徐豪,郝建偉,束坤鵬,張灝,皇甫雪軍,張云天,石紅林
膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤,也是世界第九大常見癌癥,具有易轉移、易復發(fā)等特點[1-2]。據(jù)研究調查[3]顯示,1990年至2017年我國膀胱癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢,其防治形勢不容樂觀。盡管膀胱癌的早期診斷及治療技術得到極大提高,但其死亡率并沒有得到明顯改善[3]。因此,尋找潛在分子治療靶點,可能對膀胱癌的治療具有重要臨床意義。富含脯氨酸蛋白11(proline-rich protein 11,PRR11)是定位于染色體17q22區(qū)的腫瘤相關基因,參與調控腫瘤細胞周期進程、凋亡、侵襲等諸多生物學過程。已有研究顯示,PRR11在多種腫瘤組織中高表達,例如食管鱗狀細胞癌[4]、宮頸癌[5]、膽囊癌[6]、乳腺癌[7]等,并且其高表達與患者不良預后相關。也有研究[8-9]報道稱,靶向沉默PRR11表達可抑制乳腺癌及結直腸癌細胞的增殖、遷移與侵襲,并誘導細胞凋亡。基于以上研究報道,提示PRR11可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演癌基因的作用。然而,PRR11在膀胱癌中的表達水平及臨床意義目前尚不明確。本研究旨在分析PRR11在膀胱尿路上皮癌中的表達及其臨床意義,并探討干擾PRR11的表達對膀胱癌細胞增殖和凋亡的影響,以期為膀胱癌的分子靶向治療提供理論基礎。
選擇2017年2月—至2019年1月在河南省人民醫(yī)院泌尿外科行膀胱癌根治性切除術的57例膀胱癌患者癌組織標本及其對應的癌旁組織標本(距癌灶邊緣>5 cm),所有癌組織均經病理學證實為膀胱尿路上皮癌,患者術前均未接受任何放療、化療及其他抗腫瘤治療。所有患者均簽署知情同意書,且本研究獲得河南省人民醫(yī)院倫理委員會批準。
人永生化膀胱上皮細胞株SV-HUC-1以及人膀胱癌細胞株HTB-9、T24、J82和UM-UC-3均購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心;胎牛血清、F12K、RPMI 1640和DEME培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司;含有shRNA-PRR11重組質粒及其陰性對照(shRNA-NC)質粒的慢病毒(慢病毒滴度:2×108TU/ml)由上海吉凱基因醫(yī)學科技股份有限公司提供;TRIzol試劑盒購自美國Invitrogen公司;PrimeScript? Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit和SYBR?Premix Ex Taq? Kit購自寶生物工程(大連)有限公司;CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司;Giemsa染液、免疫組織化學SP法試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;兔抗人PRR11多克隆抗體購自英國Abcam公司;兔抗人Caspase3單克隆抗體、兔抗人Bax多克隆抗體、小鼠抗人Bcl-2多克隆抗體和兔抗人GAPDH單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司;辣酸根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔或小鼠IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司;ELx8000型酶標儀購自美國Bio-Tek公司;C6流式細胞儀購自美國BD公司;實時熒光定量PCR儀器購自美國Applied Biosystems公司。
1.3.1 免疫組織化學檢測 取石蠟包埋的膀胱癌及其癌旁組織,切片后脫蠟至水,3%H2O2處理10 min以滅活內源性過氧化物酶,0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液沸水浴處理進行抗原修復,滴加山羊血清封閉20 min,滴加PRR11抗體(1:50),4℃孵育過夜,PBS洗滌3次,滴加Bio-羊抗兔IgG二抗,室溫孵育1 h,PBS洗滌3次,滴加鏈霉親和素-POD工作液,室溫孵育30 min,PBS洗滌3次,滴加DAB顯色液,室溫孵育10 min,PBS洗滌3次以終止反應,蘇木精對比染色,梯度乙醇脫水干燥,二甲苯透明,中性樹脂封片,光學顯微鏡觀察。PRR11陽性染色以細胞質和細胞核呈棕黃色或棕褐色顆粒狀,根據(jù)視野內細胞陽性細胞百分比和著色強度進行評分[10]。按照染色強度的深淺評分:無著色為0分、淡黃色1分、棕黃色2分,棕褐色3分;按照陽性細胞百分比評分:<5%為0分,5%~<25%為1分,25%~75%為2分,≥75%為3分。兩項得分結果相乘為最終得分,評分≤4分為低表達,評分>4分為高表達。
