虞欣璐，于 兵，#，王 辰，張紅霞，朱海英，*

(1．海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)教研室，上海 200433；2．解放軍960醫(yī)院檢驗科，山東 濟南 250031)

譜系重編程(lineage reprogramming)是指不經(jīng)過中間的多能性狀態(tài)而直接通過轉(zhuǎn)分化將一種成熟的體細(xì)胞轉(zhuǎn)變成其他類型的體細(xì)胞或者成體干細(xì)胞。近年來，利用譜系重編程技術(shù)，研究者已經(jīng)可以將成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為心肌細(xì)胞、感光細(xì)胞，將神經(jīng)膠質(zhì)祖細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為中腦多巴胺能神經(jīng)元，將人膽囊細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為產(chǎn)生胰島素的β樣細(xì)胞。2014年，海軍軍醫(yī)大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室胡以平教授團隊在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblast cells，MEF)中過表達(dá)肝臟器官發(fā)生相關(guān)的兩個轉(zhuǎn)錄因子，肝細(xì)胞核因子1β(hepatocyte nuclear factor 1-β，Hnf1β)和叉頭框a3(forkhead box A3，F(xiàn)oxa3)，配合適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)培養(yǎng)液，經(jīng)過15～20 d，可以將其重編程為誘導(dǎo)性肝干細(xì)胞iHepSCs(induced hepatic stem cells)。他們的研究證明iHepSCs具有雙向分化能力，細(xì)胞移植后可修復(fù)受損肝組織且不具有成瘤能力，具有潛在的臨床應(yīng)用前景，但該過程所涉及的分子機制還不清楚。例如，重編程過程中的關(guān)鍵基因是如何被激活的，細(xì)胞的表觀遺傳特性又發(fā)生了哪些變化，哪些因子的激活和持續(xù)表達(dá)是重編程的關(guān)鍵因素等問題均需進(jìn)一步闡明，才能為今后將該技術(shù)體系應(yīng)用于人的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化研究提供更多的參考。

有研究表明四環(huán)素控制的誘導(dǎo)型表達(dá)載體在重編程分子機制研究方面發(fā)揮了重要作用。2008年，Brambrink等和Stadtfeld等就利用這個體系揭示了MEF去分化成為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)重編程的時間進(jìn)程，鑒定了每個階段的關(guān)鍵基因，為研究重編程機制提供了重要的研究資料。受該研究的啟發(fā)，我們認(rèn)為確認(rèn)譜系重編程的時間進(jìn)程、確定關(guān)鍵基因的激活次序及作用是闡明MEF轉(zhuǎn)分化為iHepSCs過程中所涉及分子機制的必須和重要前提。

在本研究中利用pLVX-TetOne-Vector慢病毒載體分別構(gòu)建了四環(huán)素控制的誘導(dǎo)型表達(dá)載體TetOHnf1β-EGFP和TetO-Foxa3-mCherry。pLVX-TetOne-Vector慢病毒載體是集調(diào)控與應(yīng)答功能于一體的四環(huán)素誘導(dǎo)載體，可以通過在培養(yǎng)液中加入四環(huán)素或撤掉四環(huán)素來實現(xiàn)目的基因表達(dá)開/關(guān)的人為控制。通過對獲得的轉(zhuǎn)分化細(xì)胞iHepSCs-Dox生物學(xué)特性的鑒定，我們成功建立了四環(huán)素控制的MEF細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肝干細(xì)胞的誘導(dǎo)體系，同時我們利用該體系檢測到在細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過程中，細(xì)胞內(nèi)源性

Hnf1

β和

Foxa3

并沒有被激活，由此提出外源基因的持續(xù)表達(dá)是iHepSCs-Dox細(xì)胞干性維持的必要條件，這為深入研究譜系重編程機制提供了便利。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM購自HyClone公司；DMEM/F12干粉培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶-EDTA、ITS、PBS，雙 抗(Pen/Strep，100×)、β-巰 基 乙 醇(2-mercaptoethanol)購自Gibco公司；尼克酰胺(nicotinamide，NA)、慶大霉素(gentamycin)、地塞米松(dexamethasone，Dex)、多西環(huán)素(doxycycline)購自Sigma公司；肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、維生素C(vitamin C)購自Polysciences公司；

