翟俊，夏亦寒，成水平，田雨，王泉峰

(1.重慶大學(xué) 環(huán)境與生態(tài)學(xué)院，重慶 400045；2.同濟大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200092)

乙炔基雌二醇(17α-ethinylestradiol，EE2)是一種典型的人工合成類固醇雌激素，主要應(yīng)用于治療脫發(fā)癥、乳腺癌、前列腺等疾病，其中，大量未被人體利用的EE2以及代謝物會排放進入環(huán)境[1]。據(jù)統(tǒng)計，目前中國自然水體內(nèi)的EE2濃度為5.7～70 ng/L[2-4]。然而，即使在如此低濃度的條件下，EE2也會對環(huán)境中非目標生物的生長、發(fā)育以及繁殖產(chǎn)生明顯影響，甚至?xí)ㄟ^食物鏈富集對生態(tài)安全和人類健康產(chǎn)生潛在威脅[5]。

污水處理廠是污水中各種污染物去除的主要場所，但其設(shè)計的初衷并不是為了完全去除有機藥物，因此，對EE2的去除率較低，且吸附于污泥的EE2容易造成二次污染[6]。目前的EE2處理工藝，如高級氧化、膜工藝及過濾法等，雖然有較好的去除效果，但因其能耗較大及毒性副產(chǎn)物產(chǎn)生等問題，大規(guī)模應(yīng)用受到限制[7]，因此，開發(fā)低環(huán)境風(fēng)險的EE2處理技術(shù)具有重要的環(huán)境意義。

生物氧化錳是微生物(錳氧化細菌或真菌)氧化Mn2+而生成的一種無定形礦物[8]。大量研究表明，生物氧化錳具有優(yōu)異的吸附和氧化性能，能夠有效去除環(huán)境中許多種類的有機和無機污染物[8]。因此，利用生物氧化錳去除EE2具有較大的應(yīng)用前景。錳氧化細菌(manganese-oxidizing bacterium，MnOB)可以通過直接[9-10]和間接氧化[11-12]兩種機制實現(xiàn)對Mn2+的氧化。例如，MnOB可以分泌胞外錳氧化因子(如多糖、蛋白質(zhì))直接催化氧化Mn2+[9-10]。另外，MnOB自身生長代謝活動導(dǎo)致的環(huán)境條件改變(如提高pH值和DO)會加速Mn2+的化學(xué)氧化過程，實現(xiàn)間接氧化[11-12]。相關(guān)研究表明，溫度、pH值、Mn2+濃度等因素均會影響MnOB的活性[13]，進而對生物氧化錳的生成產(chǎn)生影響。但關(guān)于這些條件對MnOB及生物氧化錳去除EE2效果的影響還鮮有報道。

筆者以污水廠好氧污泥作為菌源，在不同pH值及初始Mn2+濃度條件下對MnOB進行激活。利用XRD對最優(yōu)激活條件下生成的生物氧化錳進行分析，并通過高通量測序分析激活反應(yīng)前后微生物群落的變化，以生物氧化錳為氧化劑，研究pH值和投加量對生物氧化錳去除EE2的影響，研究結(jié)果可為生物氧化錳去除EE2提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌源：試驗菌源取自重慶豪洋水務(wù)沙坪壩排水公司氧化溝好氧段污泥。培養(yǎng)基采用Leptothrix培養(yǎng)基[14]，根據(jù)試驗需要加入一定量的Mn2+(MnCl2·4H2O)，緩沖溶液為MES緩沖溶液(pH值為5.0及6.0)或HEPES緩沖溶液(pH值為7.0及8.0)。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 MnOB激活 將5%的好氧污泥接種于100 mL培養(yǎng)基中，pH值分別設(shè)置為5.0、6.0、7.0、8.0，體系初始Mn2+濃度為1 mmol/L，設(shè)置3個平行，于28 ℃、轉(zhuǎn)速140 r/min的搖床中避光培養(yǎng)7 d。定期對體系內(nèi)Mn2+濃度、生物氧化錳濃度進行測定。

研究初始Mn2+濃度的影響時，操作同上，pH值為試驗得到的最優(yōu)pH值，初始Mn2+濃度設(shè)置為0.5、1、2.5、5、10 mmol/L，其他條件同上。

