吳春妍，陳國嬌，王瓊仙，王利梅，蘇茜茜，石蘭嵐

（1 昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部，云南 昆明；2 昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；云南 昆明）

0 引言

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是一種嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷性疾病，患者多表現(xiàn)為功能喪失甚至是損傷平面下的完全癱瘓，致殘率極高[1]。由于這種疾病恢復(fù)歷程極其漫長，他們需要依賴多種醫(yī)療措施護(hù)理延長壽命，生活質(zhì)量極差[2]。不僅如此，脊髓損傷的患者還要在整個疾病過程中承受多種漸進(jìn)性并發(fā)癥的折磨，比如心血管疾病、腸胃問題、慢性疼痛和抑郁等[3,4]。脊髓損傷后，損傷區(qū)域發(fā)生復(fù)雜的生理病理變化，而神經(jīng)功能的恢復(fù)主要與軸突內(nèi)生能力/微環(huán)境的營養(yǎng)因子與生長因子及瘢痕形成等有密切關(guān)系[5]，如何實現(xiàn)功能恢復(fù)，是國內(nèi)外研究的重點和難點。本研究擬將miR-449a 轉(zhuǎn)染脊髓神經(jīng)元，通過體外培養(yǎng)觀察miR-449a 對神經(jīng)元的作用。

1 材料與方法

1.1 動物和材料

SPF 級新生24h 內(nèi)的SD 乳鼠，由昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部提供。倒置顯微鏡（Nikon SMZ745）、miR-449a mimic、NC（廣州銳博）、引物（成都擎科）、RT-qPCR反應(yīng)試劑盒（DBI Bioscience）、DMEM/Neurobasal 培養(yǎng)基（Gibco）。終止消化，用5ml 吸管輕輕地吹打10次，靜置2min，吸取上面的細(xì)胞懸液移入培養(yǎng)皿中，然后再向沉淀的組織團(tuán)塊加入培養(yǎng)基，重復(fù)上述吹打步驟，吸取上層細(xì)胞懸液，如此2-3次。濾網(wǎng)過濾，1000r/min 離心5min，棄上清，加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，移入培養(yǎng)瓶置入37℃培養(yǎng)箱中30min 差速貼壁，收集未貼壁液體調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個/孔，將細(xì)胞接種到6 孔板中，每孔2ml，將培養(yǎng)板放入37℃、5%CO2孵箱內(nèi)孵育[6-8]。每3d 半量換液1次。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

按照miRNA 產(chǎn)品使用說明書，以50nM 的miR-449a mimic、NC 終濃度轉(zhuǎn)染脊髓神經(jīng)元。

1.2.3 RT-qPCR 檢測miR-449a、β-tubilin 的表達(dá)

使用Trizol 法提取各組的總RNA，在紫外熒光光度計中進(jìn)行吸光度A260/280 和A260/230 比值的測定以確定樣品總RNA 的純度和濃度，對miRNA 和β-tubilin分別反轉(zhuǎn)錄為cDNA。取適量cDNA 為模板配制20μl 反應(yīng)體系在PCR 擴增儀中進(jìn)行PCR 反應(yīng)。使用SYBR 染料實時檢測擴增情況，β-tubilin 使用GAPDH 為內(nèi)參，miRNA 使用U6 為內(nèi)參分析表達(dá)情況，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt 法進(jìn)行分析。引物設(shè)計見表1。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

取24h 內(nèi)新生的SD 乳鼠置于75% 酒精中浸泡3-5min。將乳鼠取出后斷頭、沿正中線剖開，暴露脊柱，置于盛有D-hanks 液的培養(yǎng)皿內(nèi)，分離脊髓，剝離脊髓上的血管膜和脊膜。將脊髓組織移入10ml 培養(yǎng)皿中，用剪刀剪成0.5-1mm3大小的小塊，加入2mg/ml 木瓜酶置于37℃培養(yǎng)箱消化20-30min。用等體積的10%胎牛血清

表1 RT-qPCR 引物列表

1.3 統(tǒng)計方法

使用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行所有數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。根據(jù)實驗設(shè)計組間比較使用單素方差分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原代脊髓神經(jīng)元狀態(tài)分析

原代脊髓神經(jīng)元培養(yǎng)1d 時，可觀察到細(xì)胞貼壁生長圓而透明，培養(yǎng)至第3d 時，細(xì)胞生長良好，胞體豐滿、長出細(xì)小的突起，胞漿透明、折光良好。

2.2 轉(zhuǎn)染miR-449a 在脊髓神經(jīng)元中的表達(dá)變化

采用RT-qPCR 檢測，mimic 組的miR-449a 表達(dá)量顯著高于NC 組（P＜0.05）。

2.3 轉(zhuǎn)染miR-449a 對β-tubilin 在體外培養(yǎng)脊髓神經(jīng)元中的影響

采用RT-qPCR 檢測β-tubilin 的表達(dá)水平，與NC 組相比，mimic 組的β-tubilin 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。見圖1。

圖1 RT-qPCR 檢測脊髓神經(jīng)元中β-tubilin 的表達(dá)情況

3 討論

脊髓損傷是常見的外傷性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，具有高發(fā)病率、高致殘率、高花費等特點，患者預(yù)后極差，生活質(zhì)量極低[9,10]。開展脊髓損傷后功能恢復(fù)的機制研究，開發(fā)精準(zhǔn)的治療藥物意義重大。miR-449a 的研究涉及在癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病，以及代謝疾病領(lǐng)域，在前期的研究工作中，我們還嘗試用iPS 細(xì)胞移植治療脊髓損傷，功能恢復(fù)效果顯著，并伴隨著miR-449a 的表達(dá)顯著下調(diào)[11，12]。不僅如此，我們用生物信息學(xué)還預(yù)測β-tubilin 是miR-449a 的靶基因。本研究通過體外培養(yǎng)脊髓神經(jīng)元，利用RT-qPCR 檢測miR-449a、β-tubilin 表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)miR-449a 的上調(diào)顯著提升了β-tubilin 的表達(dá)量，miR-449a 是否通過靶向β-tubilin 在發(fā)揮促進(jìn)脊髓損傷的關(guān)鍵作用及其調(diào)控機制還有待于進(jìn)一步研究。