Eco

RⅠ及

Bam

HⅠ限制性內(nèi)切酶購自Fermentas公司；T4連接酶(T4 Ligase)、RNAiso Plus、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT Reagent Kit)、定量PCR試劑盒(SYBR Premix Ex Taq)均購自TaKaRa公司；Vigofect轉(zhuǎn)染試劑購自Vigorous公司；Cell Cycle Staining Kit購自聯(lián)科生物公司。

1.2 儀器

倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡，Nikon公司生產(chǎn)；普通PCR儀，Eppendorf公司生產(chǎn)；熒光定量PCR儀，Applied Biosystems公司生產(chǎn)；流式細(xì)胞儀，Beckman coulter公司生產(chǎn)。

1.3 細(xì)胞

MEF來源于野生型C57BL/6J小鼠，iHepSCs由胡以平教授惠贈。

1.4 實驗方法

1.4.1 TetO-Hnf1β-EGFP與TetO-Foxa3-mCherry載體構(gòu)建和鑒定

Hnf1

β和

Foxa3

基因片段由本實驗室克隆獲得。將兩個基因片段克隆到pLenti-CMVEGFP-3FLAG-PGK-Puro表達(dá)載體上，構(gòu)建pCMVHnf1β-EGFP和pCMV-Foxa3-mCherry載體(和元公司合成)，這兩個質(zhì)粒上，

Hnf1β

基因與增強型綠色熒光蛋白EGFP之間，

Foxa3

基因與紅色熒光蛋白mCherry之間均由2A序列間隔，使目的基因與熒光蛋白非融合共表達(dá)。通過限制性內(nèi)切酶

Eco

RⅠ和

Bam

HⅠ酶切回收獲得pCMV-Hnf1β-EGFP和pCMV-Foxa3-mCherry載體質(zhì)粒中2 400 bp的Hnf1β-2A-EGFP片段和1 848 bp的Foxa3-2A-mCherry片段，然后通過T4連接酶將其分別克隆到pLVX-TetO-Vector載體的

Eco

RⅠ、

Bam

HⅠ位點(雙酶切后得到8 253 bp的載體片段)上，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans1-T1 Phage Resistant感受態(tài)細(xì)胞，鋪板，培養(yǎng)后挑取單克隆菌落進(jìn)行擴增并提取質(zhì)粒。質(zhì)粒提取后用

Eco

RⅠ/

Bam

HⅠ雙酶切鑒定，片段大小與預(yù)期結(jié)果一致，分別命名為TetO-Hnf1β-EGFP和TetO-Foxa3-mCherry。測序結(jié)果證實載體片段和目的基因片段進(jìn)行了正確的連接。

1.4.2 慢病毒包裝、收集與感染細(xì)胞

MEF和293FT細(xì)胞用DMEM高糖培養(yǎng)基(添加10%FBS，不含抗生素)，在5%二氧化碳培養(yǎng)箱，95%濕度環(huán)境下培養(yǎng)。

將293FT細(xì)胞培養(yǎng)至覆蓋培養(yǎng)皿70%～80%面積時利用Vigofect進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，按試劑說明書將總的20 μg質(zhì)粒DNA(目的基因質(zhì)粒10μg、病毒包裝質(zhì)粒psPAX2 6μg、包膜質(zhì)粒pMD2.G 4μg)與8μL Vigofect轉(zhuǎn)染試劑混勻后逐滴加入293FT細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在轉(zhuǎn)染48 h時收取含慢病毒的上清液，用0.45 μm濾器過濾后，分裝凍存于-80℃冰箱中。

MEF細(xì)胞感染前1 d，按1×10個/孔接種于0.02%明膠包被過的6孔板。MEF細(xì)胞接種后24 h，每孔各加入1 mL病毒液進(jìn)行感染，同時加入3.5μg/mL polybrene以促進(jìn)感染，感染6 h后棄去病毒液，PBS清洗3次后更換新鮮培養(yǎng)基，24 h后以同樣病毒量重復(fù)感染1次。