將菌源接種至培養(yǎng)基中，在上述試驗得到的最優(yōu)pH值及Mn2+濃度下培養(yǎng)7 d。取適量菌懸液，用無菌水清洗，并以2 000 r/min離心10 min，以去除雜質(zhì)，重復(fù)以上步驟10次，所得樣品部分在4 ℃冰箱中保存，以用于后續(xù)EE2去除試驗。其余樣品進行純化程序，獲得純化生物氧化錳用于XRD分析。純化程序為[15]：樣品在10 mL苯酚中超聲提取45 min，并以50∶50苯酚∶氯仿、氯仿和12∶5∶3甲醇∶氯仿∶水為溶劑提取10 min。用無菌水沖洗樣品10次，并酸化至pH值為3。以150 r/min離心30 min，去上清液，在0.17% NaOH溶液中振蕩4 h，最后，用無菌水清洗樣品10次，保存?zhèn)溆谩?/p>

純化后得到的生物氧化錳經(jīng)冷凍干燥(-50 ℃)、研磨、過篩，進行XRD表征。此外，為分析激活前后微生物群落的變化，在激活反應(yīng)前后，取適量污泥樣品，提取總DNA后進行16SrDNA高通量測序。

1.2.2 生物氧化錳去除EE2 取最優(yōu)激活條件下產(chǎn)生的生物氧化錳進行EE2去除試驗。根據(jù)不同pH值設(shè)置為5組，體系pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，生物氧化錳濃度為20 mg/L，有機藥物濃度為1 mg/L。每組試驗取3次平行試驗的平均值作為試驗數(shù)據(jù)。此外，為了排除體系中生物相對有機藥物去除的貢獻，每組試驗設(shè)置一個對照組。對照組通過加入50 μL 10%抗壞血酸以使生物氧化錳溶解，其余條件同上，定期取樣對體系內(nèi)EE2濃度進行測定。

研究生物氧化錳投加量的影響時，體系pH值為試驗得到的最優(yōu)pH值，分別控制體系的生物氧化錳濃度為5、10、20 mg/L，其余試驗及測試條件同上。

1.3 測試方法

1.3.1 化學(xué)測試方法 采用高碘酸鉀分光光度法[16]進行Mn2+濃度的測定。采用亮柏藍分光光度法[17]進行生物氧化錳濃度的測定。采用液相色譜法進行EE2濃度的測定,其中：色譜柱為Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈和水，體積比為60∶40；進樣量20 μL；流速1.0 mL/min；柱溫26 ℃；檢測波長205 nm；保留時間2.977 min。

1.3.2 XRD表征 采用布魯克D8 ADVANCE X射線衍射儀對生物氧化錳進行物相分析，其測試條件為Cu kα輻射源，掃描范圍為10°～90°(2θ)，掃描速率2.0 (°)/min，步幅0.02°。

1.3.3 微生物多樣性分析 混合液離心后去上清液，按照PowerSoil DNA試劑盒說明提取總DNA，隨后用核酸濃度測定儀測定樣品DNA濃度(NanoDrop2000，美國Thermo Fisher Scientific公司)。對檢測合格的DNA進行PCR擴增后進行16SrDNA高通量測序(上海美吉生物技術(shù)有限公司)。PCR擴增引物為338F(3’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-5’)及806R(3’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-5’)[18]。PCR產(chǎn)物片段驗證采用2%瓊脂糖凝膠電泳。

2 結(jié)果與討論

2.1 MnOB激活

2.1.1 pH值的影響 不同pH值條件下，Mn2+、生物氧化錳濃度變化及Mn2+轉(zhuǎn)化率見圖1。反應(yīng)7 d后，Mn2+及生物氧化錳濃度均達到穩(wěn)定，激活反應(yīng)完成。在pH值為7.0時，7 d后體系內(nèi)Mn2+去除率達到92.4%，而Mn2+的氧化率達到83.3%，氧化率顯著高于其他試驗組，以激活反應(yīng)完成后Mn2+的氧化率作為衡量激活反應(yīng)效果的指標，pH值為7.0時，MnOB激活效果最好，這與Zhou等[19]及崔馨文[20]的研究結(jié)果一致。在試驗pH值范圍內(nèi)，Mn2+的氧化主要是生物氧化而非生物化學(xué)氧化，因為pH值小于9時動力學(xué)上不利于Mn2+的化學(xué)氧化[21]。因此，pH值對Mn2+氧化速率的影響主要是對MnOB活性的影響，中性條件對MnOB的生長更有利[20]，這可能是中性條件下Mn2+的氧化率高的主要原因。因此，在研究初始Mn2+濃度的影響時，控制pH值為7.0。

