張玉鈴，吳俊東，潘東岳，陳春發(fā)，

(1．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院信息科，廣東汕頭 515041；2．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院乳腺中心，廣東 汕頭 515041；3．廣東省乳腺癌診治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 汕頭 515041)

新輔助化療(neoadjuvant chemotherapy，NACT)是局部晚期乳腺癌的標(biāo)準(zhǔn)治療模式，它可以降低原發(fā)腫瘤大小提高可手術(shù)率及保乳率，也可以降低腋窩淋巴結(jié)分期采取前哨淋巴結(jié)活檢從而避免腋窩淋巴結(jié)清掃。NACT還可以提供理想的體內(nèi)藥敏試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，在治療中越?lái)越被臨床醫(yī)師所接受。目前無(wú)論何種化療方案，臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)10%～35%的乳腺癌病人對(duì)NACT不敏感，這就意味著這部分病人不僅未能從化療中獲益，而且還獲得了化療藥物的毒副作用。因此，盡早發(fā)現(xiàn)有效的療效預(yù)測(cè)因子一直是臨床工作者關(guān)注的熱點(diǎn)。

Ki67是增殖細(xì)胞中表達(dá)的一種核抗原，表達(dá)于細(xì)胞周期除G0期以外的其他各期，是目前檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖活性最可靠的指標(biāo)之一。高表達(dá)Ki67的腫瘤細(xì)胞增殖活躍，而化療藥物對(duì)增殖活躍的細(xì)胞殺傷力更強(qiáng)。Vincent等認(rèn)為Ki67可作為乳腺癌NACT的敏感性指標(biāo)，腫瘤細(xì)胞增殖率的降低比腫瘤的縮小更能反映腫瘤對(duì)化療的敏感程度。而Von Minckwitz等則認(rèn)為在NACT期間Ki67水平下降的患者具有更好的結(jié)果，甚至比化療前Ki67基線水平較低的患者的預(yù)后更好。因此，本研究探討NACT前后Ki67的變化能否作為NACT療效和預(yù)后預(yù)測(cè)因子，為臨床乳腺癌NACT尋找早期預(yù)測(cè)因子提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

回顧性分析汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院2009年12月—2013年9月收治的乳腺癌患者。所有患者化療前原發(fā)灶均經(jīng)空芯針穿刺病理診斷為浸潤(rùn)性乳腺癌，有可評(píng)價(jià)病灶，無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，有配對(duì)的NACT前穿刺標(biāo)本和NACT后手術(shù)切除標(biāo)本。符合條件的患者共有104例，其中女性103例，男性1例。年齡28～80歲，中位年齡51歲。TNM分期參照第7版國(guó)際抗癌聯(lián)盟(International Union Against Cancer，UICC)和美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)(American Joint Committee on Cancer，AJCC)標(biāo)準(zhǔn)。所有患者血常規(guī)、心臟、肝臟和腎臟功能均正常，就診前未接受過(guò)化療、內(nèi)分泌治療或放射治療。

1.2 治療和臨床療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

NACT方案主要為TEC、CEF-T及FEC等方案，其中HER2陽(yáng)性患者接受新輔助靶向治療有2例。TEC方案：多西他賽75 mg/m，靜脈滴入，第1天(d1)；表柔比星80 mg/m，靜脈滴入，d1；環(huán)磷酰胺500 mg/m，靜脈滴入，d1；21 d為1個(gè)周期。CEF-T方案：環(huán)磷酰胺500 mg/m，靜脈滴入，d1；表柔比星100 mg/m，靜脈滴入，d1；氟尿嘧啶500 mg/m，靜脈滴入，d1；21 d為1個(gè)周期；3個(gè)周期后序貫給予單藥多西他賽100 mg/m，靜脈滴入，d1，21 d為1個(gè)周期。FEC方案：氟尿嘧啶500 mg/m，靜脈滴入，d1；表柔比星100 mg/m，靜脈滴入，d1；環(huán)磷酰胺500 mg/m，靜脈滴入，d1；21 d為1個(gè)周期。完成4～6個(gè)周期后根據(jù)具體情況(患者意愿及化療后腫瘤大小、腫瘤與乳腺體積比)行改良根治術(shù)或保留乳房手術(shù)?；颊咝g(shù)后繼續(xù)完成化療療程、放射治療及內(nèi)分泌治療，HER2陽(yáng)性的患者根據(jù)患者意愿和經(jīng)濟(jì)狀況使用曲妥珠單抗治療。