1.4.3 最適Doxycycline誘導(dǎo)濃度的確定

用含TetO-Hnf1β-EGFP與TetO-Foxa3-mCherry的病毒上清分別感染293FT細(xì)胞，之后再以終濃度為0、1、10、100、500、1 000 ng/mL的Dox來啟動外源基因的表達(dá)，比較不同Dox濃度和不同誘導(dǎo)時間的熒光表達(dá)差異。在Dox誘導(dǎo)24 h后更換不含Dox的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，分別取樣，用qPCR檢測轉(zhuǎn)錄因子Hnf1β和Foxa3的表達(dá)情況。

1.4.4 iHepSCs-Dox細(xì)胞系的建立

參照Yu等建立MEF誘導(dǎo)轉(zhuǎn)分化的方法獲得iHepSCs-Dox細(xì)胞。用含TetO-Hnf1β-EGFP與TetO-Foxa3-mCherry的病毒上清感染MEF，在加入Dox誘導(dǎo)24～48 h后進(jìn)行流式分選，富集熒光(綠色和紅色)雙陽性細(xì)胞，之后更換HepSCs培養(yǎng)液SCM-A繼續(xù)培養(yǎng)。SCM-A的成分包含DMEM/F12、胎牛血清(FBS，10%)、雙抗(1×)、ITS(1×)、HGF(10 ng/mL)、EGF(10 ng/mL)、Dex(1×10mol/L)、NA(10 mmol/L)、β-巰基乙醇(0.1 mmol/L)，慶大霉素(50μg/mL)。誘導(dǎo)期間隔天更換一次培養(yǎng)基，第20天可觀察到較多的上皮樣集落出現(xiàn)。在顯微鏡下刮除成纖維細(xì)胞，使上皮樣細(xì)胞獲得生長優(yōu)勢，進(jìn)而擴大培養(yǎng)獲得iHepSCs-Dox細(xì)胞。

1.4.5 體外誘導(dǎo)iHep SCs-Dox向肝細(xì)胞分化

將誘導(dǎo)后的iHepSCs-Dox接種到預(yù)先鋪過基質(zhì)膠的平板中，改用肝向誘導(dǎo)培養(yǎng)基(HDM)進(jìn)行誘導(dǎo)分化，HDM成分包含DMEM/F12、10%FBS、Oncostatin M(20 ng/mL)，雙抗(1×)、L-Ascorbic acid(0.1 mmol/L)、EGF(20 ng/mL)、Dex(1×10mol/L)、NA(10 mmol/L)。

1.4.6 實時熒光定量PCR

采用TaKaRa公司的RNAiso Plus裂解液提取293FT細(xì)胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄完成后將cDNA溶液稀釋5倍，按qPCR試劑說明配制反應(yīng)體系進(jìn)行實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)檢測，反應(yīng)完成后對原始數(shù)據(jù)根據(jù)-ΔΔ

C

進(jìn)行分析。所用引物見表1。

1.4.7 反轉(zhuǎn)錄PCR檢測

采用RNAiso Plus裂解液提取MEF、iHepSCs、iHepSCs-Dox細(xì)胞總RNA，利用PrimeScriptRT Reagent Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。然后將cDNA溶液稀釋至20%按PCR試劑說明配制反應(yīng)體系，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)擴增，之后用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。電泳結(jié)束后利用紫外成像系統(tǒng)拍攝膠圖。所用引物見表2。

表1 qPCR引物信息

表2 反轉(zhuǎn)錄PCR引物信息

1.4.8 堿性磷酸酶染色

按照碧云天公司的BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒說明書進(jìn)行。細(xì)胞用PBS清洗后加入4%多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)，室溫固定10 min，PBS清洗后加入BCIP/NBT染色工作液染色至預(yù)期深淺，去除染色液，ddHO清洗1～2次終止反應(yīng)后用掃描儀獲取染色圖像。

1.4.9 克隆形成率檢測

將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后制備單細(xì)胞懸液，按每孔500個細(xì)胞接種至6孔板，每組設(shè)3個復(fù)孔，連續(xù)培養(yǎng)5 d后，用4%PFA室溫固定15 min，棄去固定液，用結(jié)晶紫染液染色10～30 min，流水沖去染液，自然干燥，掃描儀掃描后統(tǒng)計克隆數(shù)，克隆形成率=平均克隆數(shù)/接種的單個細(xì)胞數(shù)×100%。

