陳瑤，劉芳勛，韓春光

0 引言

食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）是一種常見的消化道腫瘤，死亡率高，5年生存率只有10%[1]。ESCC患者由于沒有早期癥狀，通常診斷較晚，預(yù)后較差，其發(fā)生與飲酒、吸煙、營養(yǎng)不良、接觸致癌物質(zhì)等多種因素相關(guān)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，缺鋅飲食可以增加人類ESCC的發(fā)生風險，補充膳食鋅可能對ESCC具有預(yù)防和治療作用[3-4]。缺鋅可導(dǎo)致一些與免疫反應(yīng)、細胞凋亡、細胞增殖和轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的基因過表達，如促炎細胞因子白細胞介素1β（IL-1β）、白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和環(huán)核苷酸磷酸二酯酶（PDEs）等，都可能影響食管癌的發(fā)生發(fā)展[5]。由于該元素具有多種功能，可認為其在抗腫瘤的啟動和促進中的作用是多途徑的，但其作用機制尚不完全清楚。本研究通過觀察缺鋅飲食對小鼠血液和組織鋅濃度、食管黏膜病理變化及5種腫瘤相關(guān)蛋白表達的影響，初步探討飲食鋅缺乏對小鼠食管鱗狀上皮細胞增殖的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及動物飼料配置

免疫組織化學檢測試劑PCNA（貨號：ab92552）、NF-κB p105（貨號：ab32360）、COX-2（貨號：ab15191）、NF-κB p65（貨號：ab16502）、P38MAPK（貨號：ab31828）均購自英國Abcam公司。倒置顯微鏡：日本Olympus公司。電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS），型號：DRC-II（美國Perkin Elmer公司）。缺鋅飼料（貨號：D19401，鋅含量為0.66～0.89 ppm）和足鋅飼料（貨號：D19410B，鋅含量為30.66～30.89 ppm）購自美國Research Diets公司。

1.2 實驗動物分組及處理

C57BL/6乳鼠，0～1周齡，SPF級，6窩，每窩4～6只，由斯貝福（北京）實驗動物科技有限公司提供，合格證號：SCXK（京）2011-0004。實驗小鼠分兩組：足鋅組和缺鋅組。每組3窩，0～3周足鋅組母鼠喂養(yǎng)足鋅飼料，缺鋅組喂養(yǎng)缺鋅飼料，3周后斷乳處死母鼠。兩組小鼠按斷乳前飼料繼續(xù)喂養(yǎng)4～12周，每組分配10只小鼠。每周稱量一次小鼠的體質(zhì)量和進食飼料的重量。因?qū)嶒炦^程中，小鼠體質(zhì)量差異大，每只小鼠每日進食量用小鼠體質(zhì)量作標準化，表示為g/mouse/day/kg。12周結(jié)束時采用脊椎脫臼法處死小鼠。

1.3 標本采集及處理

苯巴比妥麻醉小鼠，采集動物尾尖血液，制備血清進行血清鋅分析。隨后處死小鼠，立即取食管剖開，用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，將食管黏膜組織分三份：一份用于黏膜鋅濃度測定；另兩份以甲醛固定，制備常規(guī)石蠟包埋切片，其中一份行蘇木精伊紅（HE）染色后在200倍光學顯微鏡下觀察病理改變，另一份脫蠟至水化。行免疫組織化學PV兩步法，檢測增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）、P38絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase p38,P38MAPK）、核因子κB（nuclear factor kappa B,NF-κB）p105、NF-κB p65和環(huán)氧合酶-2（Cyclooxygenase2,COX-2）的表達水平。

1.4 鋅濃度檢測

測定血清和食管黏膜鋅含量。上樣前，將血清標本稀釋20倍，稱取食管黏膜標本，微波消解，稀釋20倍。ICP-MS的設(shè)置參數(shù)：霧化氣流量：0.98 L/min，輔助氣流量：1.20 L/min，等離子體氣流量：15.0 L/min，駐留時間：100 ms，樣品提升量：1 ml/min；掃描方式：單點跳峰；分辨率：0.7～0.9 aum。45 Sc,166 Er，檢出限Sc:0.03 ng/ml，Er:0.0003 ng/ml。

