紀(jì) 瑩, 吳婷婷, 王 欣, 唐 麗, 杜小沛

(遼寧省大連市口腔醫(yī)院, 1. 口腔預(yù)防科, 2. 牙體牙髓科, 遼寧 大連, 116021)

嬰幼兒齲病(ECC)是以細(xì)菌為主的多種因素導(dǎo)致的牙體組織發(fā)生不可逆的慢性免疫炎癥反應(yīng)的一類疾病[1]。目前，采用傳統(tǒng)抗菌藥物治療齲病未得到理想效果。口腔微生物在ECC的發(fā)生及發(fā)展中可能起到了重要作用，正常的口腔生物膜系統(tǒng)中，微生物群落保持著動(dòng)態(tài)平衡，一旦口腔外界環(huán)境發(fā)生變化或失衡，則會(huì)使微生物間的拮抗作用被打破，造成致病菌大量生長(zhǎng)，影響口腔健康[2]。隨著齲病的發(fā)生、發(fā)展，牙體硬組織脫礦，膠原蛋白暴露，而與齲病相關(guān)的膠原蛋白酶主要包括基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)和組織蛋白酶，其中MMP是一類牙組織基質(zhì)中的肽酶，參與牙周雜層和齲病細(xì)胞外基質(zhì)成分的降解[3]。此外, MMP還可通過(guò)蛋白水解激活或降解細(xì)胞因子和趨化因子對(duì)免疫和炎癥起到調(diào)節(jié)作用[4]。齲病的進(jìn)展常伴隨免疫機(jī)制的改變，免疫反應(yīng)在對(duì)抑制齲病的發(fā)生中具有重要作用，可保護(hù)牙齒硬組織免受感染[5]。本研究探討ECC口腔微生物群失調(diào)及其與唾液免疫生物標(biāo)志物的關(guān)系，明確免疫功能低下與ECC發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年6月—2020年6月本院收治的齲病患兒600例為研究對(duì)象，依據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)齲齒診斷標(biāo)準(zhǔn)，將患兒分為低齲組(n=267)和高齲組(n=333)。納入標(biāo)準(zhǔn): ① 無(wú)慢性、系統(tǒng)性疾病者; ② 近3個(gè)月內(nèi)未接受過(guò)藥物治療者; ③ 半年內(nèi)未使用過(guò)含氟制劑者。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 合并全身系統(tǒng)性疾病者; ② 合并精神疾病者; ③ 合并炎癥、免疫感染類疾病者; ④ 嚴(yán)重電解質(zhì)紊亂者; ⑤ 合并惡性腫瘤者; ⑥ 具有不良飲食習(xí)慣者，如甜食攝入較多，吮吸手指等。另選取同期在本院體檢的健康嬰幼兒100例為對(duì)照組。3組性別、年齡、體質(zhì)量等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 具有可比性，見表1。

表1 3組一般資料比較

1.2 方法

治療前，所有入組對(duì)象于清晨使用清水漱口，然后采用無(wú)菌平板培養(yǎng)皿收集唾液樣本，并迅速分裝到EP管中，置于液氮罐中保存待用。唾液凍存前，取1 mL進(jìn)行微生物檢測(cè)，記錄各組鏈球菌、乳酸桿菌、放線桿菌以及雙歧桿菌的菌落數(shù)。取唾液樣本, 3 000轉(zhuǎn)/min 離心10 min, 取上清液50 μL, 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)各組唾液中MMP-2、MMP-3、MMP-9水平，所用試劑盒購(gòu)自美國(guó)BIOTANG公司。采用Model550全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-RAD公司)及ELISA法檢測(cè)唾液中炎癥因子水平如白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-8、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。所用試劑盒購(gòu)自美國(guó)BIOTANG公司。采用Im-mage 800全自動(dòng)特定蛋白儀(美國(guó)Beckman公司)檢測(cè)唾液免疫指標(biāo)，包括免疫球蛋白(Ig)(IgA、IgG)及補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組口腔微生物群菌落數(shù)比較

高齲組鏈球菌、乳酸桿菌、放線桿菌菌落數(shù)多于低齲組和對(duì)照組，雙歧桿菌菌落數(shù)少于低齲組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 低齲組鏈球菌、乳酸桿菌、放線桿菌菌落數(shù)多于對(duì)照組，雙歧桿菌菌落數(shù)少于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見表2。

