范玉宏，周海豐，范 爽，王立坤，侯雅雄，，劉 博

(1．河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理教研室，河北 張家口 075000；2．河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院普通外科，河北 張家口 075000；3．河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科，河北 張家口 075000；4．河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理科，河北 張家口 075000)

我國(guó)食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)較為高發(fā)，其發(fā)病率和死亡率一直居高不下，年均新增病例達(dá)到21萬(wàn)例，死亡率達(dá)到30%。占同期全球食管癌新增及死亡病例近一半，防治形勢(shì)不容樂觀。90%以上的食管癌為鱗狀細(xì)胞癌。由于其發(fā)病隱匿，早期無(wú)明顯癥狀，且缺乏有效的篩查方法，大部分患者診斷時(shí)為中晚期，并伴有局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，無(wú)法行根治性切除，且術(shù)后的高復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率亦是影響其治療的重要危險(xiǎn)因素。有研究表明趨化因子及其相關(guān)受體在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。CXC趨化因子受體2(CXC chemo-kine receptor 2，CXCR-2)作為最重要的趨化因子受體家族之一，其配體為CXCL-1、CXCL-2等炎癥趨化因子，參與骨髓來(lái)源單核細(xì)胞的募集和分化，而CXCR-2在食管鱗癌中的表達(dá)及預(yù)后評(píng)估鮮有報(bào)道?；|(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotein-9，MMP-9)主要功能是對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜進(jìn)行有效降解從而增強(qiáng)癌細(xì)胞侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的能力。腫瘤通過(guò)分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)誘導(dǎo)血管生成，從而使腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移，VEGF的過(guò)表達(dá)可以被認(rèn)為是預(yù)后不良和侵襲性腫瘤表型的標(biāo)志。由于CXCR-2對(duì)靶基因的調(diào)控作用具有時(shí)序特異性，癌組織中MMP-9、VEGF的異常表達(dá)是否由CXCR-2的表達(dá)異常所致，目前尚未見報(bào)道。本研究通過(guò)檢測(cè)CXCR-2與MMP-9、VEGF mRNA和蛋白在兩組中的表達(dá)，探討其在食管鱗癌產(chǎn)生中的作用和三者的相關(guān)性，并分析CXCR-2的表達(dá)對(duì)食管鱗癌的輔助診斷意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本

2016年12月—2019年12月于河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院行食道鱗癌手術(shù)的患者70例，其中男性41例，女性29例，年齡44～75歲，中位年齡為58歲。術(shù)中留取癌組織并且距腫瘤邊界5 cm以外的正常癌旁組織標(biāo)本(經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)為正常組織)。所有患者術(shù)前均未接受放射治療，化療及靶向治療。所有手術(shù)切除的標(biāo)本在離體后30 min內(nèi)收集，分成兩部分，一部分迅速放入含RNA later的凍存管內(nèi)，于4℃冰箱過(guò)夜后轉(zhuǎn)入-20℃冰箱保存；另一部分用福爾馬林固定，然后制成蠟塊保存。標(biāo)本及資料收集均經(jīng)患者本人知情同意，此研究獲得河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)同意并批準(zhǔn)。

1.2 試劑和儀器

Trizol RNA試劑盒購(gòu)于天根生物有限公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)于日本Takara公司；熒光定量PCR試劑購(gòu)于美國(guó)ABI公司；CXCR-2、MMP-9、VEGF和GAPDH引物由上海生工設(shè)計(jì)合成，全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀購(gòu)自瑞士羅氏公司E2010，DEPC水購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，兔抗人CXCR-2單克隆抗體、MMP-9、VEGF抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，二抗購(gòu)于美國(guó)Proteintech Group公司。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 總RNA提取及c DNA合成

參照Trizol使用說(shuō)明抽提癌組織及正常癌旁組織的總RNA，溶于無(wú)RNase水中，測(cè)定抽提RNA濃度，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃儲(chǔ)存。應(yīng)用miRNA提取分離試劑盒提取上述組織的miRNA，檢測(cè)其純度和濃度后，應(yīng)用miScript II RT試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?p>1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量法

引物設(shè)計(jì)參考相關(guān)文獻(xiàn)：CXCR-2，正向5′-ATCTCTTCGACTACTCA-3′，反向5′-GTAGACCAGGACGCTTTTGTT-3′；MMP-9，正向5′-GGGACGCAGACATCGTCATC-3′，反 向5′-TCG TCATCGTCGAAATGGGC-3′；VEGF，正向5′-GGCC TCCGAAACCATGAACT-3′，反向5′-TCGTGATGATT CTGCCCTCCG-3′，內(nèi)參GAPDH，正向5′-GTCAAGG CTGAGAACGGGAA-3′，反向5′-AAATGAGCCCCAG CCTTCTC-3′。反應(yīng)條件設(shè)定：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。根據(jù)系統(tǒng)生成的樣本