1.5 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)用SPSS22.0統(tǒng)計分析軟件處理，符合正態(tài)分布的計量資料以（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗或精確概率法檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 缺鋅飲食對小鼠體質(zhì)量的影響

3周齡時兩組小鼠體質(zhì)量無明顯差異，10周齡及12周齡時，缺鋅組小鼠體質(zhì)量明顯低于足鋅組小鼠（均P＜0.05），見表1。

表1 缺鋅飲食對小鼠平均體質(zhì)量的影響 (g)Table 1 Effect of zinc deficiency on body weight of mice (g)

2.2 缺鋅飲食對小鼠進食量的影響

與足鋅組相比，3周齡和10周齡缺鋅組小鼠進食量無顯著差異，12周齡缺鋅組小鼠進食量明顯減少（P＜0.01），見表2。

表2 缺鋅飲食對小鼠進食量的影響 (g/mouse/day/kg)Table 2 Effect of zinc deficiency on food intake of mice (g/mouse/day/kg)

2.3 缺鋅飲食對血清鋅及組織鋅的影響

與足鋅組相比，缺鋅組小鼠血清鋅及食管黏膜組織鋅含量明顯降低（P＜0.05），見表3。

表3 缺鋅飲食對血清及黏膜組織鋅含量的影響 ()Table 3 Effect of zinc deficiency on zinc content in serum and esophageal mucosal of mice ()

表3 缺鋅飲食對血清及黏膜組織鋅含量的影響 ()Table 3 Effect of zinc deficiency on zinc content in serum and esophageal mucosal of mice ()

2.4 小鼠食管黏膜病理改變

HE染色下，足鋅組小鼠食管黏膜基底細胞排列分布規(guī)整，由一層細胞構(gòu)成；缺鋅組小鼠食管黏膜組織基底細胞增生明顯，基底細胞由一層增生為2～4層，細胞排列紊亂，角化層增厚，未見柱狀上皮化生和炎性反應(yīng)、潰瘍，見圖1。

圖1 食管黏膜組織HE染色 (×200)Figure 1 HE staining of esophageal mucosa tissues (×200)

2.5 小鼠食管黏膜組織中COX-2、NF-κB p65、NF-κB p105、P38MAPK和PCNA蛋白表達

免疫組織化學結(jié)果顯示：與足鋅組相比，缺鋅組小鼠食管黏膜COX-2、NF-κB p65、NF-κB p105、P38MAPK和PCNA表達顯著增加，見圖2。

圖2 食管黏膜組織中COX-2、NF-κB p65、NF-κB p105、P38MAPK和PCNA免疫組織化學染色 (×200)Figure 2 Immunohistochemical staining of COX-2,NF-κB p65,NFκB p105,P38MAPK and PCNA in esophageal mucosa tissues (×200)

3 討論

鋅是一種人體必需的微量元素，在體內(nèi)分布廣泛，具有促進人體生長發(fā)育、增加細胞免疫功能、穩(wěn)定細胞結(jié)構(gòu)、抗氧化等多種功能[5]。由于人體不能儲存鋅，飲食不當導(dǎo)致的鋅缺乏非常普遍。缺鋅是一個全球性的健康問題，全球31%的人口存在不同程度的鋅缺乏，其中10%以上的人飲食中鋅的攝入量不足推薦劑量的一半[6-8]。流行病學研究顯示，慢性飲食鋅缺乏可顯著增加ESCC等癌癥的發(fā)生風險[3]，鋅在對抗ESCC發(fā)生及進展中起到一定作用，但其作用機制尚不明確。本研究通過動物模型，初步探討飲食鋅缺乏對小鼠食管鱗狀上皮細胞增殖的影響及其可能機制。

