張麗，牛麗麗，劉娜，張彥，樊靜

(衡水學(xué)院 應(yīng)用化學(xué)系，河北 衡水 053000)

茄子皮是成熟茄子植株的果皮，可藥食兩用，具有保護(hù)心血管、促進(jìn)消化、緩解便秘等作用[1]。茄子皮色素的主要成分為花青素[2]，花青素屬于類黃酮次級(jí)代謝物[3]，在植物防御方面也發(fā)揮著重要作用[4-5]，被用于抗氧化、抗衰老，有時(shí)也被用于預(yù)防心腦血管疾病。經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)有關(guān)茄子皮色素的提取方法多種多樣，主要有醇提法[6-8]：考慮溫度和pH對天然產(chǎn)物提取的影響；浸提法[9-11]：考慮提取劑的種類、濃度以及料液比對天然產(chǎn)物的影響，結(jié)果顯示，用酸性乙醇提取茄子皮色素效果較好；超聲法[12-15]：考察超聲時(shí)間、超聲溫度、超聲功率等條件對天然產(chǎn)物的影響；酶解法[16-17]：選取酶的條件為改變量來研究對天然產(chǎn)物提取的影響。鑒于用酶輔助超聲波提取茄子皮色素的報(bào)道甚少且不全面，所以采用酶輔助超聲波法，主要研究酶、超聲等相關(guān)條件對提取茄子皮色素的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

95%乙醇(分析純AR)：天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠；濃鹽酸(分析純AR)：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司。

722G可見分光光度計(jì) 上海儀點(diǎn)分析儀器有限公司；FW100高速萬能粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司；BL6-180A超聲波清洗機(jī) 上海比朗儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理

將買來的紫皮圓茄子削薄皮，將薄果皮分成小塊，放入45 ℃干燥箱中，干燥適當(dāng)?shù)臅r(shí)間后，用粉碎機(jī)粉碎3 min，再將其置于45 ℃干燥箱中備用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取純化的0.0412 g茄子皮色素完全溶解于pH 5的50%乙醇溶液中，然后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用pH 5的50%乙醇溶液定容至100 mL，分別用移液管移取5，10，15，20，25 mL至100 mL容量瓶中，用乙醇溶液分別定容至100 mL，在535 nm的波長下測定吸光度值。

由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo)為茄子皮色素的濃度(c，m/V)，縱坐標(biāo)為其吸光度值，得到回歸方程：Y=-0.00848+1.2649X，相關(guān)系數(shù)為R2=0.9937，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖1 色素標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.3 茄子皮色素的測定方法

準(zhǔn)確吸取1 mL的待測液，用分光光度計(jì)測樣品液的吸光度，重復(fù)3次，代入回歸方程計(jì)算出茄子皮色素的提取率。

式中：c表示提取液茄子皮色素質(zhì)量濃度，mg/mL；N表示稀釋倍數(shù)；V表示提取液總體積，mL；M表示樣品質(zhì)量，mg。

1.2.4 酶的選取

在3個(gè)錐形瓶中分別加入0.5 g干燥的茄子皮粉末，編號(hào)備用。依次為不加酶，添加0.12 g的纖維素酶，0.12 g的果膠酶，再加入15 mL、pH 5的乙醇酸溶液?；靹蚝筮M(jìn)行酶解，酶解時(shí)間設(shè)置為45 min，溫度為45 ℃，酶解完成后進(jìn)行超聲提取，提取溫度設(shè)置為45 ℃，提取時(shí)間為40 min，離心后稀釋2倍，測量535 nm處的吸光度，每組測3次平行試驗(yàn)。

由表1可知，色素提取率在添加纖維素酶后最高，添加果膠酶次之，最小的是未添加任何酶輔助的。試驗(yàn)結(jié)果顯示：添加纖維素酶明顯提高了茄子皮色素的提取率，這是由于纖維素酶酶解了茄子皮的纖維素組織，使色素細(xì)胞在超聲作用下更容易析出，因此本試驗(yàn)采用纖維素酶進(jìn)行輔助。

在相似矩陣中，數(shù)值大小表示對應(yīng)兩個(gè)關(guān)鍵詞間距離的遠(yuǎn)近，數(shù)值越接近1，表明關(guān)鍵詞間距離越近，相似程度越大；數(shù)值越接近0，表明關(guān)鍵詞間距離越遠(yuǎn)，相似度越小。從統(tǒng)計(jì)結(jié)果看，創(chuàng)客(0.396)、創(chuàng)客空間(0.370)、創(chuàng)客運(yùn)動(dòng)(0.229)、創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)教育(0.185)、STEM教育(0.238)、美國(0.224)、創(chuàng)新能力(0.180)、創(chuàng)新(0.150)等與創(chuàng)客教育的距離較近，說明這些主題受到了研究者的關(guān)注。創(chuàng)客課程、實(shí)踐教學(xué)、教學(xué)改革等與創(chuàng)客教育距離較遠(yuǎn)，說明目前對于這些領(lǐng)域的關(guān)注度較低，探索和發(fā)展空間較大。