在治療前及術(shù)前進(jìn)行乳腺超聲或者核磁共振檢查，同一患者在化療前后用同一方法測(cè)量比較，以乳腺原發(fā)腫瘤為可測(cè)量靶病灶，記錄其最大徑線，采用實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(response evaluation criteria in solid tumors，RECIST)2009年1.1版標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估療效。臨床完全緩解(clinical complete response，cCR)：所有目標(biāo)病灶消失；臨床部分緩解(clinical partial response，cPR)：治療后目標(biāo)病灶長(zhǎng)徑之和縮小≥30%；臨床疾病進(jìn)展(clinical progression disease，cPD)：病灶長(zhǎng)徑之和增加≥20%或出現(xiàn)新病灶；臨床疾病穩(wěn)定(clinical stable disease，cSD)：病灶長(zhǎng)徑之和縮小但未達(dá)cPR或增加但未達(dá)cPD。cCR+cPR評(píng)價(jià)為治療有效，cPD+cSD為治療無(wú)效。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

采用免疫組化EnVision方法檢測(cè)乳腺癌組織中雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progestrogen receptor，PR)、人表皮生長(zhǎng)因子受體-2(human epidermal growth factor receptor-2，HER2)和Ki67的表達(dá)。ER、PR和HER2的具體檢查方法和判定標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[9]。Ki67染色評(píng)分根據(jù)乳腺癌國(guó)際Ki67工作組指南。Ki67指數(shù)的比例取決于1 000個(gè)腫瘤細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)的百分比(至少500個(gè)腫瘤細(xì)胞)，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜14%為低表達(dá)，≥14%為高表達(dá)，此數(shù)值是基于乳腺癌分子分型的界限標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)文獻(xiàn)。患者的手術(shù)標(biāo)本中Ki67表達(dá)數(shù)值比活檢標(biāo)本中的數(shù)值降低定義為下降組，數(shù)值一樣或升高定義為未下降組。根據(jù)ER、PR、HER2和Ki67不同的表達(dá)狀態(tài)，將乳腺癌分為5種不同的分子亞型，即Luminal A型[ER和(或)PR陽(yáng)性，HER2陰性且Ki67＜14%]、Luminal B1型[ER和(或)PR陽(yáng)性，HER2陰性而Ki67≥14%]、Luminal B2型[ER和(或)PR陽(yáng)性，HER2陽(yáng)性]、三陰型(ER、PR和HER2均為陰性)和HER2過(guò)表達(dá)型(ER和PR陰性而HER2陽(yáng)性)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料采用Wilcoxon檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料組間比較采用

χ

檢驗(yàn)或Fisher"s精確概率檢驗(yàn)；用Kaplan-Meier方法進(jìn)行生存分析；Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行生存率比較。

P

＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NACT前后乳腺癌組織Ki67的表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示乳腺癌組織中的Ki67主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞核(圖1)。NACT前后Ki67的表達(dá)情況見(jiàn)圖2，化療前Ki67低表達(dá)有13例(13/104，12.5%)，高表達(dá)有91例(91/104，87.5%)；化療后Ki67低表達(dá)有39例(39/104，37.5%)，高表達(dá)有65例(65/104，62.5%)?；熀驥i67出現(xiàn)降低65例(65/104，62.5%)，不變20例(20/104，19.2%)，升高19例(19/104，18.3%)，經(jīng)過(guò)NACT后Ki67表達(dá)顯著下降(

P

＜0.001)。

圖1 新輔助化療前后乳腺癌組織HE染色和免疫組化Ki67表達(dá)(×400)

圖2 新輔助化療前后Ki67表達(dá)變化

2.2 NACT前后Ki67表達(dá)變化與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

如表1所示，NACT前后Ki67下降和未下降兩組在年齡、月經(jīng)狀態(tài)、腫瘤T分期、臨床分期、ER、PR、HER2和化療方案等差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

＞0.05)。腋窩淋巴分期越高的患者化療后Ki67越容易出現(xiàn)下降，N0～1、N2和N3組分別占46.2%(12/26)、79.5%(31/39)和56.4%(22/39)(

P

=0.015)?；熐癒i67高表達(dá)的患者經(jīng)NACT后Ki67更容易出現(xiàn)下降，為69.2%(63/91)(

P

＜0.01)。NACT后Luminal B1、Luminal B2、三陰性和HER2過(guò)表達(dá)型比Luminal A型的Ki67表達(dá)更容易出現(xiàn)下降，分別占73.9%(34/46)、64.3%(9/14)、69.2%(9/13)、47.8%(11/23)和25.0%(2/8)(

P

=0.045)。亞組分析結(jié)果顯示，Luminal B1和三陰性亞型的乳腺癌患者NCAT后Ki67表達(dá)顯著下降(

P

＜0.001和

P

＜0.019)，而Luminal A、Luminal B2和HER2過(guò)表達(dá)亞型的患者Ki67下降不顯著(圖3B)。這可能與Luminal A型患者對(duì)化療不敏感，而Luminal B2和HER2過(guò)表達(dá)亞型的患者在本研究中行新輔助靶向治療甚少有關(guān)。本研究的結(jié)果顯示(圖3A)，聯(lián)合蒽環(huán)和紫杉醇的化療方案與單用蒽環(huán)相比，Ki67表達(dá)下降更明顯(