圖1 不同pH值條件下的Mn2+、生物氧化錳 濃度變化及Mn2+轉(zhuǎn)化率Fig.1 Concentration variation of Mn2+, biogenic manganese oxides and Mn2+ conversion rate under different pH

2.1.2 初始Mn2+濃度的影響 不同初始Mn2+濃度下，Mn2+、生物氧化錳濃度變化及Mn2+轉(zhuǎn)化率見圖2。反應(yīng)7 d后體系的Mn2+及生物氧化錳濃度均達到穩(wěn)定，激活反應(yīng)完成。初始Mn2+濃度為1 mmol/L時，7 d后Mn2+去除率達到92.4%，其中,90.15%轉(zhuǎn)化為生物氧化錳，Mn2+的氧化率達到83.3%，而初始Mn2+濃度為2.5 mmol/L時，雖然生物氧化錳的生成量最高，但其Mn2+的氧化率較低，因此，以激活反應(yīng)完成后Mn2+的氧化率作為衡量激活反應(yīng)效果的指標，初始Mn2+濃度為1 mmol/L時，MnOB激活效果最好。而當初始Mn2+濃度高于5 mmol/L時，Mn2+利用較差，MnOB受到極大的抑制，此時MnOB激活失敗。崔馨文[20]對來自好氧污泥的MnOB進行Mn2+抗性研究時發(fā)現(xiàn)，地衣芽胞桿菌(Bacillusmegaterium)及巨大芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)在Mn2+濃度高于8 mmol/L時均不能生長。Zhou等[19]發(fā)現(xiàn)高濃度Mn2+對海洋沉積物中MnOB同樣有抑制作用，這與試驗結(jié)果一致。

圖2 不同初始Mn2+濃度下Mn2+、生物氧化錳 濃度變化及Mn2+轉(zhuǎn)化率Fig.2 Concentration variation of Mn2+, biogenic manganese oxides and Mn2+ conversion rate under different

2.2 生物氧化錳的XRD表征

XRD測試結(jié)果如圖3所示。樣品的2θ角特征峰出現(xiàn)在19.823°、20.962°、26.580°、36.501°、34.776°、59.890°等處。通過與相應(yīng)礦物的標準XRD卡片進行對比可以確定，MnOB激活產(chǎn)生的生物氧化錳主要包含MnO2、Na3Mn(PO3)CO3、Mn3O4等化合物。Zhou等[19]在對海洋沉積物中的MnOB生成的生物氧化錳進行XRD分析時，也發(fā)現(xiàn)了Na3Mn(PO4)CO3。Chubar等[22]研究發(fā)現(xiàn)，Shewanella putrefaciens產(chǎn)生的Mn3(PO4)2、MnCO3會通過離子交換和表面絡(luò)合形成Na3Mn(PO3)CO3，這可能是生物氧化錳中未發(fā)現(xiàn)MnCO3的原因。

圖3 生物氧化錳XRD圖Fig.3 XRD schema of biogenic manganese

MnOB激活產(chǎn)生的生物氧化錳主要包含MnO2、Na3Mn(PO3)CO3、Mn3O4等化合物，與化學(xué)合成的氧化錳相比，生物錳氧化物具有更好的氧化和吸附能力[8]，另外，生物錳氧化物可以在錳氧化微生物作用下進行持續(xù)再生[15]，因此，生物錳氧化物在污染物的處理效果和成本上比化學(xué)合成錳氧化物更有優(yōu)勢。

2.3 微生物群落的變化

在最優(yōu)條件下，激活反應(yīng)前后各取適量生物樣品進行16SrDNA高通量測序，并對數(shù)據(jù)樣本進行alpha多樣性分析，以探究微生物多樣性的變化。微生物16SrDNA的alpha多樣性指數(shù)表見表1。由表1可以看出，激活反應(yīng)前后Chao指數(shù)、ACE指數(shù)及Shannon指數(shù)減小，Simpson指數(shù)增大，說明激活反應(yīng)前后群落的豐富度及多樣性均在下降。

表1 激活前后微生物16SrDNA的α多樣性指數(shù)表Table 1 α diversity index of microbial 16SrDNA before and after stimulation

