鄧開開，李奕璇，方芳，陳彬，王偉，先宇，郭勁松

(重慶大學(xué) 環(huán)境與生態(tài)學(xué)院；三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，重慶400045)

氮、磷等營養(yǎng)鹽大量輸入相對靜止水體會導(dǎo)致富營養(yǎng)化并誘導(dǎo)水華的暴發(fā)，降低水體的生物多樣性，對水生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生負面影響[1]。影響藻類水華暴發(fā)的重要因素包括營養(yǎng)鹽、氣象要素(如溫度、光等)、水文條件和浮游動物捕食等[2-3]。在眾多因素中，水體營養(yǎng)鹽水平是水華爆發(fā)的決定因素[4]，其供給量及其變化影響著藻類生物量和凈生產(chǎn)力[5]。營養(yǎng)鹽供給量不僅影響藻類ATP的合成[6-7]，還影響蛋白質(zhì)組成[8]。目前，關(guān)于營養(yǎng)鹽對藻類生長的計量性研究主要在實驗室條件下開展。相關(guān)研究采用不同濃度的營養(yǎng)鹽培養(yǎng)不同的純藻種(藍藻、綠藻、硅藻等)，以解析影響與調(diào)控的機理。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)N/P為200時，能有效控制藍藻的生長[9]。然而，實驗室內(nèi)得出的結(jié)果往往與自然條件下存在差異，在實驗室條件下，一些細小的差距會被放大[10]。例如，Vitousek等[11]認為沒有單個因素可以維持藍藻的生存，甚至有學(xué)者發(fā)現(xiàn)微囊藻的密度與營養(yǎng)鹽濃度之間沒有任何相關(guān)性[12]。為了縮小室內(nèi)和野外觀測之間存在的差距，需要進行原位受控實驗。原位受控實驗以原位條件得到的結(jié)果更能反映受控因素對研究對象的實際影響[13-14]。

三峽水庫是世界上最大的水利工程，庫容約為39.3×108m3 [15]。自蓄水以來，三峽水庫的水動力條件發(fā)生了很大的變化，導(dǎo)致部分支流回水區(qū)營養(yǎng)鹽濃度過高，富營養(yǎng)化程度增加[16]。許多學(xué)者已經(jīng)就三峽水庫水華形成進行了多方面的研究。通過野外監(jiān)測，探究了水華形成與環(huán)境變量間的統(tǒng)計關(guān)系：主要圍繞降雨[17-18]、氮磷[19]、光照[20]、溫度[21]、電導(dǎo)率[22]等環(huán)境變量展開，通過建立模型[19, 23]預(yù)測藻類對環(huán)境變量的響應(yīng)；或在實驗室內(nèi)模擬環(huán)境變量對藻類生長的影響機理，如N、P[24]、Ca2+[25]、溫度[19]、流速[20]等環(huán)境參量的受控變化；為使藻類生長環(huán)境更加接近自然環(huán)境，學(xué)者們設(shè)計了不同的原位裝置以探究藻類的形成：秦镕聰?shù)萚26]利用透光性的半封閉的原位培養(yǎng)桶，得出了三峽庫區(qū)典型優(yōu)勢藻的細胞N∶P比，李哲等[27]利用流速實驗槽在原位條件下探究了流速對澎溪河藻類原位生長速率的影響。隨著研究的逐漸深入，原位和室內(nèi)實驗條件下藻類與環(huán)境變量之間的關(guān)系愈加明晰，但利用原位受控實驗探究藻類形成機理的研究仍有待深入。

為了研究在環(huán)境因素協(xié)同影響下營養(yǎng)鹽對藻類生長產(chǎn)生影響的程度，以三峽水庫的典型支流——澎溪河中的原生藻類群落作為實驗和研究的對象，在2019年4月—6月的水華暴發(fā)期進行了3種不同類型的原位受控實驗(磷實驗、高氮實驗、低氮實驗)，并對澎溪河原水和原位裝置中的化學(xué)指標(biāo)、生物指標(biāo)進行監(jiān)測。在探究營養(yǎng)鹽對藻類生長影響的基礎(chǔ)上，與外界環(huán)境因子對藻類生長的影響相結(jié)合，運用化學(xué)計量學(xué)方法和相關(guān)性分析，揭示了3種不同受控實驗下藻類葉綠素a(Chl.a)形成不同變化趨勢的原因，以闡明營養(yǎng)鹽在自然背景下對Chl.a的變化造成影響的程度，為水華形成機理的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況

研究站點為澎溪河的高陽平湖(30°49′24″N—31°42′59″N，107°56′35″E—108°54′18″E)，見圖1。澎溪河流域氣候?qū)俦被貧w線以北的亞熱帶濕潤氣候，季風(fēng)明顯，四季分明，年平均氣溫為17.5 ℃，年平均降水量為1 545.1 mm[28]。流域面積約為5 172 km2，是三峽庫區(qū)中段北岸最大的支流[26]。高陽平湖是庫區(qū)直接與干流相接的最大湖面，該處水面變寬，水體流速降低，是近年水華暴發(fā)最頻繁的區(qū)域。

