張玉領(lǐng)，陳 培

(江蘇護(hù)理職業(yè)學(xué)院，江蘇 淮安 223005)

中國國家癌癥中心統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2015年中國新發(fā)癌癥429.2萬例，癌癥死亡281.4萬例，在導(dǎo)致中國人群死亡排名前5位的腫瘤中食管癌位居第4位。盡管食管癌相關(guān)診療手段不斷進(jìn)步，但由于食管癌惡性程度高，預(yù)后較差，5年生存率僅為15%～34%。為改善治療，提高生存率，需要尋找新的影響食管癌發(fā)生發(fā)展的生物標(biāo)志物和治療靶點，為臨床診療提供依據(jù)。

1976年，Sanger等在植物類病毒中發(fā)現(xiàn)了一種共價閉合的單鏈環(huán)狀RNA分子，稱之為環(huán)狀RNA(circRNAs)。隨后又有研究者相繼在酵母線粒體等多處發(fā)現(xiàn)circRNAs。但由于當(dāng)時檢測技術(shù)的局限性，circRNAs被認(rèn)為是外顯子轉(zhuǎn)錄發(fā)生錯誤剪接形成的干擾產(chǎn)物，并未引起人們重視。對circRNAs結(jié)構(gòu)和功能的研究不僅幫助我們深入了解腫瘤的發(fā)生機制，而且為腫瘤的診斷和治療提供新的方向。有研究表明，circRNAs在食管癌中表達(dá)顯著改變，具有腫瘤早期診斷的潛在應(yīng)用價值。由于在食管癌中表達(dá)改變的circRNAs較多，表達(dá)上調(diào)或下調(diào)不一，本文就circRNAs的特征、生物學(xué)功能及其在食管癌中的作用進(jìn)行綜述。

1 circ RNAs

1.1 circRNAs的結(jié)構(gòu)與特點

長鏈非編碼RNA(lncRNAs)、環(huán)狀RNA(circRNAs)和小RNA(miRNAs)，這3種非編碼RNA約占真核細(xì)胞RNA總量的95%。與傳統(tǒng)的線性RNA相比，circRNAs的5′和3′末端連接在一起，反向剪接形成共價閉合環(huán)狀RNA結(jié)構(gòu)，不受RNA外切酶影響，因此不易降解，更為穩(wěn)定。自circRNAs在病毒中被發(fā)現(xiàn)以來的近40年中，circRNAs被認(rèn)為是錯誤的和無功能的轉(zhuǎn)錄片段。隨著高通量測序技術(shù)的迅速發(fā)展，circRNAs被證實了在轉(zhuǎn)錄體中廣泛存在。circRNAs被認(rèn)為是影響細(xì)胞分化和組織穩(wěn)態(tài)以及疾病發(fā)展的重要調(diào)節(jié)因子。circRNAs主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，在真核細(xì)胞中表達(dá)豐富，具有組織特異性且高度穩(wěn)定。

1.2 circ RNAs的功能

1.2.1 吸附miRNA

circRNAs通過miRNA結(jié)合位點結(jié)合miRNA，解除miRNA對其靶基因的調(diào)節(jié)作用，阻止miRNA在3′非翻譯區(qū)與mRNA相互作用，升高miRNA下游靶基因的表達(dá)水平，發(fā)揮競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)作用。2013年，研究報道，小腦變性相關(guān)蛋白-1(cerebellar degeneration-related protein 1，

CDR1

)基因起源的環(huán)狀RNA(ciRS-7)可以結(jié)合吸附miR-7，降低miR-7的活性，間接上調(diào)miR-7相關(guān)靶基因的表達(dá)(圖1)。由于環(huán)狀RNA的穩(wěn)定性，在機體內(nèi)對microRNA的吸附能力要強于線性mRNA和lncRNA。環(huán)狀RNA E3泛素蛋白連接酶(circular RNA itchy E3 ubiquitin protein ligase，circ-ITCH)與miR-330-5p結(jié)合后通過上調(diào)沉默信息調(diào)節(jié)因子(silent information regulator，SIRT6)、生存素(Survivin)和心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)Ca-ATP酶(sarcoplasmic reticulum calcium pump，SERCA2a)，降低阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷和功能障礙，是阿霉素致心臟毒性治療的新靶點。

