羅 嬌，張坤馳，周 莉，

(1．貴州醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2．上海健康醫(yī)學(xué)院上海市分子影像學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201318；3．上海健康醫(yī)學(xué)院附屬周浦醫(yī)院腫瘤血液科，上海 201318；4．貴州工程職業(yè)學(xué)院，貴州 銅仁 554300)

乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤之一，是我國(guó)女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，死亡率居惡性腫瘤的第5位。三陰性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)是乳腺癌中的特殊亞型，其特點(diǎn)是雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)和人表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，Her-2)均表達(dá)缺失。三陰性乳腺癌占原發(fā)性乳腺癌的15%～20%，具有高度侵襲性，容易早期復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移；與非三陰性乳腺癌相比，TNBC患者發(fā)病年齡輕，腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生率更高，疾病進(jìn)展更快。作為易發(fā)生腦轉(zhuǎn)移的腫瘤之一，乳腺癌患者中腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生率為5%～20%。據(jù)報(bào)道，腦轉(zhuǎn)移是TNBC患者預(yù)后最差的生存指標(biāo)，其中位生存期約10個(gè)月。由于TNBC腦轉(zhuǎn)移發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制仍不清楚，臨床缺乏早期診斷及預(yù)測(cè)的分子標(biāo)志物，目前治療仍以化療為主，但治療效果不佳，預(yù)后差。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的microRNA(miRNA)被發(fā)現(xiàn)在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用。miRNA是長(zhǎng)度為22～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，大量研究發(fā)現(xiàn)其可參與細(xì)胞增殖、分化、代謝及凋亡等生物學(xué)過(guò)程。近期研究發(fā)現(xiàn)miRNA的表達(dá)變化在乳腺癌腦轉(zhuǎn)移中具有重要作用，發(fā)現(xiàn)miRNA可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transitions，EMT)、腫 瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)、腫瘤血管再生等途徑調(diào)控乳腺癌腦轉(zhuǎn)移。因此，研究miRNA在TNBC腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制已經(jīng)成為目前TNBC腦轉(zhuǎn)移早期診斷及藥物研發(fā)的迫切需要。本研究擬采用生物信息技術(shù)分析三陰性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231(MB-231)和其腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系MDA-MB-231Brm(MB-231Brm)中miRNA表達(dá)譜的差異，篩選出可能與TNBC腦轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNA并分析其靶基因的生物學(xué)功能，為進(jìn)一步研究TNBC腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系及主要試劑

MB-231和MB-231Brm細(xì)胞來(lái)自上海健康醫(yī)學(xué)院附屬周浦醫(yī)院的贈(zèng)予，兩株細(xì)胞均在含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的L-15培養(yǎng)基，置于37℃、CO體積分?jǐn)?shù)為5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。通過(guò)分析細(xì)胞的短串聯(lián)重復(fù)序列來(lái)鑒定細(xì)胞系，使用Lonza MycoAlert支原體檢測(cè)試劑盒(Lonza公司)檢測(cè)支原體污染為陰性。胎牛血清、L-15培養(yǎng)基和胰蛋白酶購(gòu)自Gibco公司，Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen公司，測(cè)序試劑盒TruSeq Small-RNA Sample Prep Kit(Illumina)、Mir-XmiRNA qRT-PCR TB GreenKit和Mir-XmiRNA qRTPCR TB GreenKit(Clontech)均購(gòu)自上海百賽生物科技有限公司，所有引物均購(gòu)自Qiagen公司，氯仿、異丙醇、乙醇、滅菌DEPC水均購(gòu)自上海生工生物有限公司，離心管、細(xì)胞培養(yǎng)瓶購(gòu)自Corning公司。

1.2 儀器

Master cycler PCR儀、冷凍離心機(jī)、可調(diào)式移液器均購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，Agilent 2100 Bioanalyzer購(gòu)自美國(guó)Agilent公司，Illumina高通量測(cè)序儀購(gòu)自美國(guó)Illumina公司，ABI Step One Plus Real-Time PCR System購(gòu)自美國(guó)Thermofisher公司，Nanodrop ND-1000 UV購(gòu)自美國(guó)Nanodrop公司，細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo公司，超凈工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 MB-231及MB-231Brm細(xì)胞中microRNA的提取