圖1 澎溪河回水區(qū)及高陽平湖示意圖[29]Fig.1 Backwater area of the Pengxi River and Lake

1.2 原位實驗裝置

原位實驗裝置如圖2所示。裝置由1個大的培養(yǎng)箱體、4個通風(fēng)孔、1個透明箱蓋、4個固定臂、4個水體交換管和多個小孔組成。箱體底部半徑為0.15 m，高度為0.8 m，體積為56.52 L。頂部4個通風(fēng)孔的半徑為0.04 m。水體交換管的半徑為0.05 m。

圖2 原位裝置及現(xiàn)場實驗圖Fig.2 Sketch map of the incubation devices and scene photographs of in situ

為了防止裝置下沉，裝置外部設(shè)計了固定臂，方便其固定在浮排上。與李哲等[27]設(shè)計的裝置相比，增加了水體交換管和內(nèi)層小孔。水體交換管管口處設(shè)置了可拆卸的雙層夾板和中間夾膜，進行水體交換時更換為附帶小孔的夾板和透水尼龍膜。實驗期間換為無孔夾板，以隔絕外界水體交換作用。裝置壁的小孔用有機玻璃覆蓋，實驗期間小孔不與外界連通，它的作用是使裝置內(nèi)部不平坦，以減少藻類沾壁。通風(fēng)孔有兩個作用，一是使裝置內(nèi)外空氣得以交換，二是防止雨水、雜物落入裝置造成裝置內(nèi)局部污染。與秦镕聰?shù)萚26]的裝置材料不同，該裝置采用的有機玻璃材料具有透光性好、機械強度高的特點。

實驗開始前，將澎溪河原水及該時刻水中的原生藻類群落一同加入培養(yǎng)裝置中，將裝置置于浮排周圍的水體中。用裝置外纏繞的繩索將裝置固定于浮排上，以此保障實驗期間裝置內(nèi)除了添加的實驗影響因子外，其他均與周邊環(huán)境一致。

1.3 實驗組設(shè)計

實驗分為兩個部分：一部分對澎溪河現(xiàn)場指標(biāo)進行原位監(jiān)測，另一部分則利用自主設(shè)計的原位裝置在現(xiàn)場進行原位受控實驗。藻類取自澎溪河原水，與原水共同注入原位裝置中，最后裝置內(nèi)液體總體積為39 L(圖2)。

設(shè)計了3種不同類型的實驗。其中一組為磷實驗組，由于氮濃度變化范圍較寬，設(shè)計了兩組氮實驗組，分別為高氮組和低氮組。通過添加KH2PO4和NaNO3來控制原位裝置中磷濃度和氮濃度，實驗組的濃度均在澎溪河常年監(jiān)測到的營養(yǎng)鹽濃度范圍內(nèi)[30]。每組實驗共設(shè)計了4個濃度梯度，分別在5個裝置中同步進行(其中1個為空白組)，在實驗進行的同時，同步測定澎溪河原水的水樣。磷實驗組的加磷濃度分別為0.03、0.06、0.09、0.12 mg/L；高氮實驗組的加氮濃度分別為0.30、0.60、1.20、1.80 mg/L；低氮實驗組的加氮濃度分別為0.09、0.18、0.27、0.36 mg/L。由于原位條件以及實驗平臺承載力的限制，裝置設(shè)置為5個，在采樣及處理過程中，設(shè)置了3組平行結(jié)果，實驗周期為7 d。

1.4 樣品監(jiān)測方法

實驗采集了澎溪河水體和原位裝置中的水樣，測試了系列水質(zhì)和生物質(zhì)指標(biāo)。溶解氧濃度和水溫通過溶解氧儀在現(xiàn)場測定(YSI ProODO，Xylem，USA)；pH值等通過多參數(shù)水質(zhì)儀(WQC-30，DKK，Japan)在現(xiàn)場測定。采集的水樣均用聚乙烯瓶分裝并于4 ℃冷藏，帶回實驗室立即進行相關(guān)水質(zhì)指標(biāo)測定。測定的化學(xué)指標(biāo)包括總氮(TN)[31]、總磷(TP)[32]。溶解性總氮(TDN)、溶解性總磷(TDP)濃度測定時，先將水樣經(jīng)GF/F(Whatman，Anpel，China)玻璃纖維濾膜(直徑47 mm，孔徑為0.7 μm)過濾；測定的生物指標(biāo)為Chl.a和浮游植物群落。浮游植物群落測定需要將采集的水樣裝入塑料瓶后，加入10 mL魯哥試劑固定。在所有的指標(biāo)中，TN、TP、TDN、TDP、Chl.a均利用分光光度法測定(Chl.a需先加入丙酮在冰箱中放置24 h)[33]。

1.5 計算公式

裝置內(nèi)的化學(xué)指標(biāo)及生物指標(biāo)扣除背景的修正值通過式(1)計算。

y=y*+(y河-y0)

(1)