表2 各組口腔微生物群菌落數(shù)比較 CFU/mL

2.2 各組基質(zhì)金屬蛋白酶水平比較

高齲組MMP-2、MMP-3和MMP-9水平均高于低齲組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 低齲組MMP-2、MMP-3和MMP-9水平均高于對(duì)照組(P<0.05), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

表3 各組MMP水平比較 μg/L

2.3 各組炎癥因子水平比較

高齲組IL-8、IL-6和TNF-α水平均高于低齲組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 低齲組IL-8、IL-6和TNF-α水平均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見表4。

表4 各組炎癥因子水平比較 pg/mL

2.4 各組免疫功能指標(biāo)比較

高齲組IgA、IgG、補(bǔ)體C3和補(bǔ)體C4水平均低于低齲組和對(duì)照組，且低齲組IgA、IgG、補(bǔ)體C3和補(bǔ)體C4水平均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見表5。

表5 各組免疫功能指標(biāo)比較 g/L

2.5 口腔菌群與MMP、炎癥因子和免疫功能的相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析表明，鏈球菌、乳酸桿菌、放線桿菌與MMP-2、MMP-3、MMP-9、IL-8、IL-6和TNF-α水平呈顯著正相關(guān)(P<0.05), 與IgA、IgG、補(bǔ)體C3和補(bǔ)體C4水平呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05); 雙歧桿菌與MMP-2、MMP-3、MMP-9、IL-8、IL-6和TNF-α水平呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05), 與IgA、IgG、補(bǔ)體C3和補(bǔ)體C4水平呈顯著正相關(guān)(P<0.05), 見表6。

表6 口腔菌群與MMP、炎癥因子和免疫功能的相關(guān)性分析

3 討 論

ECC是兒童最常見的口腔疾病，具有發(fā)生率高、進(jìn)展迅速、累及廣、治療難度大等特點(diǎn)[6]。既往研究認(rèn)為，以變異鏈球菌為代表的一系列細(xì)菌是齲病的單一致病菌，然而基于傳統(tǒng)致病菌的治療未能有效降低齲病的發(fā)生率，可見到單一致病菌理論無(wú)法完全反映疾病與微生物之間的關(guān)系。口腔中的微生物對(duì)ECC的發(fā)生和發(fā)展具有重要作用[7]。口腔微生物組分復(fù)雜，對(duì)口腔健康至關(guān)重要，人類口腔中有700多種微生物，主要以細(xì)菌為主?？谇晃⑸锶河兄谧柚共≡⑸锏纳L(zhǎng)，維持口腔微生態(tài)的穩(wěn)定與平衡。微生物與宿主關(guān)系失衡會(huì)導(dǎo)致口腔微生態(tài)失調(diào)，誘發(fā)齲齒和牙周病等口腔疾病，導(dǎo)致潛在致病微生物增殖[8]。唾液中混雜了廣泛的口腔微生物，因其物理?xiàng)l件獨(dú)特、理化性質(zhì)以及容易獲取，為口腔微生物群的研究提供了理想的條件。MA C等[9]采用變性梯度凝膠電泳對(duì)齲病唾液微生物進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，患齲組唾液微生物多樣性低于無(wú)齲組唾液微生物的多樣性。對(duì)2例剛出生的嬰兒唾液微生物研究[10]發(fā)現(xiàn)，隨著牙齒從健康到齲病，口腔微生物多樣性逐漸減少，原因可能是隨著齲病的發(fā)展和口腔pH值的逐漸下降，耐酸菌逐漸增多，影響正常口腔菌群的定植，菌群的結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)單一性，多樣性減少。FREGNANI E R等[11]通過(guò)比較無(wú)齲病和嚴(yán)重ECC兒童唾液及菌斑微生物菌群情況認(rèn)為，變異鏈球菌、放線菌屬等與嚴(yán)重ECC有顯著相關(guān)性。JIANG W等[12]基于測(cè)序技術(shù)對(duì)患有不同齲病的兒童口腔微生物分析發(fā)現(xiàn)，鏈球菌屬、放線菌屬的豐度在嚴(yán)重ECC患兒中相對(duì)增加。本研究發(fā)現(xiàn)，高齲組鏈球菌、乳酸桿菌、放線桿菌菌落數(shù)明顯多于低齲組和對(duì)照組，雙歧桿菌菌落數(shù)少于低齲組和對(duì)照組，低齲組鏈球菌、乳酸桿菌、放線桿菌菌落數(shù)多于對(duì)照組，雙歧桿菌菌落數(shù)少于對(duì)照組。當(dāng)齲病發(fā)生時(shí)，鏈球菌、乳酸桿菌、放線桿菌致齲微生物增加，而雙歧桿菌等益生菌減少，表明口腔微生態(tài)失調(diào)可能參與了嬰幼兒齲病的發(fā)生與發(fā)展。當(dāng)然，部分患兒食欲、消化能力、胃腸道功能(便秘、腹瀉)等也可能與口腔微生態(tài)存在一定聯(lián)系。