1.3.2 細胞培養(yǎng) 從液氮罐中取出凍存的SVHUC-1、HTB-9、T24、J82和UM-UC-3等細胞,其中SV-HUC-1細胞采用含有10%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基培養(yǎng),HTB-9、T24和UM-UC-3細胞分別采用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng),而J82細胞采用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。復蘇后的各細胞置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔2~3 d傳代1次。
1.3.3 慢病毒感染 取對數(shù)生長期的T24細胞,調整細胞濃度,以1.5×105個/孔的細胞密度接種于6孔板中,設置空白對照組(Blank,未感染組)、shRNA-NC組(感染shRNA-NC慢病毒)和shRNA-PRR11組(感染shRNA-PRR11慢病毒)。取shRNA-NC慢病毒和shRNA-PRR11慢病毒以感染復數(shù)為50分別感染T24細胞。感染8~12 h后更換新鮮培養(yǎng)基,感染48 h后采用含有0.1 mg/L嘌呤霉素培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定表達細胞株,并采用qRT-PCR和Western blot實驗驗證PRR11基因干擾效果。
1.3.4 qRT-PCR檢測 收集細胞沉淀,加入TRIzol試劑提取細胞總RNA,測定總RNA濃度及純度。按照PrimeScript? Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書步驟反轉錄合成cDNA,以cDNA為模板再按照SYBR? Premix Ex Taq? Kit說明書進行qRTPCR擴增檢測。引物序列:PRR11,上游引物:5’-GAAGCTGGCTAACATCCTG-3’,下游引物:5’-CTCTGGGTTATGCA GTTCTGG-3’;GAPDH上游引物:5’-ATGACCCCTTCATTGACCTCA-3’,下游引物:5’-GAGATGATGACCCTTTTGGCT-3’。反應條件:95℃預變性30 s;95℃變性20 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,共40個循環(huán)。以GAPDH為內參,采用2-ΔΔCt法計算PRR11 mRNA相對表達量。
1.3.5 CCK-8檢測細胞增殖活性 收集感染后的三組細胞,調整細胞濃度,以每孔3 000個細胞的密度接種于96孔板中,分別培養(yǎng)12、24、48、72 h后,每孔加入10 μl CCK-8溶液,在搖床上充分混勻,37℃孵育1 h,采用酶標儀檢測450 nm波長處各孔吸光度值(OD450)。
1.3.6 平板克隆形成實驗 收集感染后的三組細胞,制備成單細胞懸液,以每孔300個細胞接種于6孔板中,充分混勻,置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔2~3 d換液1次,培養(yǎng)2~3周。當出現(xiàn)肉眼可見的克隆時即終止培養(yǎng),棄培養(yǎng)液,加入4%多聚甲醛固定15 min,加入適量0.5%亞甲基藍染液30 min,肉眼計算克隆數(shù)。
1.3.7 流式細胞術檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期感染后各組細胞,調整細胞濃度,以每孔3×105個細胞的密度接種于6孔板中培養(yǎng)48 h,收集細胞沉淀及培養(yǎng)液,1 000 r/min離心5 min,預冷PBS重懸細胞,調整細胞濃度至2×105個/毫升,取1 ml細胞懸液,依次加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI,避光孵育15 min,上流式細胞儀檢測。
1.3.8 Western blot實驗 收集細胞沉淀,加入適量RIPA裂解液,冰上充分裂解30 min,12 000 r/min離心20 min,收集上清液,采用BCA法測定蛋白濃度。取25 μg蛋白加入上樣緩沖液中沸水浴變性,SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白,并濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,分別加入PRR11抗體(1:1 000)、Caspase3抗體(1:1 000)、Bcl-2抗體(1:1 000)、Bax抗體(1:1 000)和GAPDH抗體(1:1 000),4℃條件下孵育過夜。TBST洗滌3次,加入HRP標記的山羊抗兔或小鼠IgG二抗(1:10 000),室溫孵育1 h,TBST洗滌3次,滴加ECL化學發(fā)光液,顯影。以GAPDH為內參,采用Image J軟件分析條帶灰度值,并計算各目的蛋白的相對表達量。