式中：y為裝置內(nèi)化學(xué)指標(biāo)及生物指標(biāo)的修正值(若為營養(yǎng)鹽或葉綠素濃度，則單位為mg/L；若為水溫，則單位為℃)；y*為測定的裝置內(nèi)的化學(xué)指標(biāo)及生物指標(biāo)值；y河為同一時刻測定的澎溪河水中的化學(xué)指標(biāo)及生物指標(biāo)值；y0為同一時刻測定的空白裝置內(nèi)化學(xué)指標(biāo)及生物指標(biāo)值。

用Chl.a代表藻類的生物量，藻類比生長速率計算如式(2)所示[34]。

μ=ln(x2/x1)/t

(2)

式中：μ為藻類的比生長速率，d-1；x1為Chl.a當(dāng)日開始時的濃度，mg/L；x2為Chl.a在t時刻的濃度，mg/L；t為培養(yǎng)時間，d。

藻類質(zhì)量利用Kasprzak等[35]建立的Chl.a與細胞質(zhì)量之間的關(guān)系模型進行計算。

0.229(logBMcount)2-0.040(logBMcount)3

(3)

式中：Chl.a的單位為mg/L;BMcount為細胞質(zhì)量，mg/L。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)利用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析：采用單因素分析(P<0.05時具有差異，P<0.01時具有顯著差異)來說明方差相同的數(shù)據(jù)間差異顯著性。采用Kruskal-Wallis分析(K-W)說明方差不同的數(shù)據(jù)間差異顯著性。采用Pearson相關(guān)性分析說明環(huán)境因素之間的相關(guān)關(guān)系(相關(guān)系數(shù)用r表示，相關(guān)系數(shù)在0.4～0.5之間代表強相關(guān)，相關(guān)系數(shù)在0.5～1之間代表極強相關(guān))。

2 結(jié)果與分析

2.1 營養(yǎng)鹽對藻類生長的影響

2.1.1 磷元素對藻類生長的影響 實驗設(shè)置5個不同磷濃度(原水、0.03、0.06、0.09、0.12 mg/L)對澎溪河藻類進行培養(yǎng)，磷對藻類生長的影響實驗結(jié)果如圖3(a)、(b)所示。如圖3(a)所示，在實驗初期，原水與實驗組的Chl.a平均濃度均為0.04 mg/L。在實驗結(jié)束后(第7天)，原水與實驗組中的Chl.a含量呈下降趨勢，在第7天，凈投磷濃度為0.06 mg/L時Chl.a的濃度最低，為初始濃度的4.24%。但單因素方差分析表明，各磷濃度實驗組間Chl.a差異不顯著(P>0.05)。如圖3(b)所示，實驗期間比生長速率大多為負值。

2.1.2 氮元素對藻類生長的影響 氮實驗分為低氮實驗組與高氮實驗組，共設(shè)計了10個不同氮濃度對澎溪河原位藻類進行培養(yǎng)：其中，高氮實驗組的氮濃度分別為原水、0.30、0.60、1.20、1.80 mg/L；低氮實驗組的氮濃度分別為原水、0.09、0.18、0.27、0.36 mg/L。

高濃度氮對藻類生長的影響實驗結(jié)果如圖3(c)、(d)所示。在實驗初期，原水與實驗組的平均Chl.a濃度為0.06 mg/L。在實驗期間各實驗組中的藻類生物量先上升后下降，且實驗組中的藻類生物量顯著小于(P<0.05)原水中的藻類生物量。原水中的Chl.a含量在所有組別中第4天達到最大值，為初始平均濃度的10.37倍。Chl.a在4個實驗組中的濃度無顯著差異(P>0.05)，但顯著小于原水中的濃度(P<0.01)。

低濃度氮對藻類生長的影響如圖3(e)、(f)所示。在實驗初期，原水與實驗組的平均Chl.a為0.88 mg/L，實驗期間Chl.a濃度呈下降趨勢。在實驗結(jié)束時，原水與實驗組的平均濃度Chl.a下降為初始平均濃度的10.92%，為0.10 mg/L。Chl.a在5個組別中的濃度無顯著差異(P>0.05)。

圖3 不同實驗條件下Chl.a和比生長速率變化(誤差棒代表3組樣本的方差(±1SD) Chl.a(o，i，m，n

2.2 藻類生長所需的最低營養(yǎng)鹽濃度值

利用化學(xué)計量學(xué)方法判斷實驗期間是否存在營養(yǎng)鹽不足以支持藻類生長的現(xiàn)象。以式(3)為基礎(chǔ)，結(jié)合Stumm等[36]得出的微藻計量化學(xué)關(guān)系，同時類比一般藻類光合作用反應(yīng)機理，得到微藻的光合作用反應(yīng)式為

C106H263O110N16P+138O2+154H2O

(4)

