鄭珺文，常 晨，郝佳潔，蔡 巖，王明榮，張 鈺

(國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院，分子腫瘤學(xué)國家重點實驗室，北京 100021)

食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是我國高發(fā)的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率分別位居我國惡性腫瘤的第4和第5位。目前，ESCC發(fā)病的分子機制尚未完全闡明，在其發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的分子及其作用機制仍有待深入研究。

神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)發(fā)育下調(diào)蛋白4(neural precursor cell expressed developmentally down-regulated protein 4，NEDD4)為含HECT結(jié)構(gòu)域的E3連接酶家族中的NEDD4亞家族成員。NEDD4在哺乳類動物的組織中廣泛表達(dá)，可介導(dǎo)底物蛋白泛素化和蛋白酶體降解過程，受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，以及蛋白的運輸[3-4]。

NEDD4是一個在進(jìn)化中高度保守的蛋白。人NEDD4位于15q21.3，含30個外顯子，編碼約120 kD的蛋白。有研究顯示NEDD4在胃癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、子宮內(nèi)膜癌和乳腺癌等多種人類惡性腫瘤中過表達(dá)，與腫瘤的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，并與胃癌、肝癌及乳腺癌患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)。同時，有研究顯示NEDD4參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲運動、上皮-間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)化和藥物抗性等過程，從而在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

既往文獻(xiàn)報道NEDD4過表達(dá)與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但其在ESCC中的表達(dá)改變尚無文獻(xiàn)報道。本研究檢測分析了ESCC組織中NEDD4的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)NEDD4的蛋白和mRNA均存在表達(dá)上調(diào)現(xiàn)象，進(jìn)而分析了NEDD4過表達(dá)與ESCC臨床病理指標(biāo)的關(guān)系，并檢測了其過表達(dá)對ESCC細(xì)胞增殖能力的影響。本研究結(jié)果為闡明食管癌變的分子機制提供了實驗依據(jù)，并且為食管鱗癌的靶向治療提供了新的潛在分子靶點。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

RPMI 1640培養(yǎng)基為Cell Technology公司產(chǎn)品。NEDD4抗體購于Millipore，ERK抗體購于Cell Signaling Technology。Lipofectamine 2000購于Invitrogen公司，siRNA序列由上海吉瑪公司合成，qPCR引物序列由北京天一輝遠(yuǎn)公司合成。組織&細(xì)胞RNA純化試劑盒與HiFiScript cDNA合成試劑盒均購于康為世紀(jì)公司。TB GreenPremix Ex Taq試劑盒購于TaKaRa公司。CCK8檢測試劑盒購于Dojindo公司。ABI QuantStudio實時定量PCR儀由ABI公司生產(chǎn)，微版分光光度計ELX808購于美國BioTek Instruments公司。

1.2 組織樣品及組織芯片制備

本研究中使用的131例ESCC組織及同一患者手術(shù)切端形態(tài)正常的組織，均取自2007—2011年中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院臨床診斷后的剩余標(biāo)本。所有組織標(biāo)本均為無壞死的新鮮組織，按照常規(guī)方法使用福爾馬林固定及石蠟包埋，并按文獻(xiàn)方法構(gòu)建包含ESCC和鄰近正常上皮細(xì)胞的組織微陣列。其中，每個病例包含3個代表性的癌組織和2個手術(shù)切緣正常組織點。本研究由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)實施(No.16-084/1163)，所有患者均已簽署知情同意書。

1.3 免疫組織化學(xué)分析及結(jié)果評價

免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)染色按常規(guī)方法進(jìn)行，抗NEDD4抗體購自Millipore公司。根據(jù)染色強度和染色的面積評價NEDD4蛋白的染色結(jié)果，并由兩名研究者分別進(jìn)行評估。其中，染色強度評分為：陰性0分；弱陽性1分；中等陽性2分；強陽性3分。染色面積評分為：≤10%為0分；＞10%～25%為1分；＞25%～50%為2分；＞50%～75%為3分；＞75%為4分。將染色強度與染色面積評分的乘積作為NEDD4蛋白表達(dá)的最終評分，并由此將NEDD4的表達(dá)水平分為弱表達(dá)(≤8分)和強表達(dá)(＞8分)兩類。

1.4 Western blot檢測

6對配對的ESCC和手術(shù)切緣正常食管上皮組織的總蛋白提取及SDS-PAGE按照常規(guī)方法進(jìn)行。蛋白裂解物經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，與抗NEDD4抗體和抗ERK抗體雜交，使用超敏化學(xué)發(fā)光檢測試劑顯示雜交信號。