1.4.10 細(xì)胞周期檢測

本實驗周期檢測采用Cell Cycle Staining Kit，其原理為碘化丙啶(propidium iodide，PI)染料與DNA結(jié)合，利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞中DNA熒光強度變化來判斷細(xì)胞所處周期。首先利用胰酶消化制備單細(xì)胞懸液，離心收集細(xì)胞(細(xì)胞數(shù)約為2×10～1×10個)。去上清后再次用PBS懸浮細(xì)胞，離心后棄上清。在收集的細(xì)胞中加入1 mL的試劑A和10μL的試劑B，渦旋混勻5～10 s。室溫孵育30 min后上機分析。實驗步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

組間比較采用

t

檢驗。利用GraphPad Prism 5軟件繪圖。以

P

＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四環(huán)素誘導(dǎo)型慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定

圖1A結(jié)果顯示將質(zhì)粒pCMV-Hnf1β-EGFP、pCMV-Foxa3-mCherry、pLVX-TetO-Vector利用

Eco

RⅠ和

Bam

HⅠ進(jìn)行酶切后，得到2 400 bp的Hnf1β-2A-EGFP、1 848 bp的Foxa3-2A-mCherry、8 253 bp的pLVX-TetOne載體片段用于后續(xù)的質(zhì)粒構(gòu)建。圖1B和1C結(jié)果顯示新構(gòu)建的質(zhì)粒TetO-Hnf1β-EGFP和TetO-Foxa3-mCherry用

Eco

RⅠ/

Bam

HⅠ雙酶切后得到的片段大小與預(yù)期結(jié)果一致。

圖1 四環(huán)素誘導(dǎo)型慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建

2.2 四環(huán)素誘導(dǎo)型載體表達(dá)檢測及最適Dox誘導(dǎo)濃度的確定

為了保證我們所構(gòu)建的四環(huán)素控制的表達(dá)載體能有效而快速地啟動或關(guān)閉外源基因的表達(dá)，首先要對誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化。目前的研究認(rèn)為四環(huán)素控制系統(tǒng)常以終濃度為1～2μg/mL的Dox進(jìn)行誘導(dǎo)，我們在這個濃度范圍內(nèi)進(jìn)行濃度和時間梯度實驗，以確定最適的誘導(dǎo)條件。另外，由于293FT細(xì)胞相比MEF細(xì)胞更容易感染病毒顆粒，我們利用293FT細(xì)胞中對該載體表達(dá)的有效性及最適誘導(dǎo)濃度進(jìn)行了確定。實驗結(jié)果見圖2A和圖2B。比較不同濃度Dox誘導(dǎo)結(jié)果，可以看出，使用1和10 ng/mL的Dox誘導(dǎo)，在24 h內(nèi)均未觀察到紅色或綠色熒光出現(xiàn)，而使用100、500和1 000 ng/mL濃度誘導(dǎo)15 h，即可觀察到細(xì)胞熒光出現(xiàn)，而且隨著時間延長至24 h，熒光強度也明顯增強，但是3個濃度下，熒光強度在兩個時間點上均無明顯差異。比較撤去Dox后細(xì)胞中熒光表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)各Dox濃度下，綠色和紅色熒光在撤去Dox之后熒光強度都逐漸減弱，但是綠色熒光在48 h強度有明顯衰退，相比而言，紅色熒光衰退速度與Dox的濃度呈負(fù)相關(guān)，但100 ng/mL誘導(dǎo)的紅色熒光在48 h也有明顯衰退，1 000 ng/mL誘導(dǎo)96 h才呈現(xiàn)明顯衰退。在撤去Dox 5 d之后，不論最初以何種濃度誘導(dǎo)，均不再觀察到綠色熒光的表達(dá)，而紅色熒光的表達(dá)亦很微弱，此外，圖2C和2D的qPCR檢測結(jié)果表明，Dox誘導(dǎo)24 h與撤去Dox 48 h的細(xì)胞中外源雙因子Hnf1β和Foxa3的基因表達(dá)水平與熒光蛋白表達(dá)具有一致性。因此，我們認(rèn)為，TetO-Hnf1β-EGFP與TetO-Foxa3-mCherry載體上外源基因的表達(dá)，只需終濃度為100 ng/mL的Dox即可快速啟動，而且在撤去Dox后能快速關(guān)閉，所以我們選擇100 ng/mL作為Dox啟動外源基因表達(dá)的最適濃度。

