陳瑤，劉芳勛，韓春光

0 引言

食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）是一種常見的消化道腫瘤，死亡率高，5年生存率只有10%[1]。ESCC患者由于沒(méi)有早期癥狀，通常診斷較晚，預(yù)后較差，其發(fā)生與飲酒、吸煙、營(yíng)養(yǎng)不良、接觸致癌物質(zhì)等多種因素相關(guān)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，缺鋅飲食可以增加人類ESCC的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，補(bǔ)充膳食鋅可能對(duì)ESCC具有預(yù)防和治療作用[3-4]。缺鋅可導(dǎo)致一些與免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的基因過(guò)表達(dá)，如促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和環(huán)核苷酸磷酸二酯酶（PDEs）等，都可能影響食管癌的發(fā)生發(fā)展[5]。由于該元素具有多種功能，可認(rèn)為其在抗腫瘤的啟動(dòng)和促進(jìn)中的作用是多途徑的，但其作用機(jī)制尚不完全清楚。本研究通過(guò)觀察缺鋅飲食對(duì)小鼠血液和組織鋅濃度、食管黏膜病理變化及5種腫瘤相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，初步探討飲食鋅缺乏對(duì)小鼠食管鱗狀上皮細(xì)胞增殖的影響及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及動(dòng)物飼料配置

免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑PCNA（貨號(hào)：ab92552）、NF-κB p105（貨號(hào)：ab32360）、COX-2（貨號(hào)：ab15191）、NF-κB p65（貨號(hào)：ab16502）、P38MAPK（貨號(hào)：ab31828）均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。倒置顯微鏡：日本Olympus公司。電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS），型號(hào)：DRC-II（美國(guó)Perkin Elmer公司）。缺鋅飼料（貨號(hào)：D19401，鋅含量為0.66～0.89 ppm）和足鋅飼料（貨號(hào)：D19410B，鋅含量為30.66～30.89 ppm）購(gòu)自美國(guó)Research Diets公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

C57BL/6乳鼠，0～1周齡，SPF級(jí)，6窩，每窩4～6只，由斯貝福（北京）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK（京）2011-0004。實(shí)驗(yàn)小鼠分兩組：足鋅組和缺鋅組。每組3窩，0～3周足鋅組母鼠喂養(yǎng)足鋅飼料，缺鋅組喂養(yǎng)缺鋅飼料，3周后斷乳處死母鼠。兩組小鼠按斷乳前飼料繼續(xù)喂養(yǎng)4～12周，每組分配10只小鼠。每周稱量一次小鼠的體質(zhì)量和進(jìn)食飼料的重量。因?qū)嶒?yàn)過(guò)程中，小鼠體質(zhì)量差異大，每只小鼠每日進(jìn)食量用小鼠體質(zhì)量作標(biāo)準(zhǔn)化，表示為g/mouse/day/kg。12周結(jié)束時(shí)采用脊椎脫臼法處死小鼠。

1.3 標(biāo)本采集及處理

苯巴比妥麻醉小鼠，采集動(dòng)物尾尖血液，制備血清進(jìn)行血清鋅分析。隨后處死小鼠，立即取食管剖開，用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，將食管黏膜組織分三份：一份用于黏膜鋅濃度測(cè)定；另兩份以甲醛固定，制備常規(guī)石蠟包埋切片，其中一份行蘇木精伊紅（HE）染色后在200倍光學(xué)顯微鏡下觀察病理改變，另一份脫蠟至水化。行免疫組織化學(xué)PV兩步法，檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）、P38絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase p38,P38MAPK）、核因子κB（nuclear factor kappa B,NF-κB）p105、NF-κB p65和環(huán)氧合酶-2（Cyclooxygenase2,COX-2）的表達(dá)水平。

1.4 鋅濃度檢測(cè)

測(cè)定血清和食管黏膜鋅含量。上樣前，將血清標(biāo)本稀釋20倍，稱取食管黏膜標(biāo)本，微波消解，稀釋20倍。ICP-MS的設(shè)置參數(shù)：霧化氣流量：0.98 L/min，輔助氣流量：1.20 L/min，等離子體氣流量：15.0 L/min，駐留時(shí)間：100 ms，樣品提升量：1 ml/min；掃描方式：?jiǎn)吸c(diǎn)跳峰；分辨率：0.7～0.9 aum。45 Sc,166 Er，檢出限Sc:0.03 ng/ml，Er:0.0003 ng/ml。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件處理，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)或精確概率法檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺鋅飲食對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