1.5 ESCC、正常食管上皮組織及ESCC細(xì)胞系mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)獲取

從UCSC-Xena網(wǎng)站(https://xena.ucsc.edu/)下載TCGA數(shù)據(jù)庫中ESCC組織mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)和相關(guān)病例信息，從GTEx網(wǎng)站(https://gtexportal.org/home/datasets)下載正常食管上皮組織的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)(GTEx Analysis-v8)和相關(guān)樣本信息。將mRNA表達(dá)譜與對應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)或樣本信息數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配篩選，得到含有臨床信息的82例ESCC及555例正常食管上皮組織的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)。為比對食管鱗癌組織與正常食管上皮組織中NEDD4表達(dá)水平的差異，將TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫中NEDD4的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換處理，使其單位統(tǒng)一，消除批次效應(yīng)后進(jìn)行mRNA表達(dá)水平的差異分析。從CCLE數(shù)據(jù)庫(https://portals.broadinstitute.org)下載ESCC細(xì)胞系NEDD4 mRNA的表達(dá)數(shù)據(jù)。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)

人ESCC細(xì)胞系KYSE30和KYSE150由日本京都大學(xué)Y.Shimada教授惠贈，均經(jīng)過短串聯(lián)重復(fù)序列基因分型鑒定。細(xì)胞在含有10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100μg/mL)的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在37℃、CO體積分?jǐn)?shù)為5%的孵箱中培養(yǎng)。

1.7 siRNA轉(zhuǎn)染

在KYSE30及KYSE150細(xì)胞中，使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染NEDD4特異性siRNA或陰性對照siRNA，按產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作。NEDD4特異siRNA靶 序 列 為：T1：5′-TGGCGATTTGTAAACCGAA-3′，T2：5′-TACGTGAGAGTGACGTTATAT-3′，陰性對照siRNA靶序列為：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。

1.8 RNA分離和實時定量PCR(qPCR)

采用組織&細(xì)胞RNA純化試劑盒提取純化細(xì)胞總RNA。將得到的RNA作為模板，使用HiFiScript cDNA合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用TB GreenPremix Ex Taq試劑盒及ABI QuantStudio實時定量PCR儀進(jìn)行qPCR實驗。以GAPDH的mRNA表達(dá)水平為內(nèi)參照，進(jìn)行歸一化處理，獲得靶基因的相對mRNA表達(dá)水平。相關(guān)引物由天一輝遠(yuǎn)公司合成，序列如下：NEDD4正向引物，5′-CCACCAGGTTGGG AAGAAAAA-3′；NEDD4反向引物，5′-TCCAAGTA GTCGTTCTGGAATTG-3′。GAPDH正 向 引 物，5′-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3；GAPDH反向引物，5′-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3′。

1.9 細(xì)胞增殖活力檢測

實驗分為3組，分別是陰性對照siRNA、NEDD4-siRNA-T1及NEDD4-siRNA-T2轉(zhuǎn)染組。在96孔板中接種1 000個細(xì)胞，每組設(shè)3個復(fù)孔。細(xì)胞貼壁后，每24 h使用CCK8試劑盒檢測細(xì)胞增殖活力，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。使用微板分光光度計ELX808在450 nm處測定吸光度值

D

(450)，并按以下公式計算細(xì)胞的增殖率和增殖抑制率：

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。使用Pearson卡方檢驗及Fisher精確檢驗分析NEDD4蛋白表達(dá)水平與臨床病理指標(biāo)之間的相關(guān)性。使用one-way ANOVA檢驗分析NEDD4敲降細(xì)胞中NEDD4 mRNA水平的變化情況及細(xì)胞增殖活力的變化，組間比較采用LSD檢驗。

P

＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NEDD4在ESCC組織中過表達(dá)

本研究首先使用IHC染色技術(shù)在131例配對的ESCC組織中檢測了NEDD4蛋白的表達(dá)情況。IHC分析結(jié)果顯示，NEDD4在40%(53/131)的ESCC組織中呈高水平表達(dá)，在手術(shù)切緣正常食管上皮組織中不表達(dá)或低水平表達(dá)。同時，IHC染色結(jié)果顯示ESCC組織中NEDD4蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)(圖1A)。進(jìn)而，我們對NEDD4蛋白表達(dá)與ESCC臨床病理指標(biāo)的關(guān)系進(jìn)行了分析，統(tǒng)計分析結(jié)果顯示NEDD4蛋白的表達(dá)與腫瘤浸潤深度和分化程度顯著相關(guān)(均為

P

＜0.05，表1)。

表1 食管鱗癌組織中NEDD4蛋白表達(dá)水平與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

同時，本研究對6對配對的ESCC和手術(shù)切緣正常食管上皮組織中NEDD4蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行了Western blot檢測，結(jié)果顯示NEDD4蛋白在4例ESCC樣本中表達(dá)明顯上調(diào)(圖1B)。繼而，我們使用TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫中的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，對ESCC和正常食管上皮組織中NEDD4的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示ESCC組織中NEDD4的mRNA表達(dá)水平顯著高于正常食管上皮組織(