圖2 不同Dox誘導(dǎo)濃度下外源因子的表達(dá)水平

2.3 利用四環(huán)素誘導(dǎo)型表達(dá)載體和干細(xì)胞培養(yǎng)基建立iHepSCs-Dox細(xì)胞系

結(jié)合前期誘導(dǎo)MEF細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的實驗體系，我們建立了如圖3所示的基于TetO-Hnf1β-EGFP與TetOFoxa3-mCherry表達(dá)載體的誘導(dǎo)實驗流程，成功獲得了如圖4所示的由MEF細(xì)胞轉(zhuǎn)分化而來的上皮樣細(xì)胞克隆。

如圖4所示，在誘導(dǎo)培養(yǎng)20 d時觀察到上皮樣細(xì)胞集落的形成，該上皮細(xì)胞核質(zhì)比較大，具有干細(xì)胞的典型特征。通過刮除細(xì)胞克隆周圍的成纖維樣細(xì)胞，使上皮樣細(xì)胞獲得生長優(yōu)勢。隨著誘導(dǎo)時間的延長，上皮樣細(xì)胞增殖速度加快，并形成細(xì)胞克隆。之后挑取克隆，并擴大培養(yǎng)，最終建立克隆化細(xì)胞系，命名為iHepSCs-Dox。

圖3 MEF轉(zhuǎn)分化為iHepSCs-Dox細(xì)胞誘導(dǎo)實驗流程

圖4 TetO-Hnf1β-EGFP與TetO-Foxa3-mCherry病毒感染MEF 20 d時產(chǎn)生上皮樣集落

2.4 iHep SCs-Dox細(xì)胞的形態(tài)和生長特性

在對挑取的克隆進(jìn)行擴大培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，所誘導(dǎo)的細(xì)胞在形態(tài)和生長特性方面與iHepSCs非常相似，如圖5A顯示，在低密度培養(yǎng)時，細(xì)胞呈現(xiàn)三角形或多邊形，且細(xì)胞間有長突起相連；而在高密度培養(yǎng)的情況下，細(xì)胞呈現(xiàn)典型的“鋪路石”樣形態(tài)。

另外，iHepSCs-Dox與iHepSCs在增殖能力方面存在差異。圖5B結(jié)晶紫染色結(jié)果顯示，iHepSCs-Dox的克隆形成能力低于iHepSCs，iHepSCs-Dox克隆形成率為8%，iHepSCs-Dox克隆形成率為23%，說明前者自我更新能力(單個細(xì)胞增殖能力)低于后者；CCK-8實驗結(jié)果顯示iHepSCs-Dox增殖速率(群體細(xì)胞增殖能力)也低于iHepSCs(圖5C)。細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示，與iHepSCs相比，iHepSCs-Dox G1期細(xì)胞數(shù)要高于iHepSCs，而其G2期及S期細(xì)胞數(shù)明顯少于iHepSCs(圖5D)，該結(jié)果表明細(xì)胞增殖速率存在差異。

圖5 iHepSCs-Dox細(xì)胞的體外生長特征

2.5 iHepSCs-Dox細(xì)胞的干性特征鑒定

RT-PCR檢測MEF、iHepSCs、iHepSCs-Dox細(xì)胞基因表達(dá)水平，如圖6A顯示，iHepSCs-Dox與iHepSCs一樣，表達(dá)膽管細(xì)胞標(biāo)志CK19、肝膽共同標(biāo)志CK18以及肝干細(xì)胞標(biāo)志Dlk1、Sox9、EpCAM。

堿性磷酸酶在多能干細(xì)胞中染色結(jié)果呈陽性，被認(rèn)為是干細(xì)胞的特性之一。如圖6B所示，iHepSCs、iHepSCs-Dox細(xì)胞呈現(xiàn)堿性磷酸酶染色陽性，而MEF為陰性。

在Dox存在的情況下，利用HDM誘導(dǎo)培養(yǎng)液對iHepSCs-Dox進(jìn)行肝向誘導(dǎo)第8天時，可觀察到如7E所示的典型肝細(xì)胞樣集落形成，這與iHepSCs的誘導(dǎo)分化情況一致。

根據(jù)以上結(jié)果，我們認(rèn)為雖然iHepSCs-Dox細(xì)胞與iHepSCs在增殖能力方面存在差異，但是在干性特征方面相似度很大，具備肝干細(xì)胞的特性。