分別取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的MB-231和MB-231Brm細(xì)胞(5×10個(gè))，加入1 mL Trizol，混勻，室溫靜置5 min；加入1/5體積氯仿(200μL)，劇烈振蕩15 s，待溶液充分乳化無(wú)分相現(xiàn)象，室溫靜置5 min；12 000 g、4℃離心15 min；緩慢取出離心管，吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一個(gè)無(wú)RNase的離心管中；加入等體積的異丙醇(500μL)，上下顛倒充分混勻后，室溫靜置10 min；12 000 g、4℃離心10 min，棄上清；加入75%乙醇l mL洗滌，12 000 g、4℃離心5 min，加入20μL滅菌DEPC水溶解沉淀；并用Nanodrop ND-1000分光光度計(jì)測(cè)量濃度和純度，-80℃保存待用。

1.3.2 小RNA分離、RNA文庫(kù)的構(gòu)建及測(cè)序

用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離小RNA(small RNA，sRNA)，并切出長(zhǎng)度在18～30 nt之間的sRNA條帶，回收sRNA。隨后，按照TruSeq sRNA Sample Prep Kit說(shuō)明書上的操作步驟，將sRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用PAGE膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠后回收純化，完成RNA文庫(kù)的構(gòu)建。構(gòu)建好的RNA文庫(kù)使用Agilent 2100 Bioanalyzer儀器評(píng)估構(gòu)建的文庫(kù)的質(zhì)量，使用Illumina深度測(cè)序技術(shù)對(duì)構(gòu)建好的sRNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，獲得原始數(shù)據(jù)。

1.3.3 sRNA數(shù)據(jù)過(guò)濾、分類、預(yù)測(cè)及表達(dá)定量

sRNA原始數(shù)據(jù)通過(guò)雜質(zhì)過(guò)濾，去除無(wú)插入片段和測(cè)得5′接頭污染序列，低質(zhì)量序列等，獲得干凈序列(clean tags)。將數(shù)據(jù)過(guò)濾后的干凈序列和已知的sRNA數(shù)據(jù)庫(kù)miRBase、Rfam、siRNA、piRNA、snoRNA等進(jìn)行比對(duì)。按照：miRNA＞piRNA＞snoRNA＞Rfam＞其他sRNA的優(yōu)先級(jí)順序?qū)RNA遍歷注釋。通過(guò)和已知的sRNA數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，鑒定出已知的siRNA，對(duì)于未知的sRNA，基于miRNA的前體能夠形成發(fā)夾二級(jí)結(jié)果，使用miRDeep2軟件進(jìn)行新的miRNA預(yù)測(cè)。miRNA表達(dá)量的計(jì)算使用每百萬(wàn)比配對(duì)成對(duì)序列(transcripts per million，TPM)做miRNA表達(dá)量指標(biāo)，其中總比配成對(duì)read數(shù)目用于歸一化表達(dá)量數(shù)值，從而標(biāo)準(zhǔn)化sRNA的表達(dá)水平。

1.3.4 差異sRNA篩選(泊松分布)

差異sRNA的篩選參照差異基因檢測(cè)方法，對(duì)差異檢驗(yàn)的

P

值作多重假設(shè)檢驗(yàn)校正，通過(guò)控制偽發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)來(lái)決定

P

值的域值。FDR值越小，差異倍數(shù)越大，則表明表達(dá)差異越顯著，差異表達(dá)基因默認(rèn)定義為FDR≤0.001且差異倍數(shù)在2倍以上的基因。

