向嘉琪，孫佳麗，2，王成芳，劉青杰，田 梅，

(1．中國(guó)疾病預(yù)防控制中心輻射防護(hù)與核安全醫(yī)學(xué)所，輻射防護(hù)與核應(yīng)急中國(guó)疾病預(yù)防控制中心重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100088；2．北京市通州區(qū)疾病預(yù)防控制中心，北京 101100)

隨著射線裝置和核技術(shù)的廣泛應(yīng)用，發(fā)生核事故或核災(zāi)難的可能性正在增加。輻射意外事故發(fā)生時(shí)，需要對(duì)人群進(jìn)行是否受照、受照劑量估計(jì)或分類等評(píng)估。傳統(tǒng)的外周血淋巴細(xì)胞染色體畸變分析等生物劑量測(cè)定方法實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)且分析復(fù)雜，難以應(yīng)對(duì)大規(guī)模人群受照的劑量估算，組學(xué)技術(shù)因其快速、高通量的特點(diǎn)受到廣泛關(guān)注。蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)作為系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成之一，旨在大規(guī)模研究蛋白質(zhì)在時(shí)間和空間中的表達(dá)、結(jié)構(gòu)和功能。蛋白質(zhì)組學(xué)提供了對(duì)蛋白質(zhì)整體、動(dòng)態(tài)、網(wǎng)絡(luò)水平的研究方式，為后基因組學(xué)的發(fā)展提供了更廣闊的前景。

蛋白質(zhì)組學(xué)可通過(guò)檢測(cè)不同組織器官、血液或尿液等生物體液來(lái)研究輻射引起機(jī)體內(nèi)不同蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化，進(jìn)而研究輻射對(duì)機(jī)體的影響。尿液樣本有易大量獲得、非侵入性的特點(diǎn)，且在腎臟中主要由血液過(guò)濾形成，不僅能避免血液對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)影響，還能同時(shí)反映血液和泌尿系統(tǒng)的功能狀態(tài)，是臨床診斷和篩選生物標(biāo)志物非常有優(yōu)勢(shì)的研究材料。本研究采用非標(biāo)記(label-free)定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定Coγ射線全身照射后大鼠尿液蛋白，并對(duì)照射組與對(duì)照組相比差異表達(dá)蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，旨在研究輻射對(duì)大鼠蛋白質(zhì)水平的影響，為輻射生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)、輻射影響機(jī)體生理功能的研究以及臨床診斷及治療提供理論基礎(chǔ)和備選分子靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 主要儀器

本研究使用的主要儀器有：毛細(xì)管高效液相色譜儀(Ultimate 3000，美國(guó)Thermo Fisher Scientific)；電噴霧-組合型離子阱Orbitrap質(zhì)譜儀(Orbitrap FusionLumosTribridMass Spectrometer，美國(guó)Thermo Fisher Scientific)；真空離心濃縮儀(Concentrator plus，德 國(guó)Eppendorf)；分析 天 平(Sartorius BP211d，瑞士Sartorius)；低溫高速離心機(jī)(Microfuge 22R Centrifuge，美 國(guó)Beckman Coulter)；掌上離心機(jī)(D1008，美國(guó)Scilogex)；渦旋儀(MX-S，美國(guó)Scilogex)；恒溫培養(yǎng)箱(BPH-9042，上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.1.2 主要試劑

RIPA裂解和提取液，BCA蛋白測(cè)定試劑盒均購(gòu)于Thermo Fisher Scientific公司；乙腈購(gòu)于Fisher Chemical公司；甲酸、碳酸氫銨、碘乙酰胺和二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)均購(gòu)于Sigma-Aldrich公司；胰蛋白酶購(gòu)于Promega公司；十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、四甲基乙二胺(N,N,N′,N′-tetramethylethylenediamine，TEMED)購(gòu)于Amresco公司；考馬斯亮藍(lán)購(gòu)于北京索萊寶公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠30只，雄性，體質(zhì)量(200±10)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SYXK(京)2016-0006，在北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部飼養(yǎng)，屏障環(huán)境使用許可證SYXK(京)2016-0041。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，30只大鼠隨機(jī)分為3組，分別為陰性對(duì)照組(0 Gy)和1、5 Gy照射組，每組10只，每只大鼠分別置于單獨(dú)的代謝籠飼養(yǎng)。本研究已通過(guò)中國(guó)疾病預(yù)防控制中心輻射防護(hù)與核安全醫(yī)學(xué)所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理福利委員會(huì)審查。