P

＜0.01)。臨床療效判定cCR+cPR組Ki67下降占68.6%(59/86)(

P

=0.005)，NACT前后Ki67下降值與臨床療效相關(guān)系數(shù)為0.302(

P

=0.002)，見(jiàn)圖4，說(shuō)明NACT后Ki67下降與臨床療效相關(guān)。

表1 乳腺癌患者臨床病理特征與NACT前后Ki67變化的關(guān)系

圖3 新輔助化療前后Ki67表達(dá)情況

圖4 新輔助化療前后Ki67表達(dá)變化與臨床療效的相關(guān)性

2.3 隨訪結(jié)果

采用電話及門診進(jìn)行隨訪，從明確診斷第1天開(kāi)始，局部復(fù)發(fā)指同側(cè)乳腺或區(qū)域淋巴結(jié)復(fù)發(fā)，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移指臨床或影像學(xué)結(jié)果出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶。無(wú)病生存期(disease-free survival，DFS)指從明確診斷的第1天起至第1次復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的間隔，總生存期(overall survival，OS)指從明確診斷的第1天起至死亡或末次隨訪的間隔。隨訪截止時(shí)間為2019年12月31日，以最后一次隨訪仍存活的時(shí)間按截尾數(shù)據(jù)處理。隨訪中位時(shí)間為70.5個(gè)月(5至128個(gè)月)。全組復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移46例(46/104，44.2%)，其中腦轉(zhuǎn)移3例，肺轉(zhuǎn)移18例，肝臟轉(zhuǎn)移9例，骨轉(zhuǎn)移4例，胸壁復(fù)發(fā)5例，患側(cè)鎖骨上或腋窩復(fù)發(fā)7例，54例患者死亡(51.9%)。

2.4 生存情況

NACT后Ki67下降組和未下降組的平均DFS分別為(90.69±5.89)和(63.86±7.88)個(gè)月，Ki67下降組的中位DFS率明顯高于Ki67未下降組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

=0.027)。其中Ki67下降組和Ki67未下降組的5年DFS率分別為68.1%和44.5%(圖5A)。NACT后Ki67下降組和Ki67未下降組的中位OS分別為(93.00±11.37)和(69.00±15.71)個(gè)月。盡管Ki67下降組的中位OS率高于Ki67未下降組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

=0.171，圖5B)。

3 討論

圖5 新輔助化療前后Ki67下降組和Ki67未下降組的生存分析

探索化療療效和預(yù)后生物標(biāo)志物一直是臨床的研究熱點(diǎn)，而NACT的應(yīng)用給乳腺癌患者提供了機(jī)會(huì)。尋找有效的生物標(biāo)志不僅可以縮短療效評(píng)估時(shí)間，而且可以減輕化療帶來(lái)的毒副作用。Ki67作為在乳腺癌中被廣泛應(yīng)用的指標(biāo)，特別適用于NACT治療前、治療中及治療后療效的動(dòng)態(tài)評(píng)價(jià)。高表達(dá)Ki67的乳腺癌患者常顯示更好的化療反應(yīng)，但目前尚沒(méi)有一個(gè)明確的Ki67界限值評(píng)估NACT療效和預(yù)后。有學(xué)者通過(guò)對(duì)比新輔助內(nèi)分泌治療和NACT前后Ki67表達(dá)水平的變化，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)Ki67的患者經(jīng)過(guò)化療后Ki67下降更明顯。因此，本回顧性研究通過(guò)對(duì)比NACT前后Ki67表達(dá)水平的變化了解其是否能作為預(yù)測(cè)乳腺癌NACT療效和預(yù)后的預(yù)測(cè)因子。