本研究顯示，缺鋅飲食飼養(yǎng)12周后，缺鋅組小鼠進食量、體質(zhì)量均顯著下降，血清鋅及食管黏膜組織鋅含量明顯降低。缺鋅組小鼠食管黏膜組織基底細胞增生明顯，細胞排列紊亂，角化層增厚。有研究顯示，消化道癌癥患者血液中鋅的濃度較低，組織鋅濃度高與降低ESCC的發(fā)生風險密切相關(guān)，補鋅可誘導(dǎo)食管上皮細胞凋亡，逆轉(zhuǎn)癌癥發(fā)展[9-10]。既往有針對大鼠的研究顯示，5周低鋅飲食的大鼠會形成具有獨特基因特征的增生性食管[11]，23周低鋅飲食會導(dǎo)致癌癥相關(guān)的炎性因子表達增加，當與非致癌劑量的環(huán)境致癌物質(zhì)N-亞硝基-N-甲基-4-氨基丁酸（N-Nitroso-N-methyl-4-aminobutyric acid,NMBA）結(jié)合時，會導(dǎo)致食管癌的發(fā)生[12]。膳食鋅的缺乏還可能導(dǎo)致大鼠食管上皮鱗狀細胞增生和角化過度，這種細胞增生與大鼠食管癌的發(fā)生存在直接關(guān)系[13]。來自食管癌高發(fā)地區(qū)的研究顯示，食管上皮細胞的增殖與癌癥風險增加有關(guān)[14]。在中國北方食管癌高發(fā)地區(qū)，飲食以谷物為主，缺乏鋅等微量元素，這可能促進了食管細胞的增殖，并進一步在多步驟中促進腫瘤細胞的演化[15]。

本研究免疫組織化學結(jié)果顯示，缺鋅組小鼠食管黏膜PCNA、P38MAPK、NF-κB p105、NF-κB p65、COX-2顯著增加。PCNA是一種只存在于增殖期細胞內(nèi)的多肽，能反映細胞增殖能力和所處的細胞周期，是反映細胞增殖狀態(tài)的指標[16]。細胞增殖活性是臨床對惡性腫瘤組織學分級的重要依據(jù)，臨床病理學中把檢測PCNA的表達水平作為評價腫瘤惡性程度和增殖潛能的重要指標。NF-κB p105及NF-κB p65是NF-κB家族的重要成員，在參與炎性反應(yīng)、細胞增殖、分化與凋亡，免疫反應(yīng)和腫瘤形成等相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[17]。鋅可通過多種機制調(diào)控NF-κB信號通路，NF-κB和其信號通路中的大部分激活因子被認為在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有重要作用[18]。COX-2是誘導(dǎo)型環(huán)氧合酶，可催化前列腺素合成參與炎性反應(yīng)。COX-2的高表達會增加健康人群患食管癌的風險，降低食管癌患者的生存[19]。P38MAPK信號通路參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其表達的改變可能是食管癌預(yù)后不良的潛在生物標志物[20]。本研究顯示缺鋅飲食可以誘導(dǎo)COX-2、P38MAPK、PCNA、NF-κBp等腫瘤相關(guān)因子過度表達，這可能與ESCC的發(fā)生有關(guān)。Taccioli等[12]也發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)元素鋅的缺乏誘導(dǎo)了腫瘤相關(guān)炎性反應(yīng)因子過度表達并伴有上皮細胞的增生，這種持續(xù)的炎性反應(yīng)是ESCC發(fā)展的關(guān)鍵因素。另外也有研究[21-22]發(fā)現(xiàn)，缺鋅會導(dǎo)致miR-31和miR-21失調(diào)，激活S100A8炎性反應(yīng)因子，促進食管癌的發(fā)生。鋅補充可以逆轉(zhuǎn)S100A8的過表達和大鼠食管癌前瘤變。

綜上所述，飲食鋅攝入不足可以抑制小鼠生長，促進小鼠食管上皮鱗狀細胞增殖，其機制與誘導(dǎo)COX-2、P38MAPK、PCNA、NF-κBp等腫瘤相關(guān)因子過度表達有關(guān)。中國是食管癌高發(fā)病率國家，增加魚類、海鮮、肉類、新鮮蔬菜和水果等富含鋅的食物攝入對于預(yù)防食管癌的發(fā)生可能是有益的。