表1 酶的種類對色素提取率的影響

1.3 單因素試驗(yàn)

取0.5 g干燥的茄子皮粉末，分別加入濃度為7，8，9，10，11 mg/mL的纖維素酶，料液比為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80 (g/mL)，pH值為4，5，6，7，8的乙醇酸溶液混勻，酶解時(shí)間為65，75，85，90，95 min，酶解溫度為35，40，45，50，55 ℃，超聲時(shí)間為30，40，50，60，70 min，超聲溫度為40，50，60，70，80 ℃，離心10 min，取上層清液稀釋2倍，以纖維素酶的乙醇酸溶液為參比溶液，測定吸光度值，計(jì)算色素提取率。

1.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

試驗(yàn)利用Design Expert軟件，選取對茄子皮色素的提取影響最大的4個(gè)因素設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。選取酶濃度、料液比、酶解時(shí)間、超聲時(shí)間、超聲溫度4個(gè)單因素，在上述試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)[18-20]，以吸光度為響應(yīng)值來設(shè)計(jì)試驗(yàn)，見表2。

表2 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)因子及編碼值

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶解時(shí)間對色素提取率的影響

由圖2可知，茄子皮色素的提取率隨著酶解時(shí)間的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在酶解時(shí)間達(dá)到85 min時(shí)，茄子皮色素的提取率最高；在酶解時(shí)間低于85 min時(shí)，提取效果很差；酶解時(shí)間高于85 min后，色素提取率開始下降，分析原因可能是時(shí)間過長使酶的活性失活，因此達(dá)不到最佳的提取效果。

圖2 酶解時(shí)間對色素提取率的影響

2.1.2 酶解溫度對色素提取率的影響

由圖3可知，色素提取率隨酶解溫度的增長呈現(xiàn)先上升后迅速下降的趨勢。在酶解溫度為45 ℃時(shí)，茄子皮色素的提取效果達(dá)到最佳；在酶解溫度低于45 ℃時(shí)，提取效果不明顯；酶解溫度大于45 ℃時(shí)，提取效果驟然下降，原因是溫度過高，導(dǎo)致纖維素酶失活。酶有一最適宜的溫度，高于或者低于這個(gè)溫度都會(huì)導(dǎo)致酶的活性發(fā)揮不充分。

圖3 酶解溫度對色素提取率的影響

2.1.3 纖維素酶用量對色素提取率的影響

由圖4可知，色素提取率隨酶用量的增大先大幅度上升后急劇下降。酶用量小于9 mg/mL時(shí)，色素提取率較低，此時(shí)酶尚未能完全發(fā)揮作用使色素提取完全；酶用量在9 mg/mL時(shí)，色素含量最高；高于9 mg/mL時(shí)，色素含量又降低，這是因?yàn)槊笣舛鹊陀? mg/mL時(shí)，溶液中酶的濃度沒有達(dá)到飽和；達(dá)到9 mg/mL時(shí)，酶已經(jīng)達(dá)到飽和，此時(shí)繼續(xù)加大酶的濃度，酶的作用反而受到抑制。

圖4 酶濃度對色素提取率的影響

由圖5可知，茄子皮色素的提取效果隨超聲時(shí)間的增長先上升后迅速下降。在60 min時(shí)，茄子皮色素的提取效果達(dá)到最佳；低于60 min時(shí)，提取效果不顯著，這是因?yàn)榍炎悠ぶ械纳匚茨芡耆崛?；高?0 min時(shí)，色素提取率迅速降低。可能是因?yàn)樯匾堰_(dá)到飽和，產(chǎn)生了其他雜質(zhì)，不及60 min時(shí)的提取效果。

圖5 超聲時(shí)間對色素提取率的影響

2.1.5 超聲溫度對色素提取率的影響

由圖6可知，色素提取率隨著超聲溫度的上升呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在70 ℃時(shí)，茄子皮色素提取率最高；低于70 ℃前，色素未被完全提取；在70～80 ℃時(shí)色素提取率下降，這是因?yàn)殚L時(shí)間處于高溫狀態(tài)下，色素中的顯色物質(zhì)遭到破壞，使色素提取率下降。所以，選擇最佳超聲溫度為70 ℃。

