陳廷玉，陳大印，謝金鹿，高喜仁，盧春鳳，

（1．湖州師范學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江 湖州 313000；2．佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

目前，異煙肼(isonicotinyl hydrazide，INH)仍然是世界衛(wèi)生組織推薦的一線抗結(jié)核藥物中不可替代的首選藥物，但抗結(jié)核藥物導(dǎo)致的肝損傷乃至肝功能衰竭是終止結(jié)核病治療的主要原因，也是最主要的副作用。因此，尋找有效防治INH肝損傷的藥物成了亟待解決的問題。槲皮素(quercetin，QE)中的黃酮醇，具有清除氧自由基、調(diào)節(jié)免疫功能及抗炎等多種生物活性及藥理作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)槲皮素對INH誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡及DNA損傷具有一定的保護(hù)作用，但其作用靶位與機(jī)制尚不清楚。核因子E2相關(guān)因子2/抗氧化反應(yīng)元件(nuclear erythroid 2-related factor 2/antioxidant response element，Nrf2/ARE)是細(xì)胞抗氧化應(yīng)激的主要信號通路，也是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路。因此，本實驗以人肝細(xì)胞L-02作為研究對象，制備細(xì)胞線粒體，從亞細(xì)胞器水平揭示槲皮素的作用靶標(biāo)，探討Nrf2/ARE信號通路在槲皮素抑制INH誘導(dǎo)肝細(xì)胞線粒體氧化損傷中的作用，闡明槲皮素對INH誘導(dǎo)肝損傷的保護(hù)作用及機(jī)制，以期為臨床尋找用于防治抗結(jié)核藥物性肝損傷的有效藥物提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑

L-02細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所；異煙肼、槲皮素、2,7-二氯熒光素二乙酸酯(2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)均為Sigma公司產(chǎn)品；四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)為Amresco公司產(chǎn)品；2-硫代巴比妥酸(2-thiobarbituric acid，TBA)、四乙氧基丙烷(1,1,3,3-tetraethoxypropane，TEP)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)為Fluka公司產(chǎn)品；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、甲基磺酰氟(phenylmethysulfony fluoride，PMSF)為Merck公司產(chǎn)品；BCA蛋白定量試劑盒為杭州碧云天公司產(chǎn)品；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；Nrf2、血紅素氧合酶1(hemeoxygenase-1，HO-1)、組蛋白3(histone 3，H3)、β-actin多克隆抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG為Zymed公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

L-02細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液置于37℃、CO體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行試驗，當(dāng)加受試物培養(yǎng)時換成不含血清的培養(yǎng)液。將細(xì)胞隨機(jī)分為陰性對照組(給予等體積的無血清培養(yǎng)基)、INH組(給予10 mmol/L INH)、單獨(dú)槲皮素組(給予50μmol/L槲皮素)和槲皮素保護(hù)組(給予10 mmol/L INH+50 μmol/L槲皮素)，共4組。細(xì)胞按上述分組進(jìn)行處理，24 h后取細(xì)胞培養(yǎng)上清液或細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.2.2 細(xì)胞存活率檢測

采用MTT法檢測L-02細(xì)胞存活率。細(xì)胞接種在96孔板內(nèi)，按實驗分組進(jìn)行處理，每組設(shè)3個平行孔。培養(yǎng)24 h后每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20μL，置于培養(yǎng)箱中孵育4 h。吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入DMSO 150μL，振蕩10 min，使結(jié)晶完全溶解。用酶標(biāo)儀測定每孔

D

(570)值，按下式計算細(xì)胞相對存活率。

1.2.3 ROS水平測定

用熒光探針DCFH-DA檢測細(xì)胞線粒體ROS水平。細(xì)胞按實驗分組處理24 h后，收集各組細(xì)胞，加入含250 mmo1/L蔗糖的細(xì)胞裂解液3 mL，吹打均勻后于4℃、6 000 r/min離心10 min，取上清于4℃、13 500 r/min離心10 min，所得沉淀即為線粒體。將上述各組線粒體用HEPES緩沖液重懸，并吹打均勻制成線粒體懸液，加入10μmol/L DCFH-DA，37℃孵育30 min后，用多功能酶標(biāo)儀在激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm下，測定其熒光強(qiáng)度。結(jié)果以相對值表示，即處理組熒光強(qiáng)度/對照組熒光強(qiáng)度×100%。

1.2.4 MDA含量測定

細(xì)胞按實驗分組處理24 h后，收集細(xì)胞，采用TBA比色法測定脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量。1 000 r/min離心10 min，超聲破碎細(xì)胞制成細(xì)胞樣品液。用玻璃管取上述樣品液各250μL，加入500μL TCA和250μL TBA，在沸水中水浴45 min。室溫下冷卻，移到5 mL塑料管中，加入1 mL正丁醇抽提。3 000 r/min離心10 min，取上清200 μL加入96孔板中，用酶標(biāo)儀測定