C

值，采用2法進(jìn)行分析，計(jì)算CXCR-2、MMP-9和VEGF的相對(duì)表達(dá)水平，每個(gè)樣本均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.3.3 免疫組化檢測(cè)CXCR-2、MMP-9和VEGF蛋白的表達(dá)情況

蠟塊標(biāo)本切成4μm厚度切片，常規(guī)進(jìn)行脫蠟水化，再用3%HO孵育5 min后修復(fù)抗原，滴加10%正常山羊血清，37℃孵育15 min，倒去血清，滴入一抗，37℃孵育60 min；PBS緩沖液沖洗后，加入二抗，37℃孵育30 min，滴入工作液，37℃孵育30 min，DAB顯色后染色液孵育20 s；然后用中性樹膠封片處理。在顯微鏡20倍視野中計(jì)算細(xì)胞的陽(yáng)性百分率并采集圖片：陽(yáng)性細(xì)胞≤5%為0分，＞5%～25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%為4分；根據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分為：未染色為0分，低度染色為1分，中等染色為2分，高度染色為3分；兩項(xiàng)評(píng)分的乘積為最終的評(píng)分，總積分≤3分為陰性，＞3分為陽(yáng)性，由病理科兩位高年資主任醫(yī)師閱片，雙盲評(píng)估，根據(jù)其評(píng)分的平均值判定結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 食管鱗癌組織中CXCR-2、MMP-9和VEGF mRNA的表達(dá)水平

本研究采用qPCR檢測(cè)食管鱗癌組織中CXCR-2、MMP-9和VEGF mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果見圖1，可見CXCR-2 mRNA在癌組織中的相對(duì)表達(dá)水平為1.75±0.42，顯著高于癌旁組織的0.90±0.21，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

=9.058，

P

＜0.01)；MMP-9和VEGF在癌組織中的相對(duì)表達(dá)水平分別為1.84±0.40和1.79±0.38，均顯著高于二者在癌旁正常組織中的0.85±0.22和0.83±0.20，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

t

值分別為10.195和10.377，均為

P

＜0.01)。

圖1 qPCR法檢測(cè)食管組織中CXCR-2、MMP-9和VEGF mRNA的相對(duì)表達(dá)水平

2.2 免疫組化檢測(cè)CXCR-2、MMP-9和VEGF蛋白的表達(dá)水平

免疫組化檢測(cè)的結(jié)果見表1和圖2。癌組織中CXCR-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為84.29%(59/70)，明顯高于癌旁正常組織37.14%(26/70)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；(

χ

=18.441，

P

=0.000)；MMP-9和VEGF蛋白在癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為80.00%(56/70)和77.14%(54/70)較正常癌旁組織41.43%(29/70)和35.71%(25/70)均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為

P

＜0.01)。

表1 CXCR-2、MMP-9和VEGF蛋白在食管鱗癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)(n=70)

2.3 食管癌臨床病理指標(biāo)與CXCR-2、MMP-9和VEGF蛋白表達(dá)的關(guān)系

癌組織中CXCR-2、MMP-9和VEGF蛋白的表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果見表2，可見CXCR-2、MMP-9和VEGF的表達(dá)與腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和肝轉(zhuǎn)移有關(guān)(

P

均＜0.05)。CXCR-2、MMP-9和VEGF蛋白表達(dá)水平越高，TNM分期越高。伴癌旁轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者三者的表達(dá)程度明顯高于未轉(zhuǎn)移的患者(均為

P

＜0.05)，而CXCR-2、MMP-9和VEGF蛋白表達(dá)水平與腫瘤大小無(wú)明顯相關(guān)(均為

P

＞0.05)。

圖2 免疫組化檢測(cè)兩組食管組織中CXCR-2、MMP-9、VEGF的表達(dá)情況(SP法，×400)

表2 癌組織中CXCR-2、MMP-9和VEGF蛋白的表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

2.4 癌組織中CXCR-2、MMP-9和VEGF蛋白表達(dá)的相關(guān)性

CXCR-2與MMP-9、VEGF蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析結(jié)果見表3，可見CXCR-2表達(dá)水平與MMP-9、VEGF表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(

r

分別為0.488和0.491，均為

P

＜0.01)。

表3 在癌組織中CXCR-2與MMP-9、VEGF蛋白表達(dá)的相關(guān)性

2.5 CXCR-2表達(dá)對(duì)食管鱗癌的診斷意義

ROC曲線分析結(jié)果見圖3，可見CXCR-2診斷食管鱗癌的AUC值為0.938，95%可信區(qū)間為(0.908，0.972)。提示CXCR-2表達(dá)對(duì)腫瘤的診斷具有較高的準(zhǔn)確性，其臨界值為0.77，在最優(yōu)截?cái)帱c(diǎn)敏感度和特異度分別為91.2%和80.9%；漏診率和誤診率分別為9.0%和19.2%。