圖6 iHepSCs-Dox細(xì)胞的鑒定

2.6 iHepSCs-Dox細(xì)胞的干性維持依賴于外源因子的表達(dá)

在對iHepSCs-Dox細(xì)胞進(jìn)行初步鑒定，確定了iHepSCs-Dox的干細(xì)胞性質(zhì)之后，我們分別收集了撤去培養(yǎng)液中的Dox之后在第10和第20天的細(xì)胞，RTPCR檢測其基因表達(dá)情況。如圖7A所示，在撤去Dox第10天之后，與持續(xù)Dox誘導(dǎo)的iHepSCs-Dox細(xì)胞相比，CK18、EpCAM的表達(dá)有所下調(diào)；在撤去Dox第20天時，甚至檢測不到肝膽共同標(biāo)志CK18的表達(dá)；而Sox9的表達(dá)水平在撤去Dox之后卻有了明顯的上升。不僅如此，細(xì)胞的自我更新能力和增殖速率也呈現(xiàn)明顯降低。如圖7B顯示，克隆形成率實驗中，在6孔板中接種起始500個細(xì)胞，撤去Dox 10 d的iHepSCs-Dox在接種后第5天不能形成克隆，而作為對照的持續(xù)Dox誘導(dǎo)的iHepSCs-Dox卻能正常形成克??；圖7C中CCk-8實驗顯示iHepSCs-Dox撤去Dox 10 d后生長速率明顯低于iHepSCs-Dox。同樣，圖7D的細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示，與iHepSCs-Dox相比，iHepSCs-Dox撤去Dox 10 d后，G1期細(xì)胞數(shù)明顯高于iHepSCs-Dox，而其G2期及S期細(xì)胞數(shù)明顯少于iHepSC-Dox。還有一個值得注意的現(xiàn)象是在iHepSCs-Dox誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞的實驗中，如圖7E所示，在添加了Dox誘導(dǎo)培養(yǎng)液的作用下，在第8天即觀察到了肝細(xì)胞樣克隆的出現(xiàn)；而在不含有Dox的誘導(dǎo)培養(yǎng)液中，如圖7F所示，我們不僅沒有觀察到肝細(xì)胞樣克隆的出現(xiàn)，還發(fā)現(xiàn)其由上皮樣細(xì)胞向成纖維細(xì)胞形態(tài)變化。再者，我們檢測了iHepSCs-Dox細(xì)胞中在撤去Dox第10天后內(nèi)源基因的表達(dá)情況，圖7G的RT-PCR結(jié)果顯示iHepSCs-Dox細(xì)胞的內(nèi)源性

Hnf1

β和

Foxa3

均無表達(dá)。這提示我們建立的iHepSCs-Dox細(xì)胞干性維持相關(guān)特征性基因的表達(dá)水平，需要外源基因

Hnf1

β和

Foxa3

的表達(dá)才能得以保證。這種情況也為我們分析重編程相關(guān)的受Hnf1β和Foxa3調(diào)控的基因網(wǎng)絡(luò)提供了便利。

3 討論

圖7 iHepSCs-Dox細(xì)胞的干性維持依賴于外源因子的表達(dá)

本研究構(gòu)建了四環(huán)素誘導(dǎo)型的Hnf1β和Foxa3轉(zhuǎn)錄因子慢病毒表達(dá)載體，感染MEF后利用Dox來啟動外源雙因子的表達(dá)，經(jīng)純化和擴增獲得了由MEF轉(zhuǎn)分化形成的iHepSCs-Dox細(xì)胞系，并從細(xì)胞形態(tài)、基因表達(dá)及干細(xì)胞特性等方面證明了該細(xì)胞系與iHepSCs細(xì)胞系的相似性，說明我們成功建立了四環(huán)素控制的MEF細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為iHepSCs的誘導(dǎo)體系。

如前所述，四環(huán)素控制的誘導(dǎo)型表達(dá)載體在研究重編程機制方面得到廣泛的應(yīng)用。在本研究中，我們利用的pLVX-TetOne載體，因為包含四環(huán)素誘導(dǎo)所需的表達(dá)和應(yīng)答元件，所以慢病毒載體本身骨架比較長，限制了插入基因的片段長度，因此我們將