1.3.5 GO顯著性富集分析

把差異表達(dá)小RNA對(duì)應(yīng)的靶基因向Gene Ontology數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.geneontology.org/)的各個(gè)term映射，計(jì)算每個(gè)term的基因數(shù)目，然后應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出與整個(gè)基因組背景相比，在差異表達(dá)小RNA對(duì)應(yīng)的靶基因中顯著富集的GO條目，參照軟件“GO：TermFinder”(http://www.yeastgenome.org/help/analyze/go-term-finder)。

1.3.6 qPCR驗(yàn)證

按照Mir-XmiRNA第1鏈合成試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。然后按照Mir-XmiRNA qRT-PCR TB GreenKit說(shuō)明書步驟進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列見(jiàn)表1。以U6為內(nèi)參，數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用非配對(duì)的

t

檢驗(yàn)，以

P

＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 MB-231與MB-231Brm細(xì)胞中sRNA種類具有差異性

sRNA測(cè)序結(jié)果顯示，MB-231與MB-231Brm細(xì)胞中包含的已知miRNA、未知miRNA，已知piRNA及未知piRNA數(shù)量及比例差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1A)，而在MB-231與MB-231Brm細(xì)胞中，miRNA的組分具有差異，MB-231與MB-231Brm細(xì)胞中，共有的miRNA有961種，MB-231細(xì)胞自有的miRNA有164種，MB-231Brm細(xì)胞自有的miRNA有196種(圖1B)。

2.2 MB-231與MB-231Brm細(xì)胞中miRNA表達(dá)具有差異性

圖1 MB-231與MB-231Brm細(xì)胞中sRNA餅狀圖及韋恩圖

sRNA測(cè)序結(jié)果顯示，MB-231與MB-231Brm細(xì)胞中miRNA的表達(dá)具有差異性，與MB-231相比，MB-231Brm細(xì)胞中，miRNA有145個(gè)表達(dá)顯著上調(diào)，54個(gè)表達(dá)顯著下調(diào)(

P

＜0.05)，1 122個(gè)表達(dá)未見(jiàn)明顯差異(圖2)。

圖2 MB-231與MB-231Brm細(xì)胞中miRNA表達(dá)的火山圖

2.3 兩種細(xì)胞中miRNA涉及的基因功能

GO功能分析顯示，MB-231與MB-231Brm中，差異表達(dá)miRNA所調(diào)控的基因與生物過(guò)程(biological process)、細(xì)胞組分(cellular component)及分子功能(molecular function)均有相關(guān)性(圖3)。在生物學(xué)過(guò)程中，差異表達(dá)的miRNA主要參與細(xì)胞形成過(guò)程、代謝過(guò)程、調(diào)節(jié)生物學(xué)過(guò)程及對(duì)外界刺激的反應(yīng)；在細(xì)胞組分中，差異表達(dá)的miRNA的基因功能主要參與細(xì)胞、細(xì)胞器及細(xì)胞膜的形成；在分子功能中，差異表達(dá)的miRNA的基因功能主要參與分子的連接、催化活性和轉(zhuǎn)運(yùn)活性等功能。

圖3 差異表達(dá)miRNA靶基因功能分析

2.4 兩種細(xì)胞中差異表達(dá)miRNA的篩選

差異表達(dá)miRNA的篩選分析顯示，與MB-231相比，MB-231Brm細(xì)胞中，miR-199a-3p，miR-103a-3p等表達(dá)顯著增加，而miR-1246和miR-4787-3p等表達(dá)顯著下降(圖4)。

圖4 差異表達(dá)miRNA熱圖

2.5 qPCR驗(yàn)證結(jié)果

qPCR結(jié)果顯示(圖5)，與MB-231相比，miRNA-1246在MB-231Brm細(xì)胞中表達(dá)水平顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＜0.05)。

圖5 qPCR檢測(cè)差異表達(dá)miRNA的相對(duì)表達(dá)

