曹曉琴，方振峰，張濤，施璐*

江漢大學醫(yī)學院（武漢 430056）

藥食保健證實對人體具有治療、保健和“治未病”的效用[1]。2015年《101種藥食同源名單》中含藥食同源動物食品共14種被廣泛使用[2]，近年來食用藥食同源動物食療保健發(fā)展成為一種保健飲食經(jīng)濟服務產(chǎn)業(yè)[3-4]，這對監(jiān)管提出更高要求[5]。GB 31650—2019《食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留限量》規(guī)定267種（類）獸藥在畜禽產(chǎn)品、水產(chǎn)品、蜂產(chǎn)品中2

191項殘留限量及使用要求[6]。其中，雄激素家族中的諾龍[7-8]、雌激素中的己烯雌酚[9-10]、糖皮質(zhì)激素中的氫化可的松[11-12]和孕激素中的醋酸氯地孕酮[13]是4種方便易得、易被養(yǎng)殖業(yè)廣泛添加的代表性激素。但試驗證明，其具有潛在致癌性[14-15]。

對藥食同源動物性食品多激素殘留檢測，國家暫未制定標準檢測方法。文獻報道的檢測方法主要有氣相色譜法（GC法）[16]、高效液相色譜法（HPLC法）[17-18]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS法）[19-21]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS/MS法）[22-24]。其中，HPLC-MS/MS法是激素測定最重要方法[25-28]。

試驗將TLC法應用到樣品前處理過程中，聯(lián)用高靈敏度、高專一性的UPLC-MS/MS法，建立同時檢測14種藥食同源動物性食品中4種不同類別的激素的UPLC-MS/MS方法。對14種藥食同源動物性食品進行檢測，為打擊非法飼喂、保障藥食同源動物性食品安全提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

諾龍（純度99.5%）、己烯雌酚（純度99.6%）（德國Dr. Ehrenstorfer公司）；氫化可的松（純度99.6%）、醋酸氯地孕酮（純度99.7%）（中國獸醫(yī)藥品檢查所）。

烏梢蛇、阿膠、雞內(nèi)金、蝮蛇、蜂膠、蛤蚧、牡蠣、鱉甲、馬鹿胎、馬鹿茸、馬鹿骨、龜甲、珍珠等藥食同源動物性食品（武漢中醫(yī)院門診藥房）；蜂蜜（市售）。

甲醇、乙腈（色譜純）；其他試劑均為分析純；GF254薄層硅膠板（200 mm×100 mm，青島海浪硅膠干燥劑廠）。

1.2 儀器與設備

API 4500三重四極桿MS/MS（美國Applied Biosystems公司）；UPLC（日本島津公司）；分析天平（感量0.000 01 g，日本島津公司）；高速冷凍離心機（日本日立公司）；MILLI-Q超純水機（美國MILLIPORE公司）。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

采用Kinetex 100 RP-18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm），柱溫40 ℃；進樣體積10 μL；流速0.2 mL/min；流動相及梯度洗脫條件見表1。

表1 UPLC梯度洗脫程序

1.3.2 質(zhì)譜條件

采用ESI源的正負離子同時掃描模式。主要參數(shù)：離子噴霧電壓4 500 V；離子源Gas1，0.36 MPa；Gas2，0.25 MPa；離子源溫度500 ℃；通過優(yōu)化參數(shù)，得到的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 4種藥物在MRM模式下優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)

1.3.3 供試品的制備

烏梢蛇、阿膠、雞內(nèi)金、蝮蛇、蛤蚧、牡蠣、蜂膠、鱉甲、馬鹿胎、馬鹿茸、馬鹿骨、龜甲、珍珠等固體類藥食同源動物性食品分別隨機取同一批號藥材，各10 g，研細或粉碎作為試樣。

蜂膠軟膠囊：隨機取20粒同一批號的供試品，將內(nèi)容物全部擠入1個離心管中，充分混勻后，作為試樣。

蜂蜜：隨機取3瓶同一批號的供試品作為試樣。

所有采集的樣品均采用建立的檢測方法進行空白基質(zhì)的篩選，測定結果為無任何干擾峰的基質(zhì)作為空白基質(zhì)，用于樣品添加試驗。

1.3.4 前處理條件

TLC法在文獻[29]基礎上進行適當優(yōu)化。取硅膠GF254薄層板備用。稱取約1.0 g的1.3.3小節(jié)處理好的試樣，置于10 mL離心管中，加入1 mL水浸潤后放置2 min，加入3 mL乙腈，超聲提取（功率143 W、頻率40 kHz）15 min，再離心5 min（4 000 r/min），將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中。殘渣加入3 mL乙腈重復提取1次，合并2次提取液，于50 ℃氮氣濃縮至1 mL，點于制備好的薄層板上，室溫晾干，將展開劑三氯甲烷-乙醚-甲醇-濃氨水（40︰3︰4︰1，V/V）置層析缸中預飽和30 min，將點好樣的薄層板放入層析缸中，在15 ℃避光條件下進行上行展開，取出、晾干，在254 nm紫外光燈下檢視定位，將薄層板上不同對照品對應的樣品顯色區(qū)域挖下來，放入1.5 mL EP管中，將挖下的薄層粉末連同EP管一同烘干后，用1 mL的甲醇溶解，超聲（功率143 W、頻率40 kHz）5 min，再以8 000 r/min離心5 min，取上清液，過濾膜上機檢測。