1.3 照射方法

大鼠用運(yùn)輸盒固定后運(yùn)送至北京輻射中心，采用Coγ射線進(jìn)行單次全身照射，源強(qiáng)130 TBq，源靶距84 cm，照射視野面積30 cm×30 cm，劑量率1.0 Gy/min，3組劑量分別為0、1、5 Gy。

1.4 樣品采集及處理

照射后第1和第3天，使用代謝籠分別收集每只大鼠尿液，按照射劑量和取樣時(shí)間分別記為

X

Gy_

X

d組樣品，樣品置于離心管中，分裝后于-80°C冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?h3>1.5 質(zhì)譜上樣前樣品處理

1.5.1 蛋白提取

在0 Gy_1 d、1 G_1 d、5 G_1 d、0 Gy_3 d、1 Gy_3 d、5 Gy_3 d共6組尿液樣品中各加入1 mL預(yù)冷的RIPA裂解和提取液，在4℃下10 000 g離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的1.5 mL EP管中備用。

1.5.2 SDS-PAGE凝膠電泳

將10μL上述蛋白樣品與2.5μL加載緩沖液(5×)混合，沸水中加熱5 min，變性后和marker加入8%分離凝膠孔中電泳1 h 15 min，然后將膠放入考馬斯亮藍(lán)染色液中室溫染色1 h，后脫色備用。

1.5.3 BCA蛋白濃度檢測(cè)

參照試劑盒操作步驟建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，各組蛋白樣品稀釋10倍后檢測(cè)562 nm處的吸光度值并計(jì)算樣品濃度。

1.5.4 蛋白酶解

將100μg蛋白樣品轉(zhuǎn)移到新的EP管中，并用50 mmol/L的NHHCO調(diào)整至最終體積為100μL；然后加入200 mmol/L的DTT 5μL在55℃下孵育1 h；再加入375 mmol/L的碘乙酰胺5μL，并在室溫下避光孵育30 min；隨后加入6倍體積(約600 μL)預(yù)冷的(-20℃)丙酮并在-20℃下冷凍過(guò)夜；4℃下以8 000 g離心樣品10 min，倒出丙酮，保留白色沉淀并干燥2～3 min，用100μL 50 mmol/L NHHCO重溶蛋白質(zhì)沉淀，加入2.5μg胰蛋白酶，在37℃下酶切樣品過(guò)夜；酶切后肽段使用自填脫鹽柱脫鹽，于45℃真空離心濃縮儀中揮干溶劑；肽段用樣品溶解液(0.1%甲酸、2%乙腈)溶解，充分振蕩渦旋，13 200 r/min，4℃離心10 min，上清轉(zhuǎn)移到上樣管中，等待質(zhì)譜分析。

1.6 LC-MS/MS檢測(cè)

使用毛細(xì)管高效液相色譜分離經(jīng)過(guò)前處理的尿液樣品，并通過(guò)MS/MS的峰面積相對(duì)定量，得到原始肽段序列后通過(guò)肽段指紋圖譜鑒定出相應(yīng)蛋白質(zhì)。質(zhì)譜原始文件使用MaxQuant(1.6.2.10)檢索UniProt-Rattus norvegicus數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)和生物信息學(xué)分析

對(duì)搜索數(shù)據(jù)庫(kù)得到的所有蛋白進(jìn)行分析，篩選差異表達(dá)蛋白，將表達(dá)變化(fold change，F(xiàn)C)在1.2倍以上或者80%以下(