為了確定主導(dǎo)生物氧化錳生成的微生物，對比了相對豐度顯著提高的屬與目前已知存在MnOB的菌屬。結(jié)果表明，激活反應(yīng)后有9種菌屬的相對豐度顯著提高，其中，有7種已證明存在的MnOB屬，包括變形菌門中的氣單胞菌屬[23](Aeromonas)、假單胞菌屬[24](Pseudomonas)、不動桿菌屬[25](Acinetobacter)、厚壁菌門中的芽孢桿菌屬[24](Bacillus)、微桿菌屬[26](Exiguobacterium)、擬桿菌門中的黃桿菌屬[27](Flavobacterium)、鞘氨醇桿菌屬[26](Sphingobacterium)，上述菌屬的相對豐度變化情況見圖4。其相對豐度在激活反應(yīng)后分別增加了7.2%、1.34%、1.1%、0.75%、2.96%、2.33%、1.47%，總相對豐度由0.74%增加至17.89%，這表明試驗成功激活了環(huán)境樣本中的MnOB。此外，兩種未報道存在MnOB的菌屬，包括變形菌門的從毛單胞菌屬(Comamonas)和嗜氫菌屬(Hydrogenophaga)，其相對豐度在激活反應(yīng)后也顯著增加，分別從0.06%、0.5%增加到1.60%、0.83%，說明這兩個屬中也可能存在可以氧化Mn2+的細菌，也可能是兩個屬中存在對高濃度Mn2+較為耐受的微生物。

圖4 屬水平MnOB相對豐度變化Fig.4 Relative abundance variation of MnOB

2.4 生物氧化錳去除EE2

2.4.1 pH值的影響 圖5為不同pH值條件下EE2的去除情況。圖中，pH值為4.0時，試驗組(生物氧化錳+生物相)對EE2的去除率達到97.7%，其中，生物氧化錳的貢獻率達到76.9%，去除效果最好。隨著pH值的升高，試驗組對EE2的去除效果逐漸變差，pH值為8.0時生物氧化錳對EE2的去除效果顯著降低，這與郭淑文[28]和孔祥震[29]的研究結(jié)果一致。這可能是由于pH值的增加會降低錳氧化物的表面電子轉(zhuǎn)移速率及產(chǎn)物脫附速率。此外，由于生物氧化錳對EE2的去除可能引起EE2從生物相解吸附，這可能解釋了試驗組初始階段EE2濃度的上升。

圖5 不同pH值條件下試驗組、對照組對EE2的去除 效果和二者對EE2的去除率Fig.5 Removal efficiency of EE2 by experimental groups, control groups and removal rate under

2.4.2 生物氧化錳投加量的影響 基于試驗結(jié)果，在研究生物氧化錳投加量的影響時，控制pH值為4.0。圖6為不同生物氧化錳投加量下EE2的去除情況。試驗結(jié)果表明，生物氧化錳投加量為20 mg/L時，試驗組(生物氧化錳+生物相)對EE2去除效果最好,去除率達到97.7%，其中生物氧化錳的貢獻率為76.9%。生物氧化錳投加量越大，試驗組去除率越大，生物氧化錳對EE2去除的貢獻率也越大，這是由于投加量的增加會增加去除反應(yīng)結(jié)合位點，促進反應(yīng)的進行。與之類似，生物氧化錳的增加同樣增加了生物相的質(zhì)量，因此，提高了生物相對EE2的吸附率。

圖6 不同生物氧化錳投加量下試驗組、對照組對EE2 的去除效果及二者對EE2的去除率Fig.6 Removal efficiency of EE2 by experimental groups, control groups and removal rate under different biogenic manganese oxides

3 結(jié)論

從氧化溝好氧段污泥中能夠激活富集得到錳氧化菌群。當培養(yǎng)條件pH值為7.0、初始Mn2+濃度為1 mmol/L時，MnOB的激活效果最好，其對Mn2+的氧化率能夠達到90.15%。生成的生物氧化錳主要包含MnO2、Na3Mn(PO3)CO3、Mn3O4等3種物質(zhì)。激活反應(yīng)后，7個已知存在的MnOB屬，包括芽孢桿菌屬、微桿菌屬、氣單胞菌屬、假單胞菌屬、不動桿菌屬、黃桿菌屬、鞘氨醇桿菌屬，豐度顯著提高，激活反應(yīng)后，其總豐度達到17.89%。pH值為4.0、生物氧化錳投加量為20 mg/L時，EE2的去除效果最好，48 h后試驗組(生物氧化錳+生物相)對EE2的去除率可達97.7%，其中生物氧化錳的貢獻率達到76.9%。在中性條件下，試驗組對EE2的去除率低于酸性條件，但仍可以達到85%，這為生活污水中的EE2的去除提供了一個高效可行的方向。