圖1 circRNAs結(jié)合miRNA[7]

1.2.2 調(diào)控基因表達(dá)

circRNAs可以順式調(diào)控親本基因的表達(dá)。一方面，circRNAs與RNA結(jié)合蛋白(RBP)結(jié)合，改變剪接模式或mRNA穩(wěn)定性，影響親本基因mRNA的表達(dá)。另一方面，環(huán)狀RNA形成過程中內(nèi)含子間競爭性互補配對可以與線性RNA之間達(dá)成一種平衡，影響mRNA的表達(dá)，甚至蛋白翻譯。circRNAs雖然屬于非編碼RNA，但有部分circRNAs可被核糖體翻譯并編碼多肽，進(jìn)而發(fā)揮調(diào)控功能。

1.2.3 潛在的腫瘤標(biāo)志物

circRNAs具有特殊的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，不易被RNA外切酶降解，穩(wěn)定性顯著優(yōu)于線性RNA，并廣泛存在于腫瘤組織、血液及其他體液中。有研究表明，circRNAs在肝癌、胃癌、食管癌、結(jié)直腸癌等腫瘤中表達(dá)顯著改變，具有腫瘤早期診斷的潛在價值。如hsa-circ-0008934在肝細(xì)胞癌組織中高表達(dá)，且與較大腫瘤直徑、高水平AFP、癌細(xì)胞低分化程度及較差的預(yù)后密切相關(guān)。circ-0005075在結(jié)直腸癌發(fā)展過程中參與細(xì)胞黏附，其表達(dá)與腫瘤大小有關(guān)，具有良好的診斷潛力。circ-0067934位于細(xì)胞漿內(nèi)，在食管鱗癌中顯著高表達(dá)，沉默其表達(dá)可以抑制細(xì)胞的增殖和遷移，阻斷細(xì)胞周期的進(jìn)展。

2 circRNA與食管癌

在關(guān)于circRNAs與食管癌的相關(guān)研究中，我們發(fā)現(xiàn)40余項研究報道了28個circRNA在食管癌中表達(dá)有改變，其中23個circRNA在食管癌中表達(dá)上調(diào)，5個circRNA在食管癌中表達(dá)下調(diào)，結(jié)果見表1。

表1 食管癌中表達(dá)改變的circRNA及其目標(biāo)miRNA

2.1 食管癌中表達(dá)上調(diào)的circ RNAs

我們檢索后發(fā)現(xiàn)，circRNAs在食管癌中以表達(dá)上調(diào)為主，作用機制主要是通過內(nèi)源性競爭結(jié)合目標(biāo)miRNA位點，調(diào)控信號傳導(dǎo)通路。下面我們選擇研究報道相對較多，在食管癌中表達(dá)上調(diào)的circRNA-ciRS-7、hsa-circRNA-0067934、circRNAPRDM5和hsa-circRNA-100873的作用機制進(jìn)行概述。

2.1.1 circ RNA-ciRS-7

Li等研究發(fā)現(xiàn)：在食管癌組織中circRNA-ciRS-7表達(dá)顯著高于正常食管組織，而且ciRS-7的上調(diào)與食管癌臨床病理特征與預(yù)后不良密切相關(guān)。ciRS-7的靶向分子是miR-7，它結(jié)合miR-7后，通過激活其下游HOXB13(homeobox B13)介導(dǎo)的NF-κB/p65通路而發(fā)揮作用(圖2)。已有的研究表明miR-7能夠直接靶向下調(diào)腫瘤相關(guān)信號通路中的表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、胰島素受體底物-1(insulin receptor substrate，IRS-1)、磷酸肌醇3激酶催化亞基δ(phosphoinositide 3-kinase catalytic subnit delta，PIK3CD)等致癌因子，具有明顯的抑瘤作用，而ciRS-7的過表達(dá)使miR-7的抑瘤作用消失。ciRS-7/miR-7/HOXB13通路在食管鱗狀細(xì)胞癌中異常激活，可能是食管癌治療的特異性靶點。Huang等的研究結(jié)果也表明ciRS-7在72.4%的食管癌組織和KYSE150、KYSE140、KYSE70、Eca9706等食管癌細(xì)胞系中均高表達(dá)，能夠顯著增強食管癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。miR-7的過表達(dá)或鋅指轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白-4(Krüppel-like factor 4，