P

＜0.05)的蛋白歸納為候選差異表達(dá)蛋白。使用DAVID Bioinformatics Resources 6.8對(duì)上調(diào)和下調(diào)的蛋白進(jìn)行GO富集分析，包括生物學(xué)過(guò)程(biological process，BP)、細(xì)胞定位(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)3大類。對(duì)候選差異表達(dá)蛋白作KEGG功能富集分析并使用STRING在線軟件建立蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了0 Gy_1 d、1 G_1 d、5 G_1 d、0 Gy_3 d、1 Gy_3 d、5 Gy_3 d共6組大鼠尿液樣品。6組樣品質(zhì)譜法共鑒定出1 069個(gè)蛋白。

在兩個(gè)不同劑量的γ射線照射后第1和3天，各尿液樣品鑒定出的共同表達(dá)蛋白和獨(dú)有蛋白如圖1所示。分析不同劑量照射組在照后不同時(shí)間的鑒定蛋白質(zhì)結(jié)果如圖1A和圖1B所示，發(fā)現(xiàn)照射后質(zhì)譜法所鑒定蛋白數(shù)量隨著劑量增加而增多，5 Gy組照射后第1和3天共同鑒定蛋白數(shù)目(388個(gè))多于1 Gy照射組(230個(gè))，此結(jié)果表示在本實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，輻射劑量越高，輻射暴露損傷越大，蛋白質(zhì)從血液過(guò)濾進(jìn)腎臟的種類越多。分析照射后不同時(shí)間各劑量組的鑒定蛋白如圖1C和圖1D所示，照射后第1天不同劑量組共同表達(dá)蛋白數(shù)目(273個(gè))高于照射后第3天(223個(gè))，提示照射引起大鼠尿液蛋白表達(dá)水平的變化主要發(fā)生在照射后早期。對(duì)比圖1C和圖1D，僅在1 Gy照射組檢測(cè)到的獨(dú)有蛋白數(shù)量在照射后第1天(59個(gè))多于照射后第3天(37個(gè))，僅在5 Gy照射組檢測(cè)到的獨(dú)有蛋白數(shù)量在照射后第3天(309個(gè))多于照射后第1天(268個(gè))。

圖1 不同劑量γ射線照射后不同時(shí)間大鼠尿液鑒定蛋白韋恩圖

與對(duì)照組比較，照射后第1天1和5 Gy照射組差異表達(dá)蛋白共742個(gè)，其中480個(gè)表達(dá)上調(diào)，262個(gè)表達(dá)下調(diào)；照射后第3天1和5 Gy照射組差異表達(dá)蛋白共793個(gè)，其中559個(gè)表達(dá)上調(diào)，234個(gè)表達(dá)下調(diào)。照射后的第1和3天，1和5 Gy照射組分別與對(duì)照組相比均出現(xiàn)差異表達(dá)的蛋白279個(gè)(742與793交集數(shù)目)，其中190個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，97個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)。此外，照射后第1和第3天，與對(duì)照組相比，1和5 Gy組大鼠尿液中表達(dá)上調(diào)或下調(diào)幅度前10位的蛋白見(jiàn)表1和表2。

2.2 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的GO功能分析

通過(guò)在線GO富集分析工具(DAVID6.8)對(duì)篩選出的279個(gè)差異蛋白進(jìn)行GO富集分析，包括3個(gè)方面：生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞定位、分子功能。分析結(jié)果如圖2所示，顯著富集的差異蛋白主要參與藥物反應(yīng)、氧化還原過(guò)程、老化等生物學(xué)過(guò)程；細(xì)胞主要定位于細(xì)胞外泌體、細(xì)胞外空間和胞質(zhì)溶膠等；并發(fā)揮蛋白質(zhì)同源二聚化活性、蛋白質(zhì)結(jié)合和鈣離子結(jié)合等分子功能。