根據(jù)式(3)中Chl.a與藻細胞質(zhì)量的關(guān)系式，得到的質(zhì)量值如表1所示：1)在磷實驗期間，原水中藻細胞質(zhì)量的起始值為1.66 mg/L；在實驗組中，當(dāng)磷凈添加濃度分別為0.03、0.06、0.09、0.12 mg/L時，藻細胞的起始質(zhì)量值分別為1.68、1.67、1.67、1.67 mg/L。2)在高氮實驗期間，原水中的藻細胞質(zhì)量起始值為1.72 mg/L；在實驗組內(nèi)，當(dāng)?shù)獌籼砑訚舛确謩e為0.3、0.6、1.2、1.8 mg/L時，藻細胞的質(zhì)量起始值分別為1.70、1.72、1.69、1.70 mg/L。3)在低氮實驗期間，原水中藻細胞質(zhì)量的起始值為4.97 mg/L；在實驗組內(nèi)，當(dāng)?shù)獌籼砑訚舛确謩e為0.09、0.18、0.27、0.36 mg/L時，藻細胞的質(zhì)量起始值分別為5.02、4.77、4.77、4.86 mg/L。

表1 藻類生長所需的最低營養(yǎng)鹽值Table 1 Minimum nutrient concentrations required for algae growth

將上述得到的質(zhì)量值代入式(4)即得到藻類生長所需的最低營養(yǎng)鹽濃度值，計算結(jié)果如表2所示。

1)磷實驗期間，原水和實驗組內(nèi)營養(yǎng)鹽濃度滿足藻類生長所需的最低營養(yǎng)鹽濃度：藻類在原水及實驗組內(nèi)生長所需最低磷濃度值(以KH2PO4計，下同)為0.06 mg/L，氮濃度值(以NaNO3計，下同)為0.64 mg/L。表2顯示磷實驗期間原水的總磷濃度值為0.06 mg/L，總氮濃度值為1.83 mg/L；4個實驗組內(nèi)的平均總磷濃度范圍為0.09～0.16 mg/L，總氮濃度范圍為2.22～2.88 mg/L。說明磷實驗期間營養(yǎng)鹽濃度范圍滿足藻類生長所需的最低營養(yǎng)鹽濃度。

2)高氮實驗期間，原水和實驗組內(nèi)營養(yǎng)鹽濃度滿足藻類生長所需的最低營養(yǎng)鹽濃度：高氮實驗期間，原水中藻類生長所需的最低磷濃度為0.07 mg/L，最低氮濃度為0.66 mg/L；在實驗組中，當(dāng)凈投氮濃度分別為0.3、0.6、1.2、1.8 mg/L時，藻類生長所需的最低磷濃度分別為0.07、0.07、0.06、0.07 mg/L，所需的最低氮濃度值分別為0.65、0.66、0.65、0.65 mg/L。表2顯示高氮實驗期間原水的總磷濃度值為0.20 mg/L，總氮濃度值為2.26 mg/L；而實驗組內(nèi)的平均總磷濃度范圍為0.17～0.18 mg/L，總氮濃度范圍為2.99～4.33 mg/L。說明高氮實驗期間營養(yǎng)鹽濃度值范圍滿足藻類生長所需的最低營養(yǎng)鹽濃度。

3)低氮實驗期間，原水和實驗組內(nèi)的氮濃度基本滿足藻類生長所需最低氮濃度，但磷濃度不滿足藻類生長所需的最低磷濃度：藻類在原水中生長所需的最低磷濃度值為0.19 mg/L，最低氮濃度值為1.90 mg/L；對于實驗組，當(dāng)凈投氮濃度分別為0.09、0.18、0.27、0.36 mg/L時，藻類生長所需的最低磷濃度值為0.19、0.18、0.18、0.19 mg/L，所需的最低氮濃度值為1.92、1.83、1.83、1.86 mg/L。表2結(jié)果顯示，低氮實驗期間，原水中的總磷濃度值為0.10 mg/L，總氮濃度值為1.73 mg/L；而實驗組內(nèi)的平均總磷濃度值均為0.11 mg/L，總氮濃度范圍為1.88～2.49 mg/L。說明低氮實驗期氮濃度范圍部分滿足藻類生長所需的最低氮濃度，而磷濃度范圍不滿足藻類生長所需的最低磷濃度。

表2 實驗期間營養(yǎng)鹽濃度和環(huán)境因素測試值Table 2 General nutrient concentrations and environmental conditions for the Pengxi River during the experimental period

綜上所述，磷實驗、高氮實驗期間的氮、磷濃度均足以支持藻類生長，而低氮實驗期間的磷濃度不足以支持藻類的生長。

2.3 實驗期間藻種組成

實驗期間藻類細胞豐度如圖4所示。磷實驗期間共監(jiān)測到4門16種，其中，藍藻門2種，綠藻門10種，硅藻門3種，甲藻門1種。高氮實驗期間共監(jiān)測到4門9種，其中，藍藻門1種，綠藻門3種，硅藻門3種，甲藻門2種。低氮實驗期間監(jiān)測到4門16種，其中，藍藻門4種，綠藻門8種，硅藻門2種，甲藻門2種。

圖4 實驗期間藻類種類組成Fig.4 Species composition of algae under different

磷實驗期間的原水及實驗組內(nèi)的優(yōu)勢藻為微囊藻屬和小球藻屬(圖4(a))，平均值分別占總數(shù)的50.45%和40.29%。高氮實驗期間的原水及實驗組內(nèi)的優(yōu)勢藻為微囊藻屬和小球藻屬(圖4(b))，平均值分別占總數(shù)的63.53%和22.79%。低氮實驗期間原水及實驗組內(nèi)的優(yōu)勢藻為微囊藻(圖4(c))，平均值占總數(shù)的86.65%。