KLF-4

)基因敲除均能減弱ciRS-7在食管癌中的腫瘤促進(jìn)作用。ciRS-7通過miR-7/KLF4調(diào)節(jié)和活化食管癌NF-κB/p65信號通路，同時，ciRS-7也可通過IKKα信號途徑上調(diào)p65的表達(dá)，調(diào)控NF-κB/p65信號通路。

圖2 ciRS-7結(jié)合miR-7調(diào)控HOXB13/p-P65信號通路[15]

Sang等研究發(fā)現(xiàn)，食管癌中ciRS-7表達(dá)顯著上調(diào)，與食管癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲密切相關(guān)。ciRS-7中有19個miR-876-5p結(jié)合位點，能夠特異性結(jié)合miR-876-5p。ciRS-7通過靶向miR-876-5p/MAGE-a，調(diào)控miR-876-5p介導(dǎo)的MAGE-a家族在食管癌中的抑制作用，增強癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。

2.1.2 hsa-circ RNA-0067934

Hsa-circ-0067934位于人類染色體3q26.2，包含2個外顯子(圖3)，這兩個外顯子通過背部反向剪接形成hsa-circ-0067934。研究發(fā)現(xiàn)，hsa-circ-0067934在食管鱗狀細(xì)胞癌中顯著過表達(dá)，體外實驗證實：干擾hsacirc-0066934的表達(dá)能夠抑制食管鱗狀癌細(xì)胞的增殖和遷移并阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程，認(rèn)為hsa-circ-0066934是食管鱗狀細(xì)胞癌潛在生物標(biāo)志和治療靶標(biāo)。

圖3 外顯子通過染色體3q26.2的反向剪接形成hsa-circ-0067934[13]

2.1.3 circ RNA-PRDM5

胡學(xué)廷等研究發(fā)現(xiàn)，在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中circRNA-PRDM5表達(dá)顯著高于癌旁正常組織。同時體外細(xì)胞試驗也證實circRNA-PRDM5在食管癌細(xì)胞系中高表達(dá)，通過siRNA沉默circRNA-PRDM5在食管癌細(xì)胞中的表達(dá)后，KYSE150和ECA109食管癌細(xì)胞的遷移和侵襲功能明顯受到抑制。將合成的circRNA-PRDM5干擾序列轉(zhuǎn)染擴增后接種到裸鼠體內(nèi)，裸鼠瘤體生長速度顯著慢于對照組，結(jié)果表明干擾circRNA-PRDM5的表達(dá)能夠顯著抑制食管癌細(xì)胞的成瘤能力。

2.1.4 hsa-circ RNA-100873

Zheng等研究發(fā)現(xiàn)食管癌組織中hsa-circRNA-100873表達(dá)顯著高于正常組織，且在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移食管癌組織中的表達(dá)顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織，提示其在腫瘤轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮重要作用，hsa-circRNA-100873的上調(diào)可能與食管鱗癌淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。已報道的在食管癌中表達(dá)上調(diào)的circRNA還有環(huán)狀RNA蛋白激酶C(circular RNA protein kinase C，circ-PRKCI)、circRNA-100367、hsa-circRNA-0000654等，通過體內(nèi)體外試驗均已證實其在食管癌組織和食管癌細(xì)胞系中過表達(dá)，作用機制主要是內(nèi)源性競爭結(jié)合目標(biāo)miRNA位點，通過miRNA影響PI3K-AKT、STAT3、mTOR等信號通路，影響細(xì)胞增殖、分化和侵襲。上調(diào)的circRNA是食管癌發(fā)生發(fā)展的促癌因素，干擾或沉默這些circRNAs的表達(dá)可抑制食管癌細(xì)胞的增殖和侵襲。