齲病形成的機(jī)制較為復(fù)雜，主要包括以下步驟: 生物膜中致齲細(xì)菌代謝增加了酸性物質(zhì)的分泌; 代謝產(chǎn)生的酸性物質(zhì)導(dǎo)致pH值下降，造成牙齒脫礦; 未有效干預(yù)牙齒進(jìn)一步脫礦，形成齲齒[13]; 細(xì)菌產(chǎn)酸進(jìn)一步激活MMP降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)細(xì)菌侵襲牙齦，進(jìn)一步促進(jìn)齲病的發(fā)展[14]。ANTUNES L A等[15]發(fā)現(xiàn)，兒童早期齲病中MMP-9基因型出現(xiàn)率較高，且與釉質(zhì)白斑的形成有關(guān)，而MMP-2、MMP-3基因型與齲病易感性相關(guān)[16]。此外, MMP可作用于促炎細(xì)胞因子、趨化因子和其他蛋白質(zhì)，以調(diào)節(jié)炎癥和免疫的各個(gè)階段，其中MMP-3作為信號(hào)分子可誘導(dǎo)促炎性因子或誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)[17]。

在炎癥條件下，由免疫反應(yīng)介導(dǎo)的內(nèi)源性降解途徑的激活會(huì)導(dǎo)致破壞性細(xì)胞分子從正常細(xì)胞中釋放出來(lái)。MMP及其調(diào)節(jié)劑可以相互激活，并通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)成分以及調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和趨化因子在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[18]。免疫反應(yīng)在齲齒形成過(guò)程中扮演者重要角色, IgA是人類唾液中最豐富的抗體，分泌型免疫球蛋白A(SIgA)被認(rèn)為是抵御黏膜表面病原體的第一道防線[19]。研究[20]表明，選擇性IgA缺乏癥患兒比健康兒童患齲病的風(fēng)險(xiǎn)更高。補(bǔ)體系統(tǒng)是先天性免疫應(yīng)答的重要組成部分，在幫助宿主抵抗感染方面發(fā)揮核心作用，可通過(guò)過(guò)敏性休克毒素的產(chǎn)生、調(diào)理、病原體的溶解等多種機(jī)制增強(qiáng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，高齲組MMP-2、MMP-3、MMP-9、IL-8、IL-6和TNF-α水平均高于低齲組和對(duì)照組，低齲組以上指標(biāo)均高于對(duì)照組; 高齲組IgA、IgG、補(bǔ)體C3和補(bǔ)體C4水平均低于低齲組和對(duì)照組，低齲組IgA、IgG、補(bǔ)體C3和補(bǔ)體C4水平均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Pearson相關(guān)性分析表明，鏈球菌、乳酸桿菌、放線桿菌與MMP-2、MMP-3、MMP-9、IL-8、IL-6和TNF-α水平呈顯著正相關(guān)，與IgA、IgG、補(bǔ)體C3和補(bǔ)體C4水平呈顯著負(fù)相關(guān); 雙歧桿菌與MMP-2、MMP-3、MMP-9、IL-8、IL-6和TNF-α水平呈顯著負(fù)相關(guān)，與IgA、IgG、補(bǔ)體C3和補(bǔ)體C4水平呈顯著正相關(guān)。由此可見，當(dāng)宿主免疫系統(tǒng)不平衡時(shí)，口腔微生物群發(fā)生改變，這些微生物可能會(huì)侵入口腔組織，誘發(fā)口腔疾病，或激活降解細(xì)胞外基質(zhì)途徑，加重炎癥反應(yīng)，抑制免疫功能，進(jìn)一步促進(jìn)疾病的發(fā)展。