圖6 超聲溫度對色素提取率的影響

2.1.6 溶液pH值對色素提取率的影響

由圖7可知，色素提取效果隨著溶液pH值的增大呈現(xiàn)先升高后迅速下降的趨勢，在pH 為6時(shí)出現(xiàn)峰值，pH<6時(shí)，纖維素酶的活性并沒有完全被激發(fā);pH>6時(shí)，溶液處于中性或者堿性條件下，色素不能被提取。因此，提取劑的最適pH值為6。

圖7 溶液pH值對色素提取率的影響

2.1.7 料液比對色素提取率的影響

由圖8可知，料液比對茄子皮色素的提取效果有比較明顯的影響，隨著料液比的減小，色素提取率呈現(xiàn)先上升后達(dá)到最佳值后急劇下降的趨勢，在料液比為1∶60時(shí)，色素的提取效果最佳；料液比低于1∶60時(shí)，提取效果隨料液比的減小逐漸升高；高于1∶60后，色素含量開始下降，這是由于色素被稀釋，導(dǎo)致色素含量低，吸光度值也相應(yīng)地減小，或者是色素被氧化。因此，選擇最佳料液比為1∶60。

圖8 料液比對色素提取的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)結(jié)果見表2，分析結(jié)果見表3。針對選出的4個(gè)因素，以吸光度為響應(yīng)值得到二次回歸多項(xiàng)模型：色素提取率=+2.28-0.21A+0.081B+0.021C+0.90D+0.019AB+0.55AC+0.055AD+0.28BC-0.31BD+0.23CD+0.56A2+0.32B2+0.61C2+0.52D2。

表3 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表4中的數(shù)據(jù)表明，超聲時(shí)間、超聲溫度、料液比、酶濃度4個(gè)條件的主效應(yīng)關(guān)系為料液比>超聲時(shí)間>超聲溫度>酶濃度。模型極為顯著，失擬項(xiàng)數(shù)值顯示差異顯著，方程擬合度較好。其中顯著項(xiàng)為A2、C2、D2。

表4 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的模型方差分析結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)曲面的分析

交互項(xiàng)對提取效果的影響見圖9～圖14，這些圖是響應(yīng)值(吸光度)對各因素所形成的三維空間曲面圖。

圖9 色素提取率隨超聲時(shí)間和超聲溫度的響應(yīng)面變化曲線

圖10 色素提取率隨超聲時(shí)間和酶濃度的響應(yīng)面變化曲線

圖11 色素提取率隨超聲時(shí)間和料液比的響應(yīng)面變化曲線

圖12 色素提取率隨超聲溫度和酶濃度的響應(yīng)面變化曲線

圖13 色素提取率隨超聲溫度和料液比的響應(yīng)面變化曲線

圖14 色素提取率隨酶濃度和料液比的響應(yīng)面變化曲線

通過Design Expert軟件的回歸分析優(yōu)化可知，當(dāng)酶濃度為9 mg/mL、料液比為1∶65、超聲溫度為71.94 ℃、超聲時(shí)間為61.49 min時(shí)，茄子皮色素的提取效果最佳。但考慮到實(shí)驗(yàn)室中實(shí)際操作的可能性，將最佳條件變更為：纖維素酶濃度9 mg/mL、酶解溫度45 ℃、酶解時(shí)間85 min、超聲時(shí)間61 min、超聲溫度45 ℃、pH 6、料液比1∶65時(shí)提取的茄子皮色素提取率最高，用該條件進(jìn)行3次驗(yàn)證，色素提取率為4.753%，結(jié)果合理有效，可以應(yīng)用于實(shí)際操作。

3 結(jié)論

以新鮮茄子皮為原料提取天然色素，對影響色素提取效果的酶濃度、酶解溫度、酶解時(shí)間、超聲時(shí)間、超聲溫度、料液比、溶液pH等因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定4個(gè)影響較大的因素做響應(yīng)面分析，確定了超聲時(shí)間、超聲溫度、料液比、酶濃度4個(gè)條件的主效應(yīng)關(guān)系為料液比>超聲時(shí)間>超聲溫度>酶濃度，并確定最佳提取條件：纖維素酶濃度9 mg/mL、酶解溫度45 ℃、酶解時(shí)間85 min、超聲時(shí)間61 min、超聲溫度45 ℃、pH 6、料液比1∶65時(shí)提取的茄子皮色素提取率最高，色素提取率高達(dá)4.753%。