2.2 食管癌中表達(dá)下調(diào)的circRNAs

已報道的在食管癌中表達(dá)下調(diào)的circRNAs僅有circ-ITCH、circ-VRK1、circ-LARP4、circRNA-0043898和circ-SMAD7共5個，我們選擇了相關(guān)研究報道較多的circ-ITCH和circ-VRK1進(jìn)行概述。

2.2.1 circ-ITCH

circ-ITCH位于人類染色體20q11.22。研究表明，circ-ITCH的異常表達(dá)與前列腺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌和食管鱗狀細(xì)胞癌等多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。在食管鱗癌中，circ-ITCH通過結(jié)合miR-7、miR-17和miR-214，增加ITCH表達(dá)。過表達(dá)的ITCH促進(jìn)磷酸化Dvl2的泛素化和降解，抑制Wnt/β-catenin途徑，通過調(diào)節(jié)Wnt途徑抑制食管鱗癌的發(fā)生與發(fā)展。

2.2.2 circ-VRK1

He等研究報道，在食管癌組織和KYSE150、KYSE450、EC109和Eca9706食管癌細(xì)胞系中，發(fā)現(xiàn)circ-VRK1表達(dá)均顯著下調(diào)，同時發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的circ-VRK1能夠顯著抑制癌細(xì)胞增殖，增強癌細(xì)胞對放射治療的敏感度。circ-VRK1通過增加E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達(dá)，降低Ncadherin、Vimentin等表達(dá)逆轉(zhuǎn)上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)，降低癌細(xì)胞遷移和侵襲能力。miR-624-3p是食管癌的促發(fā)因子，沉默miR-624-3p表達(dá)后，KYSE150和KYSE450食管癌細(xì)胞生長明顯受到抑制。Circ-VRK1能夠通過結(jié)合miR-624-3p調(diào)控PTEN表達(dá)，miR-624-3p過表達(dá)或PTEN敲除均能逆轉(zhuǎn)過表達(dá)circ-VRK1的癌細(xì)胞的生長抑制和放射敏感性，進(jìn)一步明確了circ-VRK1-miR-624-3p-PTEN-PI3K-AKT途徑影響食管癌細(xì)胞增殖、分化的作用機制。

在食管癌中表達(dá)下調(diào)的circRNA還有circ-LARP4、circRNA-0043898和circ-SMAD7。circ-LARP4通過結(jié)合miR-1323調(diào)控PI3K/AKT信號通路，circRNA-0043898通過影響H3和BMI1表達(dá)，影響癌細(xì)胞的增殖和分化。下調(diào)的circRNA作為潛在的食管癌抗癌靶基因仍需要進(jìn)一步深入研究，為食管癌的早期診斷和靶向治療提供理論依據(jù)。

3 展望

隨著高通量測序和生物信息技術(shù)的飛速發(fā)展，對circRNAs的認(rèn)識逐漸深入。雖然對circRNAs的相關(guān)研究仍處于起步階段，circRNAs分析算法的準(zhǔn)確性亦有待進(jìn)一步提高，但circRNAs具有廣泛性、穩(wěn)定性及特異性等特性均預(yù)示它在未來可能作為一種新型的生物標(biāo)志物和腫瘤治療靶點。當(dāng)前的研究主要集中在其表達(dá)改變和作為RNA海綿的吸附作用上，對于circRNA表達(dá)改變和調(diào)控基因表達(dá)的分子機制尚不明確，多數(shù)circRNAs與其親本基因的關(guān)系亦不清楚，對于不同類型的食管癌與circRNAs表達(dá)關(guān)聯(lián)性的研究報道也還較少。隨著研究的不斷深入，越來越多與腫瘤相關(guān)的circRNAs被發(fā)現(xiàn)，但circRNAs的命名還不夠規(guī)范，亟須建立circRNAs的通用標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范。

circRNAs不僅與食管癌緊密相關(guān)，和其他多種疾病亦關(guān)系密切，并在這些疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要的調(diào)控作用。因此，它有望在日后成為一種高效能的臨床標(biāo)記物和特異性的治療靶點，為某些疾病的早期診斷和靶向治療提供新途徑。