本研究結(jié)果顯示Ki67高表達(dá)的患者NACT后Ki67表達(dá)水平明顯減少。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是高表達(dá)Ki67的乳腺癌腫瘤細(xì)胞增殖更加活躍，而化療藥物對(duì)增殖活躍的細(xì)胞的殺傷力更強(qiáng)，這可能也是高表達(dá)Ki67的患者化療后臨床和病理完全緩解率更高的原因。本研究結(jié)果顯示淋巴結(jié)分期越高經(jīng)NACT后Ki67表達(dá)水平越容易出現(xiàn)下降。淋巴分期高的患者往往惡性程度也高，Ki67常處于高表達(dá)狀態(tài)。正是這樣，經(jīng)NACT后Ki67表達(dá)就容易出現(xiàn)下降。報(bào)道稱Ki67表達(dá)水平能夠預(yù)測(cè)乳腺癌各亞型的化療敏感性，本研究結(jié)果也顯示不同乳腺癌分子分型經(jīng)過(guò)NACT后Ki67的下降存在差異。Luminal B1和三陰性與Luminal A、Luminal B2和HER2過(guò)表達(dá)亞型相比，Ki67表達(dá)更容易出現(xiàn)下降。一般認(rèn)為三陰性和HER2陽(yáng)性的患者惡性度高，腫瘤細(xì)胞常常檢測(cè)出高的Ki67數(shù)值，而Luminal B1型Ki67表達(dá)也比Luminal A型高。因此，這些高增殖狀態(tài)的癌細(xì)胞更容易遭受化療藥物的破壞，這可能就是不同的乳腺癌亞型對(duì)化療敏感差異的一個(gè)原因。我們的研究結(jié)果顯示Luminal B2和HER2過(guò)表達(dá)亞型的患者中Ki67下降不顯著，出現(xiàn)這種情況的原因可能與本研究中行新輔助靶向治療的患者較少有關(guān)。基于上面的結(jié)果，我們認(rèn)為乳腺癌分子分型中高表達(dá)Ki67的患者經(jīng)化療后Ki67表達(dá)更容易出現(xiàn)下降。

患者對(duì)化療藥物敏感性高，或經(jīng)NACT后出現(xiàn)臨床或病理完全緩解常預(yù)示療效也較好。本研究結(jié)果顯示臨床療效判定cCR和cPR組患者經(jīng)NACT后Ki67下降更明顯，并且與NACT后Ki67表達(dá)的下降相關(guān)。說(shuō)明NCAT后Ki67下降與臨床療效相符合，Ki67表達(dá)下降組的療效優(yōu)于Ki67表達(dá)未下降組，此結(jié)果與國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者結(jié)果一致。鑒于本研究中入組的患者大多數(shù)為局部晚期的患者，在這類患者中，Ki67下降組與療效具有相關(guān)性。但經(jīng)過(guò)NCAT后Ki67表達(dá)具體下降多少才有療效，尚需進(jìn)一步研究。本研究的結(jié)果也顯示，聯(lián)合蒽環(huán)和紫杉醇的化療方案與單用蒽環(huán)相比，Ki67表達(dá)下降更明顯。說(shuō)明聯(lián)合蒽環(huán)和紫杉醇方案化療的療效比單用蒽環(huán)的好，這也符合目前乳腺癌指南的推薦方案。因此，對(duì)于局部晚期乳腺癌的新輔助化療，聯(lián)合蒽環(huán)和紫杉醇化療應(yīng)是首先推薦方案。

多基因檢測(cè)顯示Ki67是乳腺癌復(fù)發(fā)的主要危險(xiǎn)因子，高表達(dá)Ki67的患者容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示NACT前后Ki67未下降的患者更容易出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，而Ki67下降組的患者的無(wú)病生存率優(yōu)于Ki67未下降組。出現(xiàn)這種結(jié)果可能是由于高表達(dá)Ki67的乳腺癌細(xì)胞對(duì)化療更敏感，經(jīng)過(guò)化療后更容易出現(xiàn)Ki67表達(dá)下調(diào)，出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的幾率減少。最近的研究顯示經(jīng)過(guò)NACT后，殘留腫瘤組織中Ki67表達(dá)水平與預(yù)后相關(guān)，而Ki67表達(dá)減少的預(yù)后更好。雖然本研究結(jié)果顯示Ki67下降組和Ki67未下降組的患者的OS差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。出現(xiàn)這種原因主要是OS由全部治療手段、時(shí)間決定的，由于不同的分子分型后續(xù)的治療方法不同，預(yù)后也不同，這可能是導(dǎo)致本研究中OS無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的原因。如果單純?cè)u(píng)估一種分子分型，結(jié)論可能不同。鑒于本研究入組的患者不多，經(jīng)過(guò)分子分型亞組分析后樣本量較小可能會(huì)影響統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)效能，希望以后能獲得更大樣本量的驗(yàn)證。

綜上所述，Ki67作為乳腺癌病理常規(guī)檢查，特別是準(zhǔn)備行NACT的患者，它的變化能提供療效和預(yù)后的預(yù)測(cè)信息。對(duì)于局部晚期的患者，NACT后Ki67下降的患者療效和預(yù)后可能更好。本研究結(jié)果不僅能指導(dǎo)臨床工作中NACT患者療效和預(yù)后的評(píng)價(jià)，而且能為我們下一步研究NACT前后Ki67表達(dá)短期是否會(huì)下降、能否早期預(yù)測(cè)療效和預(yù)后提供理論基礎(chǔ)。