D

(532)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中MDA含量。使用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測定樣品蛋白濃度，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.5 GSH含量測定

細(xì)胞按實驗分組處理24 h后，收集細(xì)胞并裂解制成細(xì)胞懸液。應(yīng)用Beutler改良法測定抗氧化物GSH含量。加入等體積的5%TCA，10 000 r/min離心10 min，沉淀蛋白，收集上清。取上清液50μL，加入750μL反應(yīng)液[0.1 mol/L PBS和1.0 mmol/L 5,5′-二硫代-雙-硝基苯甲酸(5,5′-dithiobis-nitrobenzoic acid，DTNB)]，充分振蕩混勻，取上清200μL加入96孔板中，在5 min內(nèi)，用酶標(biāo)儀測定

D

(412)值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中GSH含量。

1.2.6 SOD活性測定

采用黃嘌呤氧化酶法測定抗氧化酶SOD活性。細(xì)胞按實驗分組處理24 h時間后，收集細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min。棄上清，用冷PBS重懸細(xì)胞，4 000 r/min離心5 min。沉淀中加入200μL裂解液，4℃裂解30 min。9 200 r/min離心5 min，收集上清液。按試劑盒說明書進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀測定

D

(550)值，按公式計算樣品中SOD活性。

1.2.7 HO-1蛋白和Nrf2蛋白表達(dá)水平檢測

應(yīng)用Western blot檢測細(xì)胞中HO-1蛋白及Nrf2蛋白表達(dá)水平。L-02細(xì)胞接種在培養(yǎng)瓶中，按實驗分組處理24 h后，收集細(xì)胞，加入裂解液在冰上裂解細(xì)胞，提取蛋白。BCA法測定蛋白濃度。細(xì)胞樣品在100℃水浴中加熱4 min，以充分變性蛋白。每孔上樣10μg總蛋白，在SDS-PAGE中進(jìn)行電泳分離，然后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉2 h后，加入一抗(1∶500)，室溫孵育1 h后，4℃冰箱孵育過夜。用TBST洗膜后，加入二抗(1∶3 000)室溫孵育1 h。TBST洗膜后，用ECL發(fā)光液檢測目標(biāo)蛋白條帶的光密度，采用Quantity One 4.6.2圖像分析軟件對樣品中目標(biāo)蛋白進(jìn)行定量。以β-actin作為漿蛋白內(nèi)參，H3作為核蛋白內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞存活率

MTT法檢測結(jié)果見圖1，與陰性對照組比較，INH組L-02細(xì)胞的存活率明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

＜0.01)，而單用槲皮素對細(xì)胞存活率無明顯影響(

P

＞0.05)，表明槲皮素對L-02細(xì)胞無明顯毒性作用；與INH組相比較，槲皮素保護(hù)組的細(xì)胞存活率明顯增加(

P

＜0.01)，表明槲皮素對INH誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

圖1 細(xì)胞存活率

2.2 細(xì)胞線粒體ROS水平

由圖2可見，L-02細(xì)胞經(jīng)INH處理后，細(xì)胞線粒體ROS相對水平顯著升高，與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

＜0.01)；與INH組相比，槲皮素保護(hù)組細(xì)胞線粒體ROS相對水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

＜0.01)，表明槲皮素可抑制細(xì)胞線粒體ROS生成。

圖2 細(xì)胞線粒體ROS水平

2.3 細(xì)胞MDA含量

由圖3可見，INH組與陰性對照組比較，MDA含量顯著升高(

P

＜0.01)；而槲皮素保護(hù)組與INH組相比，細(xì)胞MDA含量明顯減少(

P

＜0.01)，表明槲皮素能抑制INH誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。

2.4 細(xì)胞GSH含量

由圖4可見，與陰性對照組比較，INH處理細(xì)胞后GSH的含量明顯降低(

P

＜0.01)；而槲皮素保護(hù)組細(xì)胞GSH含量明顯增加，與INH組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

＜0.05)，表明槲皮素能提高細(xì)胞的抗氧化能力。

圖3 細(xì)胞MDA含量

圖4 細(xì)胞GSH含量

2.5 細(xì)胞SOD活性

由圖5可見，INH組與陰性對照組比較，SOD活性顯著降低(

P

＜0.01)；而槲皮素保護(hù)組與INH組比較，SOD活性明顯升高(

P

＜0.01)，表明槲皮素可增加細(xì)胞的抗氧化酶活性。

圖5 細(xì)胞SOD活性

2.6 細(xì)胞質(zhì)中HO-1蛋白及細(xì)胞核中Nrf2蛋白表達(dá)

由表1可見，INH組細(xì)胞質(zhì)中HO-1蛋白及細(xì)胞核中Nrf2蛋白表達(dá)水平明顯增加，與陰性對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