3 討論

圖3 CXCR-2表達(dá)水平判斷食管鱗癌的ROC曲線

食管鱗癌作為最常見和致命的惡性腫瘤之一，死亡率高居第6位，發(fā)病率排名第8位，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。食管癌主要分為食管鱗狀細(xì)胞癌和食管腺癌，我國(guó)以食管鱗狀細(xì)胞癌最為常見。由于目前缺少十分有效的治療手段，且食管癌經(jīng)手術(shù)切除后容易發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移；雖然隨著診斷和治療技術(shù)不斷 完善，但食管癌預(yù)后仍然極差，5年生存率僅約為10%。而食管鱗癌的侵襲與轉(zhuǎn)移機(jī)制是研究食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，對(duì)于提高食管鱗癌的早診早治率和生存率具有較大的社會(huì)價(jià)值。

有研究表明趨化因子超家族和其相關(guān)受體在多種實(shí)體腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮必不可少的重要作用。研究證實(shí)，以CXCR-2為代表的趨化因子及其受體廣泛分布在人體諸多組織中，其在機(jī)體感染、創(chuàng)傷、異常增殖和免疫排斥等多種病理生理過(guò)程中對(duì)感染源的清除、創(chuàng)傷的加速愈合、異常增殖細(xì)胞的殺滅和異物清除等方面發(fā)揮重要作用。近年來(lái)CXCR-2在腫瘤組織中的作用逐步為廣大醫(yī)師所熟知，癌細(xì)胞可使CXCR-2的表達(dá)上調(diào)，且CXCR-2不但不抑制癌細(xì)胞的致瘤活動(dòng)，反而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。

CXCR-2

基因定位于人染色體2q35上，包括2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子，已有研究證實(shí)人體多種惡性腫瘤存在CXCR-2表達(dá)，且CXCR-2表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)，在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和浸潤(rùn)過(guò)程中起著重要的作用。有學(xué)者研究證實(shí)CXCR2可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞內(nèi)MMP-9蛋白表達(dá)和膠原酶活性，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力和體內(nèi)微血管密度的增加。MMPs也稱為基質(zhì)蛋白，屬于一組鋅依賴性蛋白，是可以分解各種功能性蛋白和糖蛋白的酶，介導(dǎo)細(xì)胞表面或細(xì)胞之間大分子的破壞，這是腫瘤侵襲的重要早期步驟，MMPs還具有血管生成活性，并參與腫瘤發(fā)生和原發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)的早期階段，有研究顯示，腫瘤侵襲性與MMPs高表達(dá)有關(guān)，患者生存期的縮短與之有著直接的聯(lián)系。MMPs中最具代表性的是MMP-9，其具有降解細(xì)胞表面或細(xì)胞之間大分子的能力，同時(shí)可誘導(dǎo)間質(zhì)中脈管的生成，增強(qiáng)癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。

VEGF

基因位于人6號(hào)染色體，是內(nèi)皮促分裂原和血管生成刺激物，是腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)、侵襲過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)。

研究通過(guò)qPCR方法對(duì)兩組中CXCR-2的表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在癌組織中CXCR-2的表達(dá)較正常癌旁組織明顯升高，且臨床病理指標(biāo)分析表明CXCR-2的表達(dá)水平與腫瘤分化程度、TNM分期、肝轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。進(jìn)一步的Pearson相關(guān)性分析結(jié)果提示CXCR-2在腫瘤組織中的表達(dá)與MMP-9、VEGF表達(dá)呈明顯正相關(guān)性，這與以上報(bào)道結(jié)果基本相似。這提示上調(diào)CXCR-2的表達(dá)可能依賴于靶向調(diào)控MMP-9、VEGF的過(guò)表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移能力，促使食道癌的發(fā)生和發(fā)展。

在本研究中，我們還采用受試者工作特征曲線分析了CXCR-2的表達(dá)對(duì)腫瘤的診斷意義，結(jié)果顯示CXCR-2具有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值，可作為食管鱗癌的一個(gè)診斷預(yù)測(cè)指標(biāo)。經(jīng)過(guò)分析其臨界值為0.77，即在這一臨界值下所作出的診斷具有較高的參考價(jià)值?？紤]到食管病變組織標(biāo)本的不易獲得性、難保存性，在后續(xù)研究中，我們將進(jìn)一步探究食管病變患者血液組織中CXCR-2的表達(dá)情況，分析血液中CXCR-2表達(dá)對(duì)于食管癌早期篩查、早期診斷的意義和價(jià)值。此外，我們還將應(yīng)用熒光素酶報(bào)告基因載體實(shí)驗(yàn)繼續(xù)研究CXCR-2與MMP-9、VEGF的靶向關(guān)系。

綜上所述，CXCR-2、MMP-9、VEGF在食管癌組織中顯著高表達(dá)，其表達(dá)水平與食管鱗癌患者的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且CXCR-2表達(dá)水平對(duì)其診斷有重要預(yù)測(cè)價(jià)值。進(jìn)一步探索CXCR-2在食管鱗癌發(fā)生過(guò)程中的通路機(jī)制，將為食管鱗癌的早期診斷、早期治療提供新的思路。