應用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析,計量資料以()表示,計數(shù)資料用率(%)表示,多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),組間兩兩比較采用t檢驗,采用χ2檢驗分析PRR11表達水平與患者臨床病理特征之間的關系。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
免疫組織化學檢測結果顯示,PRR11蛋白在細胞質和細胞核中均有表達,見圖1。PRR11蛋白在膀胱尿路上皮癌組織中高表達率為71.93%(41/57),低表達率為28.07%(16/57),而在癌旁組織中高表達率為22.81%(13/57),低表達率為77.19%(44/57),差異有統(tǒng)計學意義(χ2=27.585,P=0.000)。與SV-HUC-1細胞比較,HTB-9、T24、J82和UM-UC-3細胞中PRR11 mRNA和蛋白相對表達量顯著降低(FmRNA=215.711,P=0.000;F蛋白=384.777,P=0.000),見圖2。其中T24細胞最為顯著,為此后續(xù)細胞實驗選擇T24細胞作為研究對象。
圖1 PRR11在膀胱尿路上皮癌組織及癌旁組織中的表達 (免疫組織化學 ×100)Figure 1 PRR11 expression in bladder urothelial carcinoma tumor tissues and adjacent tissues (IHC ×100)
圖2 各細胞中PRR11 mRNA(A)和蛋白(B)表達Figure 2 Expression of PRR11 mRNA(A) and protein(B) in each cell lines detected by qRT-PCR and Western blot
PRR11 高表達與膀胱尿路上皮癌患者年齡(χ2=0.057,P=0.812)、性別(χ2=0.957,P=0.328)、腫瘤直徑(χ2=0.768,P=0.381)、N分期(χ2=2.172,P=0.141)和M分期(χ2=0.537,P=0.464)均無顯著相關性,而與患者病理分級(χ2=12.055,P=0.001)和T分期(χ2=6.293,P=0.012)有顯著相關性,見表1。
表1 PRR11表達與膀胱尿路上皮癌患者臨床病理特征的關系Table 1 Correlation of PRR11 expression with clinicopathological features of patients with bladder urothelial carcinoma
與Blank組或shRNA-NC組比較,shRNAPRR11組細胞中PRR11 mRNA和蛋白相對表達量顯著降低,見圖3。
圖3 慢病毒感染后T24細胞中PRR11 mRNA和蛋白表達水平Figure 3 Expression levels of PRR11 mRNA (A) and protein (B) in T24 cells after lentivirus infection detected by qRT-PCR and Western blot
CCK-8檢測結果顯示,培養(yǎng)24、48、72 h后,各組細胞增殖活性存在顯著性差異(F=22.795,45.415,56.778,均P<0.05)。與Blank組或shRNANC組比較,shRNA-PRR11組細胞培養(yǎng)24、48、72 h后其細胞增殖活性顯著降低(均P<0.05),見表2。平板克隆形成實驗結果所示,Blank組、shRNA-NC組和shRNA-PRR11組細胞克隆形成數(shù)目分別(247.67±12.01)個、(234.33±16.56)個和(69.00±17.35)個。與Blank組或shRNA-NC組比較,shRNA-PRR11組細胞克隆形成數(shù)目顯著減少(t=14.128,13.074,均P=0.000),見圖4。
圖4 平板克隆實驗檢測各組T24細胞克隆形成能力 (亞甲基藍染色 ×10)Figure 4 T24 cell clonality of each group detected by plate cloning assays (methylene blue staining ×10)
表2 各組T24細胞增殖活性比較 (OD450,)Table 2 Comparison of T24 cell proliferation activity among three groups (OD450,)
表2 各組T24細胞增殖活性比較 (OD450,)Table 2 Comparison of T24 cell proliferation activity among three groups (OD450,)
Notes:a:P<0.05,compared with Blank group;b:P<0.05,compared with shRNA-NC group.