Hnf1β

和

Foxa3

基因分別插入到兩個載體上，但用不同的熒光報告基因作指示，這樣就可以篩選單熒光表達(dá)陽性和雙熒光表達(dá)陽性的細(xì)胞，為研究

Hnf1

β和

Foxa3

基因在重編程表達(dá)中的作用提供了方便。但是這也帶來了另一個問題，因為表達(dá)載體的總長度約11 kb，加之MEF細(xì)胞本身又不易感染病毒顆粒，所以造成感染效率較低。為了提高轉(zhuǎn)染效率，我們在實驗中使用了轉(zhuǎn)染效率更高的轉(zhuǎn)染試劑以及產(chǎn)毒效率更高的293FT細(xì)胞來進(jìn)行病毒的包裝，最后獲得的雙陽性細(xì)胞比例達(dá)到10%。在后續(xù)的實驗中我們將會采用超速離心的方法對病毒進(jìn)行濃縮以提高病毒滴度，期望能進(jìn)一步提高感染效率。我們利用RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)內(nèi)源

Hnf1β

和

Foxa3

表達(dá)并沒有被激活，這就為利用Dox的撤除關(guān)閉雙因子表達(dá)的方式來研究轉(zhuǎn)分化相關(guān)的受Hnf1β和Foxa3調(diào)控的基因網(wǎng)絡(luò)提供了便利。研究表明，Hnf1β是一個具有POU同源域的轉(zhuǎn)錄因子，F(xiàn)oxa3是forkhead轉(zhuǎn)錄因子家族一員，它們在肝臟發(fā)育進(jìn)程中具有關(guān)鍵作用，有研究證明在小鼠肝臟中過表達(dá)Hnf1β能加速細(xì)胞增殖，促進(jìn)肝臟再生，而Wangensteen等的研究表明，過表達(dá)Foxa3亦能促進(jìn)肝臟再生。從這兩個轉(zhuǎn)錄因子的功能考慮，在內(nèi)源性雙因子未被激活表達(dá)的情況下，通過Dox來控制兩個外源轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，同時結(jié)合干細(xì)胞表型的改變，就能比較容易找到與iHepSCs干細(xì)胞特性維持相關(guān)的基因。本實驗中，我們也的確檢測到了幾個成體肝干細(xì)胞干性相關(guān)基因表達(dá)隨著雙因子表達(dá)的關(guān)閉而發(fā)生了表達(dá)水平的變化。比如我們檢測到iHepSCs中，在關(guān)閉兩個轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)后，CK18、EpCAM的表達(dá)都有所下調(diào)；在撤去Dox第20天時，甚至檢測不到肝膽共同標(biāo)志CK18的表達(dá)；而Sox9的表達(dá)水平在撤去Dox之后卻有了明顯的上升。以上現(xiàn)象一方面說明了我們所使用的雙因子的確具有使MEF細(xì)胞重編程進(jìn)而轉(zhuǎn)分化的能力，另一方面該結(jié)果也提示了細(xì)胞轉(zhuǎn)分化機制的復(fù)雜性。關(guān)于多能性重編程的研究指出，MEF細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為iPSCs細(xì)胞的過程中內(nèi)源性

OCT4

基因的表達(dá)在某一個時間點是被激活的，而且這可以作為細(xì)胞多能性建立的標(biāo)志，即使這時關(guān)閉外源OCT4的表達(dá)，細(xì)胞仍然能夠重編程成功并獲得iPS細(xì)胞，但Takumi等利用OCT4、KLF4、SOX2、L-MYC和NANOG這5個轉(zhuǎn)錄因子將人成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)干細(xì)胞的實驗中，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)完成后內(nèi)源性的OCT4和NANOG仍然未被激活，撤去培養(yǎng)液中的Dox后，細(xì)胞所呈現(xiàn)的神經(jīng)干細(xì)胞樣形態(tài)會逐漸丟失并且出現(xiàn)分化，這種現(xiàn)象與我們的實驗結(jié)果類似。這些差別提示成纖維細(xì)胞向不同分化等級的干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化或去分化的過程中所涉及的分子機制存在較大差異，值得進(jìn)一步深入研究，要獲得穩(wěn)定表型的成體干細(xì)胞可能需要對轉(zhuǎn)分化的誘導(dǎo)條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。