3 討論

據(jù)報(bào)道，基于微陣列的基因表達(dá)譜特別有助于了解乳腺癌的分子事件，如分類、發(fā)展、預(yù)后和預(yù)測(cè)。既往研究表明，可以通過(guò)微陣列基因表達(dá)分析來(lái)研究腫瘤轉(zhuǎn)移到腦中的分子變化。近期，Zhou等對(duì)TNBC腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞基因表達(dá)譜的研究發(fā)現(xiàn)了在TNBC腦轉(zhuǎn)移過(guò)程中基因表達(dá)發(fā)生了顯著變化，揭示了TNBC腦轉(zhuǎn)移的基因表達(dá)譜和分子事件。因此，為研究差異表達(dá)miRNA在TNBC腦轉(zhuǎn)移中的作用，本研究提取乳腺癌細(xì)胞系和其腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系中的sRNA，并用PCR構(gòu)建RNA文庫(kù)后經(jīng)數(shù)據(jù)過(guò)濾，與已知的miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，采用miRDeep2對(duì)未知miRNA進(jìn)行新的miRNA預(yù)測(cè)并用TPM標(biāo)準(zhǔn)化的方法檢測(cè)miRNA表達(dá)水平。通過(guò)sRNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)兩株細(xì)胞中已知miRNA、未知miRNA、已知piRNA及未知piRNA的數(shù)量及比例無(wú)明顯差異；但兩株細(xì)胞中miRNA的種類及表達(dá)均具有明顯差異，兩株細(xì)胞共有的miRNA有961種，MB-231細(xì)胞自有的有164種，MB-231Brm細(xì)胞自有的有196種；并且與MB-231相比，MB-231Brm細(xì)胞miRNA中，145個(gè)表達(dá)顯著上調(diào)，54個(gè)表達(dá)顯著下調(diào)，1 122個(gè)表達(dá)未見(jiàn)明顯差異。隨后，我們采用GO分析MB-231Brm細(xì)胞中差異表達(dá)miRNA靶基因的生物學(xué)功能。結(jié)果顯示，差異表達(dá)的miRNA所調(diào)控的基因與細(xì)胞組分、分子功能和生物過(guò)程相關(guān)。在細(xì)胞成分中，miRNA相關(guān)的靶基因主要參與調(diào)控細(xì)胞、細(xì)胞器及細(xì)胞膜的形成；在分子功能中，差異表達(dá)的miRNA的基因功能主要參與分子連接、催化活性和轉(zhuǎn)運(yùn)活性等功能；在生物學(xué)過(guò)程中，差異表達(dá)的miRNA主要參與細(xì)胞形成過(guò)程、代謝過(guò)程、調(diào)節(jié)生物學(xué)過(guò)程及對(duì)外界刺激的反應(yīng)。

為了進(jìn)一步篩選出特異性miRNA，通過(guò)差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)顯著的miRNA也具有差異性，與MB-231相比，MB-231Brm中的miR-199a-3p，miR-103a-3p等表達(dá)顯著增加，而miR-1246，miR-4787-3p等表達(dá)顯著下降。qPCR驗(yàn)證結(jié)果發(fā)現(xiàn)與MB-231相比，MB-231Brm細(xì)胞中miR-1246表達(dá)顯著下降且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＜0.05)。miR-1246位于2號(hào)染色體的2q31.1處，是唐氏綜合征中