值得注意的是，原水與實驗組的細胞豐度差異不顯著(ANOVA，P>0.05)，且在低氮實驗期間微囊藻的細胞豐度最大。

3 討論

3.1 溫度對藻類生長的影響

溫度是影響藻類生物量的關(guān)鍵因素之一[37]，它不僅影響脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的合成，細胞代謝和藻類細胞的光合作用[5]，還會通過改變藻類細胞膜通透性來影響它們對營養(yǎng)鹽的吸收能力[38]。溫度過低將嚴重影響藻類的生長。實驗結(jié)果表明，磷實驗和高氮實驗期間的優(yōu)勢藻為藍藻(微囊藻)和綠藻(小球藻)，而低氮實驗期間的優(yōu)勢藻類為藍藻(微囊藻)。適合藍藻生長的溫度范圍為22～23.7 ℃[14]，而小球藻則在16～25 ℃的溫度范圍內(nèi)生長較快[39]。磷實驗期間和高氮實驗期間內(nèi)的適宜溫度范圍使得小球藻和微囊藻成為此時的優(yōu)勢藻。氮是藻類遺傳物質(zhì)合成和生長的必要物質(zhì)，氮營養(yǎng)鹽的缺乏會降低藻細胞葉綠素a含量，最終導(dǎo)致藻類光合作用效率降低[35]。因此，氮濃度較低會降低微囊藻和小球藻的細胞生長速率，且由于氮缺乏對小球藻的抑制更強，最終使微囊藻成為低氮組中的優(yōu)勢藻。

另外，觀察到Chl.a與水溫在磷實驗期間具有明顯的相關(guān)性(rchl.a-水溫=0.82)，但同樣的情況沒有出現(xiàn)在高氮實驗與低氮實驗中。導(dǎo)致相同的兩個因素相關(guān)性在不同條件下結(jié)果不一致的潛在原因包括：(a)兩種因素在理論上不相關(guān)；(b)兩種因素的相關(guān)性是由其他因素作為中間橋梁建立起來的；(c)對于復(fù)雜的系統(tǒng)，變化因素受到多種因素的沖突影響[40]；(d)兩種因素之間的相關(guān)性需要滿足一定的條件[41]。

水溫與Chl.a在磷實驗期間相關(guān)，而在氮實驗中不相關(guān)應(yīng)是由(c)和(d)兩種原因引起的：

1)原因(c)是引起氮實驗期間Chl.a與水溫不相關(guān)的一個原因。荀尚培等[42]的研究得出外源的匯入、水環(huán)境的不穩(wěn)定都會導(dǎo)致葉綠素與水溫的相關(guān)性程度不高。本實驗為原位實驗，且主要受控因素為外源營養(yǎng)鹽濃度：在高氮實驗期間，葉綠素濃度與TP高度相關(guān)(rchl.a-TP=0.88)，在低氮實驗期間，葉綠素濃度與TN高度相關(guān)(rchl.a-TN=-0.50)。因此，在氮實驗期間，水溫與Chl.a濃度間沒有明顯相關(guān)性的一個潛在原因是其他環(huán)境因子對葉綠素濃度造成的影響更大，而導(dǎo)致了水溫與葉綠素濃度相關(guān)性不高。

2)原因(d)是引起氮實驗期間Chl.a與水溫不相關(guān)的另一個原因。只有當(dāng)溫度是限制藻類生長的一個決定性因素時，溫度與Chl.a間才會具有強烈的相關(guān)性[42]。與磷實驗相比，氮實驗的溫度相對較高(表2)，也更適合微囊藻和小球藻的生長，因此，氮實驗中限制藻類生長的決定性因素并不是水溫。

上述結(jié)果說明，在氮實驗中藻類生長的限制性因素并不是溫度，而是其他因素。而與氮實驗相比，磷實驗期間Chl.a與水溫具有較高的相關(guān)性。

將磷實驗期間的Chl.a濃度和水溫進行非線性擬合，結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明，當(dāng)溫度大于20 ℃時，藻類生物量表現(xiàn)出明顯的增長趨勢，這一結(jié)果與之前學(xué)者得出的結(jié)論接近[39]。但是磷實驗期間，實驗組和原水的平均水溫為19.86 ℃，低于20 ℃。因此，只有在溫度低于藻類最適生長溫度的情形下，Chl.a和水溫之間的相關(guān)性才會顯著。

圖5 磷實驗期間水溫與Chl.a的非線性擬合結(jié)果Fig.5 Linear relationship between water temperature and Chl.a. (Error bars represent ±1SD of samples around this point)