＜0.01)；而槲皮素保護(hù)組細(xì)胞質(zhì)中HO-1蛋白及細(xì)胞核中Nrf2蛋白表達(dá)水平高于INH組(

P

＜0.01)，表明槲皮素可進(jìn)一步激活Nrf2/ARE通路。

表1 細(xì)胞質(zhì)中HO-1蛋白及細(xì)胞核中Nrf2蛋白表達(dá)水平

3 討論

近年來，線粒體損傷在藥物性肝損傷機(jī)制研究中的作用越來越受到關(guān)注。線粒體是外源化合物細(xì)胞毒性的主要靶點(diǎn)，也是氧化損傷的主要靶細(xì)胞器。本研究結(jié)果顯示，INH處理細(xì)胞24 h后細(xì)胞存活率降低，表明INH對L-02細(xì)胞具有毒性作用；而INH聯(lián)合槲皮素作用后，細(xì)胞存活率明顯增高，提示槲皮素對細(xì)胞毒性有一定的保護(hù)作用。線粒體是細(xì)胞產(chǎn)生ROS的主要場所，ROS過多生成可損傷線粒體膜，導(dǎo)致線粒體損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)INH處理后，細(xì)胞線粒體中ROS水平和MDA含量顯著升高，而GSH含量和SOD的活性顯著降低，表明在本實驗條件下INH可誘導(dǎo)肝細(xì)胞線粒體氧化損傷。

槲皮素是植物界分布較廣的黃酮類化合物，具有良好的保肝作用，且使用安全，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。大量研究表明，槲皮素在體外可通過清除氧自由基、抑制DNA損傷等發(fā)揮抗氧化作用。體內(nèi)實驗證實槲皮素可通過降低脂質(zhì)過氧化物水平、增加抗氧化物含量及提高抗氧化酶活性對脂多糖誘導(dǎo)的肝臟氧化損傷發(fā)揮保護(hù)作用。Liu等也證實槲皮素可通過降低MDA水平、增加GSH含量及提高SOD和GSH-Px等抗氧化酶活性來預(yù)防大鼠酒精性肝損傷。近年來，槲皮素經(jīng)線粒體途徑發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用越來越引起人們的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)槲皮素具有逆轉(zhuǎn)HO引起的細(xì)胞氧化損傷和凋亡作用，其機(jī)制與抗氧化和穩(wěn)定線粒體膜，阻止促凋亡途徑有關(guān)，提示槲皮素對線粒體氧化損傷有保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能降低L-02細(xì)胞線粒體ROS水平和MDA含量，增加GSH含量及SOD活性，提示槲皮素對INH誘導(dǎo)的肝細(xì)胞線粒體氧化損傷有抑制作用，可能是通過減少細(xì)胞線粒體ROS生成，保護(hù)細(xì)胞線粒體，增加細(xì)胞抗氧化物GSH含量及抗氧化酶SOD活性發(fā)揮作用的。

Nrf2/ARE信號通路已成為氧化應(yīng)激相關(guān)疾病預(yù)防和治療的靶點(diǎn)。在誘導(dǎo)激活后，Nrf2轉(zhuǎn)入細(xì)胞核中與ARE結(jié)合啟動下游II相代謝酶和抗氧化酶基因表達(dá)，如HO-1、NQO1、SOD等，促使細(xì)胞增強(qiáng)清除ROS的能力，從而發(fā)揮抗氧化損傷作用。Liu等研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可通過激活Nrf2/HO-1通路上調(diào)HO-1表達(dá)改善鎳誘導(dǎo)的小鼠肝氧化損傷。另有研究發(fā)現(xiàn)槲皮素對雷公藤甲素致小鼠免疫性肝損傷具有保護(hù)作用，其作用也與激活Nrf2/ARE信號通路有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，L-02細(xì)胞經(jīng)INH處理后，與陰性對照組相比，Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)明顯增多，而槲皮素保護(hù)組細(xì)胞中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)顯著高于INH組，表明槲皮素誘導(dǎo)更多的Nrf2轉(zhuǎn)位入核，增加下游靶基因

HO-1

等的表達(dá)。Ji等也證實了槲皮素可通過激活p62-Keap1-Nrf2通路，減輕對乙酰氨基酚(paracetamol，APAP)和CCl誘導(dǎo)的線粒體氧化應(yīng)激導(dǎo)致的肝損傷。因此，我們認(rèn)為槲皮素可激活細(xì)胞中Nrf2/ARE信號通路，提高細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH的含量，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化損傷的能力，促進(jìn)線粒體ROS清除，從而抑制INH誘導(dǎo)的肝細(xì)胞線粒體損傷。

綜上所述，在本研究條件下，INH可誘導(dǎo)L-02細(xì)胞線粒體氧化損傷，槲皮素能夠抑制INH誘導(dǎo)的肝細(xì)胞線粒體氧化損傷，其機(jī)制可能與槲皮素對Nrf2/ARE信號通路的活性調(diào)節(jié)相關(guān)。