P

＜0.01，圖1C)。

2.2 NEDD4過表達(dá)促進(jìn)ESCC細(xì)胞的增殖能力

為進(jìn)一步揭示NEDD4高表達(dá)對ESCC細(xì)胞惡性表型的影響，本研究對NEDD4的功能進(jìn)行了初步研究。首先，我們使用CCLE數(shù)據(jù)庫中的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，對10株ESCC細(xì)胞系中NEDD4 mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行了對比。分析結(jié)果顯示，ESCC細(xì)胞系KYSE520、KYSE70、KYSE30和KYSE150中NEDD4 mRNA的表達(dá)水平相對較高(圖2A)。

圖1 NEDD4蛋白在ESCC組織中過表達(dá)

在此基礎(chǔ)上，我們在NEDD4高表達(dá)的ESCC細(xì)胞系KYSE30和KYSE150中瞬時轉(zhuǎn)染2個靶向NEDD4的siRNA。qPCR檢測結(jié)果顯示，靶點1和靶點2可分別使KYSE30細(xì)胞中NEDD4 mRNA的表達(dá)水平下調(diào)84.2%和87.8%，使KYSE150細(xì)胞中NEDD4 mRNA的表達(dá)水平下調(diào)78.7%和84.7%(

P

＜0.01，圖2B)，表明這2個獨立的siRNA靶點均可有效抑制KYSE30和KYSE150細(xì)胞中NEDD4 mRNA的表達(dá)。繼而，CCK8細(xì)胞增殖活力分析結(jié)果顯示，細(xì)胞接種后第6天，兩個轉(zhuǎn)染NEDD4 siRNA的實驗組細(xì)胞增殖活力顯著低于轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA的對照組細(xì)胞(均為

P

＜0.01，圖2C)。靶點1和靶點2對KYSE30細(xì)胞增殖的抑制率分別為93.5%和93.8%，對KYSE150細(xì)胞增殖的抑制率分別為77.4%和99.7%(圖2D)，表明敲降NEDD4的表達(dá)可以顯著抑制KYSE30和KYSE150細(xì)胞在體外的增殖活力。

圖2 敲降NEDD4表達(dá)抑制ESCC細(xì)胞的增殖活力

3 討論

E3連接酶NEDD4在多種惡性腫瘤中存在異常表達(dá)并可發(fā)揮促癌作用，但其在ESCC中的表達(dá)狀態(tài)和功能作用尚無文獻(xiàn)報道。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)ESCC組織中存在NEDD4 mRNA和蛋白水平的表達(dá)上調(diào)。同時，本研究結(jié)果提示NEDD4過表達(dá)可促進(jìn)ESCC細(xì)胞的增殖。

首先，本研究通過IHC染色分析發(fā)現(xiàn)，NEDD4蛋白在ESCC組織中表達(dá)上調(diào)，而且其表達(dá)水平與腫瘤分化程度和浸潤深度顯著正相關(guān)。Western blot檢測結(jié)果也證實ESCC組織中存在NEDD4蛋白的過表達(dá)。同時，對TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫中相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析的結(jié)果表明，NEDD4 mRNA的表達(dá)水平在ESCC組織樣品中也存在顯著上調(diào)。以往文獻(xiàn)報道NEDD4表達(dá)或活性可受多種上游因子或信號通路的調(diào)控，例如PTENPI3K/Akt、RAS、c-Src、Numb、FoxM1B、PKCδ、p34SEI-1、YOD1、miR-30、miR-1和Hsa-miR-199a-3p等。目前，NEDD4在ESCC中表達(dá)上調(diào)的分子機制還有待闡明。

同時，既往研究顯示，NEDD4過表達(dá)可促進(jìn)胃癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、運動和侵襲能力，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，并且被認(rèn)為是一個很有希望的腫瘤治療靶點。本研究結(jié)果顯示，NEDD4過表達(dá)可顯著增強ESCC細(xì)胞的增殖活力，但其作用的詳細(xì)分子機制目前尚不清楚。一些報道顯示，NEDD4通過對各種底物蛋白進(jìn)行泛素化修飾調(diào)控它們在細(xì)胞中的豐度，從而在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。目前已知的NEDD4底物蛋白包括PETN、RAS、LATS1、EGFR和Notch等，但ESCC細(xì)胞中受NEDD4調(diào)控的關(guān)鍵底物還有待于深入研究。

綜上所述，本研究結(jié)果初步提示NEDD4異常過表達(dá)在ESCC的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮促癌作用。目前，NEDD4過表達(dá)對ESCC細(xì)胞惡性表型的影響及其作用的分子機制尚不清楚，后續(xù)研究將對此進(jìn)行深入探討，揭示其在ESCC發(fā)生發(fā)展中的作用并探討其作為ESCC治療靶點的潛在應(yīng)用價值。