1.4 統(tǒng)計學分析

在優(yōu)化條件和實際樣品測定時，平行試驗重復操作6次，采用SPSS 13.0（Chicago，IL，USA）統(tǒng)計軟件分析。基質(zhì)效應通過t檢驗的方法來考察[30]。

2 結果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

試驗顯示，己烯雌酚在負離子模式響應較高，這與文獻[31]報道一致。雌激素（己烯雌酚）具有羥基，呈現(xiàn)弱酸性，易脫氫在負離子模式下獲得[M-H]-的準分子離子峰，同時也產(chǎn)生[M+COOH]-、[M+Cl]-的準分子離子峰。文獻[32]分析[M+Cl]-可能來源于水中氯離子影響，[M+COOH]-則是由于流動相中甲酸引起的。試驗發(fā)現(xiàn)，雄激素（諾龍）、孕激素（醋酸氯地孕酮）均產(chǎn)生較強的準分子離子峰[M+H]+，部分化合物也存在較弱的[M+Na]+加合峰，這與文獻[32]報道也一致。但糖皮質(zhì)激素類藥物（氫化可的松）在正、負離子模式下均可電離成多種形式，這與文獻[33]的報道一致，經(jīng)過比對發(fā)現(xiàn)，在與其他藥物同時檢測時正離子模式響應高于負離子模式響應，所以氫化可的松選用正離子模式。試驗中的諾龍、醋酸氯地孕酮、氫化可的松均采用正離子模式，電離形成[M+H]+準分子離子；己烯雌酚采用負離子模式，電離形成[M-H]-準分子離子，最終的選擇結果見表2。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 流動相

圖1 阿膠空白樣品添加4種藥物離子流圖（1 μg/kg）

鑒于樣品基質(zhì)成分復雜，考察不同梯度洗脫程序?qū)ιV分離的影響。采用方案1（0 min，25% A相；15 min，90% A相）和方案2（0 min，35% A相；10 min，90% A相）時，待測物出峰時間較快，但是在實際樣品檢測時發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)與待測物共流出，無法分離。把梯度程序調(diào)緩，可使雜質(zhì)在前面出峰，延后待測物出峰時間，才得以很好分離，所以梯度洗脫方案為：0 min，5% A相；5 min，50% B相；8 min，95% B相。4種激素在10 min內(nèi)能較好區(qū)分。圖1為阿膠空白樣品中添加4種激素在最佳梯度洗脫程序時的提取離子流圖。

2.3 方法學考察

2.3.1 基質(zhì)效應考察

采用t檢驗的方法來考察基質(zhì)效應[30]，根據(jù)檢驗規(guī)定，若t（n-4）＞2.4，說明存在基質(zhì)效應。經(jīng)t檢驗方法考察，4種激素在不同基質(zhì)中的t值均大于2.4。所以，采用基質(zhì)匹配工作曲線進行定量。

2.3.2 檢出限、定量限及線性范圍

利用配制的空白樣品添加混合標準溶液繪制標準工作曲線，重復5次，添加質(zhì)量濃度依次為0.5，1.0，10.0，50.0，100.0和500.0 μg/L。以信噪比S/N≥3為檢出限（LOD），以S/N≥10為定量限（LOQ）。4種藥物諾龍、己烯雌酚、氫化可的松和醋酸氯地孕酮的線性范圍、檢出限和定量限見表3。

表3 4種待測藥物的線性回歸方程、相關系數(shù)、檢出限及定量限

2.3.3 準確度和精密度測定

由于每種樣品都可以篩選出空白樣品，考慮到動物性樣品的差異性，依次進行14種樣品的4種激素添加回收試驗。各個樣品分別在3個濃度水平添加，每個濃度重復5次，連續(xù)5 d進行重復試驗。當諾龍、己烯雌酚、氫化可的松和醋酸氯地孕酮添加濃度為0.5～2.0 μg/kg時，它們分別在14種樣品中的回收率在68.2%～100.1%，變異系數(shù)≤16.1%。表4列舉阿膠、雞內(nèi)金、蜂蜜等3種樣品中4種藥物的回收率和變異系數(shù)結果。

表4 阿膠、雞內(nèi)金和蜂蜜中4種藥物的回收率和變異系數(shù)

2.4 樣品測定

取14份自購樣品，按1.3小節(jié)的制備方法制備并進樣測定，通過各物質(zhì)的保留時間及定量監(jiān)測離子對進行4種激素定性定量分析。結果表明，在蜂蜜和阿膠樣品中均檢測到氫化可的松的殘留（測得m/z=363.3），經(jīng)帶入工作曲線定量計算，蜂蜜中其質(zhì)量濃度為3.5 μg/L，阿膠中其質(zhì)量濃度為2.8 μg/L，而其他樣品中均未檢出4種待測藥物。根據(jù)農(nóng)業(yè)部235號公告[6]規(guī)定，氫化可的松暫未規(guī)定其最高殘留限量，允許在動物飼料中使用。因此，檢測的14份自購樣品均合格。結果表明，所建立的方法可應用于14種藥食同源動物性食品中的4種甾體激素的殘留檢測。

3 結論

建立UPLC-MS/MS法檢測14種藥食同源動物性食品中的4種甾體激素。通過前處理方法的選擇和優(yōu)化，得出TLC提取分離的最佳工藝條件。根據(jù)方法學考察結果，該方法專屬性強，靈敏度高，可作為14種藥食同源動物性食品中獸藥殘留的有效檢測方法。