p53

基因的轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)；有研究報(bào)道根據(jù)miRNA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的不同作用，將miRNA分為腫瘤促進(jìn)miRNA(oncomiRNA)和腫瘤抑制miRNA(ts-miRNA)，onco-miRNA通常在腫瘤中上調(diào)，主要通過(guò)降解腫瘤抑制基因促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)；ts-miRNA則在腫瘤中下調(diào)，主要以癌基因?yàn)榻到饽繕?biāo)，具有抗腫瘤功能。既往研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)miR-1246在食管癌鱗狀細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌和高度漿液性卵巢癌中表達(dá)上調(diào)，能促進(jìn)這些腫瘤細(xì)胞的遷移，且其與腫瘤細(xì)胞分化和侵襲密切相關(guān)。如：miR-1246在肝細(xì)胞癌的高侵襲能力細(xì)胞系中的表達(dá)明顯高于在低侵襲能力細(xì)胞系中的表達(dá)，其通過(guò)下調(diào)細(xì)胞黏附分子1(cell adhesion molecule 1，CADM1)來(lái)增強(qiáng)肝細(xì)胞癌中腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。miR-1246表達(dá)在乳腺癌患者血漿中顯著升高，且侵襲性乳腺癌細(xì)胞系MB-231較非侵襲性乳腺癌細(xì)胞高表達(dá)miR-1246，其通過(guò)靶向細(xì)胞周期蛋白G2(cyclin-G2，CCNG2)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和耐藥性。既往相關(guān)研究報(bào)道了miRNA-1246所涉及的一些信號(hào)通路及靶基因，其中的一個(gè)靶基因?yàn)殡p特異性酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)激酶1A(recombinant dual specificity tyrosine phosphorylation regulated kinase 1A，DYRK1A)，其可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖和減少細(xì)胞凋亡而發(fā)揮促癌作用，通過(guò)p53-miRNA-1246-DYRK1A-NFAT途徑，抑制

DYRK1A

基因的表達(dá)，激活活化T細(xì)胞核因子(nuclear factor of activating T cell，

NFAT

)基因，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，并提出p53-miRNA-1246-DYRK1A-NFAT途徑是腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的新途徑。有研究報(bào)道

p

53介導(dǎo)miRNA-1246過(guò)表達(dá)后可負(fù)向調(diào)節(jié)核因子I/B(nuclear factor I/B，NFIB)來(lái)抑制人肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。此外，研究證實(shí)大多數(shù)TNBC中存在

p

53突變，且突變體在各種程度上喪失了正常的

p

53抑癌功能，但也可以通過(guò)功能獲得機(jī)制獲得致癌特性，其可通過(guò)雙重機(jī)制促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展：功能缺失型(腫瘤抑制活性)和功能獲得型(致癌活性)。最近研究發(fā)現(xiàn)NFIB在TNBC中的DNA拷貝數(shù)和表達(dá)水平均顯著增加，并證實(shí)NFIB可直接抑制p53突變的TNBC中的

CDKN1A

基因轉(zhuǎn)錄以促進(jìn)細(xì)胞存活，該基因編碼p21(p53途徑的下游效應(yīng)分子)，從而導(dǎo)致腫瘤侵襲性生長(zhǎng)和腫瘤進(jìn)展。與既往研究結(jié)果不同，本研究發(fā)現(xiàn)miR-1246在侵襲性較強(qiáng)TNBC腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系中表達(dá)較非腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系顯著下降，結(jié)合以上研究結(jié)果，推測(cè)在TNBC腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系中p53突變可能引起了miR-1246表達(dá)下降，通過(guò)負(fù)向調(diào)節(jié)NFIB使其表達(dá)升高后抑制P21轉(zhuǎn)錄促進(jìn)細(xì)胞存活，促進(jìn)腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞在腦內(nèi)的生長(zhǎng)，尚需進(jìn)一步的研究來(lái)證實(shí)。

腦轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟、多階段的過(guò)程，腦轉(zhuǎn)移的過(guò)程涉及EMT、ECM降解、新生血管形成和血腦屏障的破壞等。miRNA在腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生、發(fā)展中可分為腫瘤促進(jìn)miRNA和腫瘤抑制miRNA，具有促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和抗腫瘤等不同的作用。本研究結(jié)果提示，TNBC細(xì)胞系及其腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系中差異表達(dá)顯著的miRNA在乳腺癌腦轉(zhuǎn)移中通過(guò)調(diào)控生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能等發(fā)揮作用；且miRNA-1246在腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系中較非腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系的表達(dá)顯著下降。結(jié)合既往研究結(jié)果，我們推測(cè)在TNBC腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系中可能存在p53-miRNA-1246-NFIB-p21途徑來(lái)促進(jìn)細(xì)胞存活，從而促進(jìn)腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞在腦內(nèi)的生長(zhǎng)，這仍需進(jìn)行更深入的探討來(lái)驗(yàn)證。