流式細胞術結果顯示,Blank組、shRNA-NC組和shRNA-PRR11組細胞凋亡率分別為(7.13±2.10)%、(8.00±1.35)%和(32.23±3.04)%。與Blank組或shRNA-NC組比較,shRNA-PRR11組細胞凋亡率顯著增加(t=13.546,13.081,均P=0.000),見圖5。與Blank組或shRNA-NC組比較,shRNA-PRR11組細胞Cleaved-caspase3和Bax蛋白表達水平顯著升高(均P<0.05),而Bcl-2蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),見圖6。
圖5 流式細胞術檢測各組T24細胞凋亡Figure 5 Apoptosis rate of each group T24 cells detected by flow cytometry
圖6 Western blot檢測各組T24細胞中Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表達Figure 6 Protein expression levels of Caspase-3,Bcl-2 and Bax of T24 cells detected by Western blot
PRR11蛋白含有2個脯氨酸富集區(qū)和1個鋅指結構域,其中鋅指結構域是一個典型的具有結合雙鏈DNA并調節(jié)基因轉錄的結構域,而脯氨酸富集區(qū)能夠與SH3結構域或WW結構域結合并介導參與細胞信號傳遞相關蛋白質與蛋白質之間的相互作用。目前已有大量研究證實[4-7],PRR11在多種惡性腫瘤組織中高表達,并與患者不良預后呈負相關,且體外實驗證實下調PRR11表達可抑制腫瘤細胞的惡性生物學行為,如細胞增殖、侵襲轉移等。然而,有關PRR11在膀胱癌中的表達及作用目前鮮有報道。本研究證實,PRR11在膀胱尿路上皮癌組織中高表達,并與患者腫瘤病理分級和T分期有顯著相關性,同時干擾PRR11表達可抑制膀胱癌T24細胞增殖并誘導細胞凋亡,因此PRR11可能在膀胱癌中發(fā)揮致癌基因的作用。
Cai等[11]研究顯示,PRR11在原發(fā)性前列腺癌組織中高表達,并且其高表達與患者腫瘤病理分期、淋巴轉移、短期生存率等顯著相關,提示PRR11可能與泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關。為此,本研究對57例膀胱尿路上皮癌組織及其癌旁組織中PRR11蛋白表達情況進行檢測,結果顯示PRR11在膀胱尿路上皮癌組織中高表達,推測其異常表達可能影響膀胱尿路上皮癌的進展。隨后本研究進一步分析PRR11高表達與患者臨床病理特征的關系,結果發(fā)現(xiàn)PRR11高表達與患者病理分級和T分期有顯著相關性。Lin等[12]通過分析來自癌癥基因組圖譜(TCGA)和基因表達大棚車(GEO)兩數(shù)據(jù)庫的四組膀胱癌RNA序列及臨床資料進行單變量Cox回歸分析并建立預后評估模型,預測PRR11是膀胱癌的風險基因,并且預測PRR11高表達患者預后較差。因此,提示PRR11可能在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中扮演致癌作用,其有可能成為分子靶向治療膀胱癌的潛在靶點。
雖然PRR11作為癌基因已被證實參與調控腫瘤細胞周期、增殖、侵襲轉移等眾多生物學行為[13-15],但其對膀胱癌細胞生物學功能的調控作用目前還未知。因此本研究首先分析PRR11在膀胱癌細胞株中的表達情況,結果顯示膀胱癌細胞株中PRR11 mRNA和蛋白表達水平顯著增高,該結果與膀胱癌組織水平結果一致,再次提示PRR11可能在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中扮演致癌作用。隨后本研究采用shRNA技術干擾膀胱癌T24細胞株中PRR11基因的表達,相關實驗結果顯示,干擾PRR11表達可顯著抑制T24細胞增殖活性以及克隆形成數(shù)。同時,干擾PRR11表達還可促進T24細胞凋亡,并上調促凋亡蛋白Cleaved-caspase-3和Bax表達水平,下調抗凋亡蛋白Bcl-2表達,說明干擾PRR11表達可抑制T24細胞增殖,并促進凋亡。細胞無限增殖及抗凋亡等是腫瘤細胞的重要惡性生物學行為特征,此外Huang等[16]研究也顯示,沉默PRR11基因表達可抑制非小細胞肺癌細胞增殖,并誘導細胞凋亡。由此可見,PRR11在膀胱癌組織中高表達可能是導致膀胱癌細胞無限增殖的原因之一,因而抑制PRR11表達可能是膀胱癌靶向治療的潛在靶點。
綜上所述,PRR11在膀胱尿路上皮癌組織中高表達,其高表達與患者病理分級和T分期有顯著相關性,并證實干擾PRR11表達可抑制膀胱癌細胞增殖及促進細胞凋亡,初步闡明PRR11在膀胱癌中的表達水平及其臨床意義,但PRR11對膀胱癌細胞增殖及凋亡調控的具體機制,及其在膀胱癌中更多的功能,還需要進一步研究。