3.2 藻類所需的最適營養(yǎng)鹽濃度值

藻類生長所需的最低營養(yǎng)鹽濃度值實驗結(jié)果表明，磷實驗期間與高氮實驗期間，藻類生長環(huán)境的營養(yǎng)鹽濃度滿足藻類生長所需的最低營養(yǎng)鹽濃度值，但高氮實驗組中的藻類生物量明顯低于原水，因此，需要探究是否是因為營養(yǎng)鹽濃度過高抑制了藻類生長。

首先需要判斷兩種實驗期間的限制性底物。判定限制性底物的第1種方法為Monod等[43]提出的比生長速率與營養(yǎng)鹽濃度之間的相關(guān)性理論：若某種營養(yǎng)鹽與比生長速率相關(guān)，則藻類生長受到該營養(yǎng)鹽的限制(下文簡稱Monod法)；第2種方法為Redfield等[44]提出的N∶P比理論值：當(dāng)N∶P>16時，藻類生長受磷限制；當(dāng)N∶P<16時，藻類生長受氮限制；當(dāng)N∶P=16時，藻類生長受氮和磷的共同限制(下文簡稱Redfield法)。

在磷實驗期間，實驗組內(nèi)平均N∶P比的最小值為37.05>16(表2)，表明磷是此時的限制性底物[44]。但沒有觀察到比生長速率與總磷之間具有顯著相關(guān)性(rμ-TP=0.07)，這是因為此時水溫對藻類生長有更強烈的影響(rchl.a-水溫=0.82)，導(dǎo)致總磷與比生長速率之間的相關(guān)性被削弱。

在高氮實驗期間，實驗組內(nèi)平均N∶P比的最小值為40.62>16(表2)?？偭住⒄姿猁}與藻類比生長速率三者中兩兩之間均具有明顯的相關(guān)性(rμ-TP=0.77，r正磷酸鹽-TP=0.98，rμ-正磷酸鹽=0.73)。根據(jù)Redfield法和Monod法，磷(主要是正磷酸鹽)是此時的限制性底物。

在低氮實驗期間，實驗組內(nèi)平均N∶P比的最小值為27.60>16(表2)。Monod法表明比生長速率與總氮(rμ-TN=0.43)、總磷(rμ-TP=0.72)均具有一定的相關(guān)性，說明低氮實驗階段藻類生長可能受到氮和磷的共同限制，且磷對藻類生長的限制高于氮，此時藻類生長可能處于兩種營養(yǎng)鹽轉(zhuǎn)換的過渡階段，N∶P值被認為是最適N∶P值[45]，且該值會隨著生境變化而改變[46]，說明澎溪河藻類生長的最適N∶P范圍為27.60～36.53，可近似判斷該值為4個實驗組內(nèi)的N∶P平均值，即32.52。另外，觀察到比生長速率與正磷酸鹽具有強烈相關(guān)性(rμ-正磷酸鹽=0.68)，而TDN與總氮具有強烈相關(guān)性(rTDN-TN=0.92)，即說明低氮實驗期間引起磷限制的營養(yǎng)鹽為正磷酸鹽，引起氮限制的營養(yǎng)鹽為TDN。

綜上，磷是磷實驗、高氮實驗期間的限制性底物，而氮和磷都是低氮實驗期間的限制性底物，且澎溪河藻類生長的最適N∶P比約為32.52。

應(yīng)當(dāng)注意到，磷是3種實驗條件共同的限制性底物。當(dāng)營養(yǎng)鹽為限制性底物時，藻類生長與營養(yǎng)鹽濃度具有相關(guān)性，據(jù)此建立了TP和Chl.a的非線性擬合模型。非線性擬合結(jié)果表明，當(dāng)TP為0.12 mg/L時，Chl.a將達到最大值。根據(jù)最適N∶P比為32.52，可以得出當(dāng)TN為限制性底物且值為2.44 mg/L時，Chl.a將達到最大值。

圖6模擬曲線的結(jié)果表明，營養(yǎng)鹽超過了最適值后，藻類生物量會隨著營養(yǎng)鹽濃度升高而下降。表3列出了每組實驗中超出了最適TN、TP值的實驗個數(shù)所占的比例，結(jié)果表明，高氮實驗中磷濃度、氮濃度超過最適值所占比例最大。

圖6 多項式擬合ln(TP)與ln(Chl.a)的非線性關(guān)系結(jié)果Fig.6 Linear relationship between ln(TP) and ln (Chl.a) (Error bars represent ±1SD of samples

表3 營養(yǎng)鹽高于藻類生長的最適營養(yǎng)鹽濃度的實驗占比Table 3 Ratio of nutrient concentration higher than the suitable concentration for algae growth during the experimental period

3.3 藻類群落結(jié)構(gòu)的變化

在特定的時空條件下，一定范圍內(nèi)營養(yǎng)鹽濃度的增加會促進藻類生長并改變藻類的群落結(jié)構(gòu)。為了明確藻類群落變化與營養(yǎng)鹽濃度的相關(guān)性，對藻類群落的變化進行Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果如圖7所示。