表1 不同劑量γ射線照射后不同時(shí)間大鼠尿液中表達(dá)上調(diào)幅度前10位的蛋白

表2 不同劑量γ射線照射后不同時(shí)間大鼠尿液中表達(dá)下調(diào)幅度前10位的蛋白

2.3 差異表達(dá)蛋白的KEGG通路分析

將富集的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析，共發(fā)現(xiàn)差異蛋白富集參與了30條生物信號(hào)通路。富集基因數(shù)最多的信號(hào)通路如圖3所示，主要涉及抗生素生物合成、谷胱甘肽代謝、碳代謝、代謝途徑、氨基酸生物合成等。

2.4 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的PPI分析

為研究差異表達(dá)蛋白間的相互作用關(guān)系，使用在線工具STRING使蛋白相互作用關(guān)系可視化，STRING對(duì)蛋白與蛋白之間的相互作用進(jìn)行了嚴(yán)格的評(píng)估和整合，包括直接關(guān)聯(lián)(物理關(guān)聯(lián))或間接關(guān)聯(lián)(功能關(guān)聯(lián))。如圖4所示，照射后顯著上調(diào)蛋白如GCLM、AZGP1和顯著下調(diào)蛋白Ly6d在蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的中心位置，與其他蛋白聯(lián)系緊密，彼此相互作用。

圖2 不同劑量γ射線照射后與對(duì)照組相比尿液中差異蛋白的GO分析(前10位)

圖3 不同劑量γ射線照射后與對(duì)照組相比尿液中差異蛋白的KEGG富集分析(前10位)

圖4 不同劑量γ射線照射后與對(duì)照組相比尿液中差異蛋白的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

3 討論

輻射可直接或間接作用于機(jī)體組織和細(xì)胞引起輻射損傷，導(dǎo)致基因突變，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)和蛋白表達(dá)水平的變化。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)具有快速、高通量的特點(diǎn)，本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法篩選輻射敏感生物標(biāo)志物，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。

本研究所使用的Label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)無(wú)需標(biāo)記蛋白，具有快速、較高通量、性價(jià)比高等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)Label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測(cè)0、1、5 Gy照射組SD大鼠γ射線全身照射后第1和第3天尿液樣本，利用UniProt搜庫(kù)軟件共鑒定出1 069種蛋白，比較1和5 Gy照射組相較于對(duì)照組的差異表達(dá)蛋白，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)蛋白279種(上調(diào)190種，下調(diào)97種)。MS/MS質(zhì)譜峰面積比值結(jié)果顯示照射后1天，照射組與對(duì)照組相比上調(diào)幅度前10種蛋白包括Gusb、Andpro、Lgals3bp、Apbh、Umod、Reg3g、Azgp1、Ctsc、Igg-2a、C9；照射后第3天，上調(diào)幅度前10種蛋 白 包 括Mb、Fgb、C3、Cp、Serpina3n、Gsta1、Serpina3n、Alb、Gclm、Hrsp12。此外，照射后第1天，照射組與對(duì)照組相比下調(diào)幅度前10位的蛋白包括Lgals5、Tmem132a、Manba、Ceacam10、Ly6d、Mb、Hba1、Hbb、Cp、Fcgbpl1；照射后第3天，下調(diào)幅度前10位的蛋白包括Egf、Cd59、Ig lambda-2 chain C region、Ggh、LOC100360095、LOC688457、Prss1、Pvalb、Gusb、Ly6d。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期在全身照射大鼠血漿中的研究結(jié)果以及蛋白質(zhì)組學(xué)在輻射領(lǐng)域的文獻(xiàn)調(diào)研，在本實(shí)驗(yàn)中篩選發(fā)現(xiàn)的Gusb、Reg3g、AZGP1、Gclm、Ly6d等蛋白可作為候選輻射敏感蛋白進(jìn)行進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證。Gusb是一種溶酶體水解酶，廣泛存在于哺乳動(dòng)物組織和體液中，在不同形式的癌癥壞死部位表達(dá)增加，被認(rèn)為是用于腫瘤診斷和臨床治療評(píng)估的可靠生物標(biāo)志物。Sharma等使用10 Gy的X射線全身照射大鼠，發(fā)現(xiàn)尿液中Gusb表達(dá)增加。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)Gusb照射后第1天，1和5 Gy照射組的表達(dá)分別增加27.220和13.726倍，可作為照射后早期候選生物標(biāo)志物做進(jìn)一步研究。本研究還發(fā)現(xiàn)，Reg3g蛋白在照射后1天照射組表達(dá)增加，5 Gy照射組上升3.040倍，1 Gy照射組上升2.202倍，其表達(dá)水平有隨劑量增加而上升的趨勢(shì)。