3周齡時(shí)兩組小鼠體質(zhì)量無(wú)明顯差異，10周齡及12周齡時(shí)，缺鋅組小鼠體質(zhì)量明顯低于足鋅組小鼠（均P＜0.05），見表1。

表1 缺鋅飲食對(duì)小鼠平均體質(zhì)量的影響 (g)Table 1 Effect of zinc deficiency on body weight of mice (g)

2.2 缺鋅飲食對(duì)小鼠進(jìn)食量的影響

與足鋅組相比，3周齡和10周齡缺鋅組小鼠進(jìn)食量無(wú)顯著差異，12周齡缺鋅組小鼠進(jìn)食量明顯減少（P＜0.01），見表2。

表2 缺鋅飲食對(duì)小鼠進(jìn)食量的影響 (g/mouse/day/kg)Table 2 Effect of zinc deficiency on food intake of mice (g/mouse/day/kg)

2.3 缺鋅飲食對(duì)血清鋅及組織鋅的影響

與足鋅組相比，缺鋅組小鼠血清鋅及食管黏膜組織鋅含量明顯降低（P＜0.05），見表3。

表3 缺鋅飲食對(duì)血清及黏膜組織鋅含量的影響 ()Table 3 Effect of zinc deficiency on zinc content in serum and esophageal mucosal of mice ()

表3 缺鋅飲食對(duì)血清及黏膜組織鋅含量的影響 ()Table 3 Effect of zinc deficiency on zinc content in serum and esophageal mucosal of mice ()

2.4 小鼠食管黏膜病理改變

HE染色下，足鋅組小鼠食管黏膜基底細(xì)胞排列分布規(guī)整，由一層細(xì)胞構(gòu)成；缺鋅組小鼠食管黏膜組織基底細(xì)胞增生明顯，基底細(xì)胞由一層增生為2～4層，細(xì)胞排列紊亂，角化層增厚，未見柱狀上皮化生和炎性反應(yīng)、潰瘍，見圖1。

圖1 食管黏膜組織HE染色 (×200)Figure 1 HE staining of esophageal mucosa tissues (×200)

2.5 小鼠食管黏膜組織中COX-2、NF-κB p65、NF-κB p105、P38MAPK和PCNA蛋白表達(dá)

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：與足鋅組相比，缺鋅組小鼠食管黏膜COX-2、NF-κB p65、NF-κB p105、P38MAPK和PCNA表達(dá)顯著增加，見圖2。

圖2 食管黏膜組織中COX-2、NF-κB p65、NF-κB p105、P38MAPK和PCNA免疫組織化學(xué)染色 (×200)Figure 2 Immunohistochemical staining of COX-2,NF-κB p65,NFκB p105,P38MAPK and PCNA in esophageal mucosa tissues (×200)

3 討論

鋅是一種人體必需的微量元素，在體內(nèi)分布廣泛，具有促進(jìn)人體生長(zhǎng)發(fā)育、增加細(xì)胞免疫功能、穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)、抗氧化等多種功能[5]。由于人體不能儲(chǔ)存鋅，飲食不當(dāng)導(dǎo)致的鋅缺乏非常普遍。缺鋅是一個(gè)全球性的健康問(wèn)題，全球31%的人口存在不同程度的鋅缺乏，其中10%以上的人飲食中鋅的攝入量不足推薦劑量的一半[6-8]。流行病學(xué)研究顯示，慢性飲食鋅缺乏可顯著增加ESCC等癌癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[3]，鋅在對(duì)抗ESCC發(fā)生及進(jìn)展中起到一定作用，但其作用機(jī)制尚不明確。本研究通過(guò)動(dòng)物模型，初步探討飲食鋅缺乏對(duì)小鼠食管鱗狀上皮細(xì)胞增殖的影響及其可能機(jī)制。