在磷實驗期間(圖7(a))，藻類的生物量與種類隨著磷濃度的升高而升高，其中與溫室效應(yīng)、富營養(yǎng)化密切相關(guān)的微囊藻和小球藻是各實驗組中的優(yōu)勢藻類。磷實驗結(jié)束后，微囊藻屬與衣藻屬(P=-0.17)、顆粒直鏈藻屬(P=-0.22)、顫藻屬(P=-0.21)、和針桿藻屬(P=-0.20)呈負相關(guān)性(0.05<|p|<0.5)，微囊藻屬與集星藻屬(P=-0.08)呈顯著負相關(guān)性(0.01<|p|<0.05)；小球藻屬與衣藻屬呈極顯著負相關(guān)性(0<|p|<0.01)，與顆粒直鏈藻(P=-0.12)和集星藻(P=-0.20)呈負相關(guān)性(0.05<|p|<0.5)。這一結(jié)果說明微囊藻和集星藻或小球藻和集星藻間會出現(xiàn)此消彼長的現(xiàn)象。觀察到只有磷實驗中存在這一現(xiàn)象，說明磷實驗與氮實驗中，不同環(huán)境條件是觸發(fā)這一現(xiàn)象的前提，而不同的環(huán)境條件主要表現(xiàn)在較低的溫度和磷濃度上(表2)，但目前還無法得到確切的證據(jù)，是否存在這一現(xiàn)象還需進一步研究驗證。

在高氮實驗過程中(圖7(b))，藻類的種類和生物量隨著氮濃度的升高而降低。此時，微囊藻和小球藻與其他藻類的相關(guān)性較弱。說明當(dāng)水體氮濃度高于藻類的生長需求時，藻類之間生長的相關(guān)性將不再受營養(yǎng)鹽的調(diào)控。

在低氮實驗過程中(圖7(c))，藻類的種類與生物量隨著氮濃度的升高而升高。與磷實驗相同，微囊藻屬與多甲藻屬(P=0.28)、與團藻屬(P=0.14)呈正相關(guān)性(0.05<|p|<0.5)；小球藻屬與團藻屬呈極顯著正相關(guān)性(P=0.007)(0<|p|<0.01)，與多甲藻藻屬(P=0.26)呈正相關(guān)性(0.05<|p|<0.5)。這一結(jié)果表明在低氮實驗條件下，團藻與多甲藻藻屬可能與微囊藻屬與小球藻屬存在共生關(guān)系。

圖7 屬水平藻類之間的皮爾森相關(guān)性分析Fig.7 Pearson correlation analysis between algae characteristics at genus

3.4 不同營養(yǎng)鹽對藻類的影響

在磷實驗過程中(圖8(a))，RDA第1軸和第2軸分別解釋了33.5%和16.8%的藻類活性與環(huán)境之間的關(guān)系，所有環(huán)境因子共能解釋藻類群落變異的50.1%。電導(dǎo)率對藻類活性的影響最大，為變異總數(shù)的11.3%；光照次之，為變異總數(shù)的10.5%；TN為變異總數(shù)的8.6%。研究發(fā)現(xiàn)，電導(dǎo)率是影響藻類群落結(jié)構(gòu)的重要環(huán)節(jié)因子，藻類活性隨著電導(dǎo)率的改變而出現(xiàn)明顯變異，但其他重要的環(huán)境因子未能與藻類活性產(chǎn)生明顯的相關(guān)性，可能是自然條件下環(huán)境因子之間存在復(fù)雜的相互作用，出現(xiàn)了類似重疊效應(yīng)的情況而難以區(qū)分主次。

在高氮實驗過程中(圖8(b))，RDA第1軸和第2軸分別解釋了30.5%和12.8%的藻類活性與環(huán)境的關(guān)系，所有環(huán)境因子共能解釋藻類群落變異的43.3%。光照強度是影響藻類活性的主要因素，為變異總數(shù)的9.7%；其次是TN，為變異總數(shù)的8.6%；然后是溫度，為變異總數(shù)的6.9%。光照強度往往會與溫度的變化密切相關(guān)，但因為光照強度與藻類光合作用密切相關(guān)，因此，常用來解釋其對藻類活性變化的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在高氮條件下，藻類活性最容易受到光照影響。因此，當(dāng)水中營養(yǎng)鹽的含量超過藻類生長所需閾值，光照強度將成為影響藻類活性的關(guān)鍵因素。

在低氮實驗過程中(圖8(c))，RDA第1軸和第2軸分別解釋了32.1%和16.6%的藻類活性與環(huán)境的關(guān)系，環(huán)境因子共能解釋藻類群落變異的48.7%。溫度是影響藻類活性變化的主要因素，為變異總數(shù)的10.6%；其次是Chl.a，為變異總數(shù)的9.3%。藻類活性會受到溫度影響，但若氮源不足，藻細胞就會進入內(nèi)源呼吸的狀態(tài)，以此維持自身代謝和光合作用，直至細胞衰亡；在藻細胞生長以及內(nèi)源呼吸的后期，藻細胞會分解Chl.a來為自身供能。因此，Chl.a為低氮條件下影響藻細胞活性的重要因素。

圖8 不同營養(yǎng)鹽對屬水平藻類活性的冗余分析(RDA)Fig.8 Redundancy analysis (RDA) of algae activity of different nutrients on genus

