與冰晶之問的匹配程度逐漸降低，螺旋環(huán)數(shù)量達(dá)到一定數(shù)量時，相互作用能量達(dá)到上限。

2005年，國內(nèi)劉忠淵等在大腸桿菌中以融合蛋白形式表達(dá)赤翅甲抗凍蛋白獲得成功，活性檢測結(jié)果表明，抗凍融合蛋白也能在一定程度上提高細(xì)菌的耐寒能力。另外，趙干等成功克隆并在原核生物體內(nèi)表達(dá)出了準(zhǔn)噶爾小胸鱉甲融合抗凍蛋白，細(xì)菌的抗凍實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該蛋白對細(xì)菌具有顯著的抗凍保護(hù)作用，保護(hù)效果與抗凍蛋白劑量呈正相關(guān)。

2009年，黃粉甲抗凍蛋白基因afp84α在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)，0℃和-1.5℃活性實(shí)驗(yàn)表明，重組蛋白具有較高的抗凍效應(yīng)(本文作者研究成果，待發(fā)表)。

6 抗凍蛋白在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用

抗凍蛋白的特性在20世紀(jì)60年代末報(bào)道后，美、加、英等國很多學(xué)者紛紛將其抗凍性應(yīng)用到食品中去。特別是基因工程的發(fā)展為抗凍蛋白在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用提供了更好的條件。

6.1 食品運(yùn)輸和貯藏方面的應(yīng)用

抗凍蛋白可抑制冷凍貯藏過程中冰晶的重結(jié)晶，果蔬貯藏時的溫度越低，品質(zhì)保持的越好，大部分果蔬可以在－18℃實(shí)現(xiàn)跨季節(jié)凍藏。但果蔬質(zhì)膜均由彈性較差的細(xì)胞壁包裹，凍結(jié)過程對細(xì)胞的機(jī)械損傷和溶質(zhì)損傷較為突出，因此適宜低溫點(diǎn)的選擇往往取決于貯藏對象的耐低溫能力，由于果蔬品種、組織成分、成熟度等多種因素不同，對低溫凍結(jié)的承受能力差別很大。食品在解凍過程中常出現(xiàn)的問題是汁液流失、軟爛、失去原有的形態(tài)。造成汁液流失的原因與食品的原料、凍結(jié)方式、凍藏條件以及解凍方式有關(guān)。能表達(dá)抗凍蛋白的轉(zhuǎn)基因蔬菜可改善這種狀況，提高速凍品的質(zhì)量。這是因?yàn)檗D(zhuǎn)基因蔬菜在凍結(jié)與凍藏中冰晶對細(xì)胞和蛋白質(zhì)的破壞很小，合理解凍后，部分融化的冰晶也會緩慢滲透到細(xì)胞內(nèi)，在蛋白質(zhì)顆粒周圍重新形成水化層，使汁液流失減少，保持了解凍食品的營養(yǎng)成分和原有風(fēng)味。

6.2 在冷凍乳制品中的應(yīng)用

目前，抗凍蛋白在食品中最成功的應(yīng)用是添加到冷凍乳制品中，抑制冰的重結(jié)晶現(xiàn)象，提高冷凍食品的質(zhì)量。組織細(xì)膩是冰淇淋感官評價的一個重要標(biāo)準(zhǔn)，它主要取決于冰淇淋中冰晶的尺寸、形狀及分布。冰晶越小、分布越均勻、越柔軟細(xì)膩，口感越好。所以在冰淇淋的加工和貯藏過程中，必須控制冰晶的尺寸。冰淇淋在貯存、運(yùn)輸過程易受升溫或溫度波動的影響，溫度波動對冰晶的影響更大，因?yàn)楫?dāng)溫度升高時，冰淇淋中的未凍水分增多，而溫度降低時，未凍水分重新凝結(jié)，使原來細(xì)小的冰晶長大?？梢?，在貯存、運(yùn)輸過程中冰晶的再結(jié)晶使冰淇淋的質(zhì)地粗糙，失去了原有的細(xì)膩口感。

6.3 在肉類食品冷藏中的應(yīng)用

研究發(fā)現(xiàn)將肉浸泡在抗凍蛋白溶液中凍藏后可以明顯減小冰晶的大小?？箖龅鞍滓砸欢ǖ姆绞脚c肉組織結(jié)合，但在肉中的擴(kuò)散需要一定的時間，在羊屠殺之前，把抗凍糖蛋白注入，結(jié)果汁液的流失和冰晶的大小均被抑制了。