Reg3g

基因是輻射敏感性基因，屬于REG家族。Reg3g蛋白在急/慢性胰腺炎、炎性腸病和肝損傷中會(huì)表達(dá)增高，還有研究發(fā)現(xiàn)Reg3g蛋白表達(dá)升高會(huì)增加胰腺導(dǎo)管腺癌的潛在風(fēng)險(xiǎn)。AZGP1作為脂肪動(dòng)員因子廣泛存在于體內(nèi)，參與核糖核酸酶活性調(diào)節(jié)、受精、黑色素生成調(diào)節(jié)、抑制腫瘤生成和促進(jìn)脂解作用，也被視為前列腺癌的潛在生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，照射后1天，1和5 Gy照射組的AZGP1表達(dá)分別升高2.096和1.733倍。此外，Gclm是谷胱甘肽合成的第一個(gè)限速酶，參與了從L-半胱氨酸和L-谷氨酸合成谷胱甘肽途徑的第一步。本研究中，照射后第3天，1和5 Gy照射組的Gclm表達(dá)分別升高1.734和5.034倍，其表達(dá)水平有隨劑量增加而上升的趨勢(shì)。Ly6d是糖基磷脂酰肌醇錨定的細(xì)胞表面蛋白，其功能尚不清楚。Nagano等最近發(fā)現(xiàn)，Ly6d在衰老細(xì)胞中特異性上調(diào)；Kurosawa等發(fā)現(xiàn)X射線照射會(huì)誘導(dǎo)MCF10A細(xì)胞表面Ly6d的表達(dá)。本研究中，Ly6d在照后第1天，1和5 Gy照射組與對(duì)照組相比分別下降21.1%和31.3%，照射后第3天，1和5 Gy照射組與對(duì)照組相比分別下降5.2%和34.9%。上述這些篩選得到的輻射敏感的差異蛋白還需后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)蛋白參與的生物學(xué)過(guò)程主要涉及谷胱甘肽代謝過(guò)程、對(duì)藥物反應(yīng)、氧化還原過(guò)程、老化、氧化應(yīng)激反應(yīng)等；差異蛋白主要分布在細(xì)胞外泌體、細(xì)胞外空間、胞質(zhì)溶膠、頂質(zhì)膜、黏著斑等區(qū)域，發(fā)揮鈣黏蛋白結(jié)合參與細(xì)胞間黏附、蛋白質(zhì)同源二聚化活性、受體結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合以及鈣離子結(jié)合等分子功能。KEGG富集分析顯示差異蛋白主要富集在抗生素生物合成、谷胱甘肽代謝、碳代謝、代謝途徑、氨基酸生物合成、糖酵解/糖異生、2-氧代羧酸代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、蛋白質(zhì)消化吸收、乙醛酸和二羧酸信號(hào)通路上。使用Saito等構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)候選生物標(biāo)志物如顯著上調(diào)蛋白GCLM、AZGP1和顯著下調(diào)蛋白Ly6d在蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的中心位置。

綜上所述，本研究采用Label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)Coγ射線全身照射大鼠尿液蛋白進(jìn)行鑒定和差異表達(dá)蛋白的生物信息學(xué)分析，為全面了解和研究電離輻射對(duì)大鼠尿液蛋白表達(dá)水平的影響及其損傷機(jī)制、發(fā)現(xiàn)輻射敏感生物標(biāo)志物、篩選腫瘤放射治療敏感生物標(biāo)志物、研究劑量-效應(yīng)關(guān)系以及進(jìn)一步探索利用尿液蛋白進(jìn)行輻射劑量評(píng)估提供參考。