3.5 葉綠素變化趨勢機理分析

表3結(jié)果說明磷實驗與高氮實驗均存在部分營養(yǎng)鹽濃度超過最適濃度值的現(xiàn)象，且高氮實驗中營養(yǎng)鹽濃度超過最適營養(yǎng)鹽值占比大于磷實驗，但是兩種實驗類型下葉綠素的變化趨勢并不相同：高氮實驗葉綠素濃度呈先上升后下降的趨勢(圖3(b))，而磷實驗期間葉綠素呈下降趨勢。高氮實驗中實驗組內(nèi)葉綠素濃度的最大值低于原水中葉綠素濃度的最大值，但葉綠素變化趨勢一致，這是因為高濃度的氮會產(chǎn)生氧化脅迫，從而抑制藻類的光合作用并降低藻類的生物量[47-49]，且高濃度營養(yǎng)鹽只會降低藻類生物量的大小而不會改變變化趨勢。另外，磷實驗的營養(yǎng)鹽濃度水平雖然部分超過了最適營養(yǎng)鹽值，但明顯低于高氮實驗(表3)，這說明磷實驗期間藻類生物量趨勢的改變可能不是由高營養(yǎng)鹽而是溫度導(dǎo)致。

值得注意的是，盡管高濃度營養(yǎng)鹽也會抑制藻類的生長，但這種抑制程度會由于藻類自身的適應(yīng)能力被削弱，因為藻類能夠通過3種方式適應(yīng)環(huán)境變化：通過改變藻類群落構(gòu)成來應(yīng)對環(huán)境的改變[50]；通過浮力或者運動力調(diào)整自身在水中的位置[51]；通過改變自身細胞大小適應(yīng)周圍環(huán)境的變化[52]。

藻類生物量在高氮試驗和低氮實驗中變化趨勢也不同，高氮實驗期間實驗組內(nèi)營養(yǎng)鹽濃度大于藻類生長所需，而低氮實驗組內(nèi)的磷濃度略低于藻類生長所需的最低磷濃度范圍。說明與高氮實驗相比，低氮實驗期間中的磷濃度不足以支持藻類的生長。而Zhang等[53]的研究表明，營養(yǎng)鹽的缺乏會導(dǎo)致藻類代謝減慢并抑制藻類生長。因此，低氮實驗期間藻類生物量的下降趨勢是磷濃度過低引起的。

綜上所述，磷實驗期間藻類生物量下降的原因是水溫過低抑制了主要藻種的生長，模型計算結(jié)果表明，當(dāng)溫度高于20 ℃時才適合藻類生長。高氮實驗期間，實驗組內(nèi)生物量低于原水的原因是營養(yǎng)鹽濃度過高，但高營養(yǎng)鹽只改變了實驗組內(nèi)藻類生物量的大小而沒有改變生物量的變化趨勢。低氮實驗期間藻類生物量下降的原因是營養(yǎng)鹽濃度(主要是磷)過低，而不足以支持藻類生長。

因此，對于澎溪河，只有當(dāng)水溫高于20 ℃且營養(yǎng)鹽濃度高于藻類生物量化學(xué)計量學(xué)上的最低值時，藻類生物量才會呈現(xiàn)上升趨勢。另外，3種實驗結(jié)果說明，藻類生長會受到高營養(yǎng)鹽濃度、低營養(yǎng)鹽濃度、低水溫的抑制，且藻類對3種抑制條件的敏感性為：水溫/營養(yǎng)鹽過低>營養(yǎng)鹽濃度過高。

4 結(jié)論

以營養(yǎng)鹽濃度作為受控因素，以澎溪河原生藻類群落作為研究對象，利用自主設(shè)計的實驗裝置，探究了營養(yǎng)鹽對藻類影響程度，得出如下結(jié)論：

1)澎溪河藻類生長同時受到氮和磷兩種營養(yǎng)鹽限制時的N∶P比為32.52，這個比值也是澎溪河藻類生長的最適N∶P。澎溪河藻類生長的最適磷濃度值為0.12 mg/L，最適氮濃度值為2.44 mg/L。

2)當(dāng)澎溪河水中總氮濃度高于2.44 mg/L時，藻類的生長會受到抑制，但高營養(yǎng)鹽濃度只改變藻類生物量的大小而不改變藻類生物量的變化趨勢。

3)對于澎溪河的原生藻類，營養(yǎng)鹽濃度過高(氮濃度高于2.44 mg/L)、營養(yǎng)鹽濃度過低(低于化學(xué)計量學(xué)上藻類所需要最低營養(yǎng)鹽濃度)、水溫過低(低于20℃)均會抑制藻類的生長，且藻類對3種抑制條件的敏感性為：水溫/營養(yǎng)鹽濃度過低>營養(yǎng)鹽濃度過高。因此，澎溪河水華的暴發(fā)需要同時滿足溫度(水溫高于20 ℃)條件和營養(yǎng)鹽條件(氮、磷濃度高于化學(xué)計量學(xué)上藻類所需要的最低營養(yǎng)鹽濃度)。