本研究顯示，缺鋅飲食飼養(yǎng)12周后，缺鋅組小鼠進(jìn)食量、體質(zhì)量均顯著下降，血清鋅及食管黏膜組織鋅含量明顯降低。缺鋅組小鼠食管黏膜組織基底細(xì)胞增生明顯，細(xì)胞排列紊亂，角化層增厚。有研究顯示，消化道癌癥患者血液中鋅的濃度較低，組織鋅濃度高與降低ESCC的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)，補(bǔ)鋅可誘導(dǎo)食管上皮細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)癌癥發(fā)展[9-10]。既往有針對(duì)大鼠的研究顯示，5周低鋅飲食的大鼠會(huì)形成具有獨(dú)特基因特征的增生性食管[11]，23周低鋅飲食會(huì)導(dǎo)致癌癥相關(guān)的炎性因子表達(dá)增加，當(dāng)與非致癌劑量的環(huán)境致癌物質(zhì)N-亞硝基-N-甲基-4-氨基丁酸（N-Nitroso-N-methyl-4-aminobutyric acid,NMBA）結(jié)合時(shí)，會(huì)導(dǎo)致食管癌的發(fā)生[12]。膳食鋅的缺乏還可能導(dǎo)致大鼠食管上皮鱗狀細(xì)胞增生和角化過(guò)度，這種細(xì)胞增生與大鼠食管癌的發(fā)生存在直接關(guān)系[13]。來(lái)自食管癌高發(fā)地區(qū)的研究顯示，食管上皮細(xì)胞的增殖與癌癥風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[14]。在中國(guó)北方食管癌高發(fā)地區(qū)，飲食以谷物為主，缺乏鋅等微量元素，這可能促進(jìn)了食管細(xì)胞的增殖，并進(jìn)一步在多步驟中促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的演化[15]。

本研究免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，缺鋅組小鼠食管黏膜PCNA、P38MAPK、NF-κB p105、NF-κB p65、COX-2顯著增加。PCNA是一種只存在于增殖期細(xì)胞內(nèi)的多肽，能反映細(xì)胞增殖能力和所處的細(xì)胞周期，是反映細(xì)胞增殖狀態(tài)的指標(biāo)[16]。細(xì)胞增殖活性是臨床對(duì)惡性腫瘤組織學(xué)分級(jí)的重要依據(jù)，臨床病理學(xué)中把檢測(cè)PCNA的表達(dá)水平作為評(píng)價(jià)腫瘤惡性程度和增殖潛能的重要指標(biāo)。NF-κB p105及NF-κB p65是NF-κB家族的重要成員，在參與炎性反應(yīng)、細(xì)胞增殖、分化與凋亡，免疫反應(yīng)和腫瘤形成等相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[17]。鋅可通過(guò)多種機(jī)制調(diào)控NF-κB信號(hào)通路，NF-κB和其信號(hào)通路中的大部分激活因子被認(rèn)為在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有重要作用[18]。COX-2是誘導(dǎo)型環(huán)氧合酶，可催化前列腺素合成參與炎性反應(yīng)。COX-2的高表達(dá)會(huì)增加健康人群患食管癌的風(fēng)險(xiǎn)，降低食管癌患者的生存[19]。P38MAPK信號(hào)通路參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其表達(dá)的改變可能是食管癌預(yù)后不良的潛在生物標(biāo)志物[20]。本研究顯示缺鋅飲食可以誘導(dǎo)COX-2、P38MAPK、PCNA、NF-κBp等腫瘤相關(guān)因子過(guò)度表達(dá)，這可能與ESCC的發(fā)生有關(guān)。Taccioli等[12]也發(fā)現(xiàn)營(yíng)養(yǎng)元素鋅的缺乏誘導(dǎo)了腫瘤相關(guān)炎性反應(yīng)因子過(guò)度表達(dá)并伴有上皮細(xì)胞的增生，這種持續(xù)的炎性反應(yīng)是ESCC發(fā)展的關(guān)鍵因素。另外也有研究[21-22]發(fā)現(xiàn)，缺鋅會(huì)導(dǎo)致miR-31和miR-21失調(diào)，激活S100A8炎性反應(yīng)因子，促進(jìn)食管癌的發(fā)生。鋅補(bǔ)充可以逆轉(zhuǎn)S100A8的過(guò)表達(dá)和大鼠食管癌前瘤變。

綜上所述，飲食鋅攝入不足可以抑制小鼠生長(zhǎng)，促進(jìn)小鼠食管上皮鱗狀細(xì)胞增殖，其機(jī)制與誘導(dǎo)COX-2、P38MAPK、PCNA、NF-κBp等腫瘤相關(guān)因子過(guò)度表達(dá)有關(guān)。中國(guó)是食管癌高發(fā)病率國(guó)家，增加魚類、海鮮、肉類、新鮮蔬菜和水果等富含鋅的食物攝入對(duì)于預(yù)防食管癌的發(fā)生可能是有益的。