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        PRR11在膀胱癌組織中的表達(dá)及其對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞增殖和凋亡的影響

        2021-06-08 08:09:44徐豪郝建偉束坤鵬張灝皇甫雪軍張?jiān)铺?/span>石紅林
        腫瘤防治研究 2021年5期
        關(guān)鍵詞:尿路膀胱癌孵育

        徐豪,郝建偉,束坤鵬,張灝,皇甫雪軍,張?jiān)铺?,石紅林

        0 引言

        膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤,也是世界第九大常見癌癥,具有易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)[1-2]。據(jù)研究調(diào)查[3]顯示,1990年至2017年我國膀胱癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢,其防治形勢不容樂觀。盡管膀胱癌的早期診斷及治療技術(shù)得到極大提高,但其死亡率并沒有得到明顯改善[3]。因此,尋找潛在分子治療靶點(diǎn),可能對(duì)膀胱癌的治療具有重要臨床意義。富含脯氨酸蛋白11(proline-rich protein 11,PRR11)是定位于染色體17q22區(qū)的腫瘤相關(guān)基因,參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)程、凋亡、侵襲等諸多生物學(xué)過程。已有研究顯示,PRR11在多種腫瘤組織中高表達(dá),例如食管鱗狀細(xì)胞癌[4]、宮頸癌[5]、膽囊癌[6]、乳腺癌[7]等,并且其高表達(dá)與患者不良預(yù)后相關(guān)。也有研究[8-9]報(bào)道稱,靶向沉默PRR11表達(dá)可抑制乳腺癌及結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。基于以上研究報(bào)道,提示PRR11可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演癌基因的作用。然而,PRR11在膀胱癌中的表達(dá)水平及臨床意義目前尚不明確。本研究旨在分析PRR11在膀胱尿路上皮癌中的表達(dá)及其臨床意義,并探討干擾PRR11的表達(dá)對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響,以期為膀胱癌的分子靶向治療提供理論基礎(chǔ)。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料

        選擇2017年2月—至2019年1月在河南省人民醫(yī)院泌尿外科行膀胱癌根治性切除術(shù)的57例膀胱癌患者癌組織標(biāo)本及其對(duì)應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本(距癌灶邊緣>5 cm),所有癌組織均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為膀胱尿路上皮癌,患者術(shù)前均未接受任何放療、化療及其他抗腫瘤治療。所有患者均簽署知情同意書,且本研究獲得河南省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

        1.2 細(xì)胞及主要試劑和儀器

        人永生化膀胱上皮細(xì)胞株SV-HUC-1以及人膀胱癌細(xì)胞株HTB-9、T24、J82和UM-UC-3均購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心;胎牛血清、F12K、RPMI 1640和DEME培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司;含有shRNA-PRR11重組質(zhì)粒及其陰性對(duì)照(shRNA-NC)質(zhì)粒的慢病毒(慢病毒滴度:2×108TU/ml)由上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司提供;TRIzol試劑盒購自美國Invitrogen公司;PrimeScript? Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit和SYBR?Premix Ex Taq? Kit購自寶生物工程(大連)有限公司;CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Giemsa染液、免疫組織化學(xué)SP法試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;兔抗人PRR11多克隆抗體購自英國Abcam公司;兔抗人Caspase3單克隆抗體、兔抗人Bax多克隆抗體、小鼠抗人Bcl-2多克隆抗體和兔抗人GAPDH單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司;辣酸根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔或小鼠IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司;ELx8000型酶標(biāo)儀購自美國Bio-Tek公司;C6流式細(xì)胞儀購自美國BD公司;實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器購自美國Applied Biosystems公司。

        1.3 方法

        1.3.1 免疫組織化學(xué)檢測 取石蠟包埋的膀胱癌及其癌旁組織,切片后脫蠟至水,3%H2O2處理10 min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶,0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液沸水浴處理進(jìn)行抗原修復(fù),滴加山羊血清封閉20 min,滴加PRR11抗體(1:50),4℃孵育過夜,PBS洗滌3次,滴加Bio-羊抗兔IgG二抗,室溫孵育1 h,PBS洗滌3次,滴加鏈霉親和素-POD工作液,室溫孵育30 min,PBS洗滌3次,滴加DAB顯色液,室溫孵育10 min,PBS洗滌3次以終止反應(yīng),蘇木精對(duì)比染色,梯度乙醇脫水干燥,二甲苯透明,中性樹脂封片,光學(xué)顯微鏡觀察。PRR11陽性染色以細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核呈棕黃色或棕褐色顆粒狀,根據(jù)視野內(nèi)細(xì)胞陽性細(xì)胞百分比和著色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分[10]。按照染色強(qiáng)度的深淺評(píng)分:無著色為0分、淡黃色1分、棕黃色2分,棕褐色3分;按照陽性細(xì)胞百分比評(píng)分:<5%為0分,5%~<25%為1分,25%~75%為2分,≥75%為3分。兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘為最終得分,評(píng)分≤4分為低表達(dá),評(píng)分>4分為高表達(dá)。

        1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮罐中取出凍存的SVHUC-1、HTB-9、T24、J82和UM-UC-3等細(xì)胞,其中SV-HUC-1細(xì)胞采用含有10%胎牛血清的F12K培養(yǎng)基培養(yǎng),HTB-9、T24和UM-UC-3細(xì)胞分別采用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng),而J82細(xì)胞采用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。復(fù)蘇后的各細(xì)胞置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔2~3 d傳代1次。

        1.3.3 慢病毒感染 取對(duì)數(shù)生長期的T24細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度,以1.5×105個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于6孔板中,設(shè)置空白對(duì)照組(Blank,未感染組)、shRNA-NC組(感染shRNA-NC慢病毒)和shRNA-PRR11組(感染shRNA-PRR11慢病毒)。取shRNA-NC慢病毒和shRNA-PRR11慢病毒以感染復(fù)數(shù)為50分別感染T24細(xì)胞。感染8~12 h后更換新鮮培養(yǎng)基,感染48 h后采用含有0.1 mg/L嘌呤霉素培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株,并采用qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PRR11基因干擾效果。

        1.3.4 qRT-PCR檢測 收集細(xì)胞沉淀,加入TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA,測定總RNA濃度及純度。按照PrimeScript? Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書步驟反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以cDNA為模板再按照SYBR? Premix Ex Taq? Kit說明書進(jìn)行qRTPCR擴(kuò)增檢測。引物序列:PRR11,上游引物:5’-GAAGCTGGCTAACATCCTG-3’,下游引物:5’-CTCTGGGTTATGCA GTTCTGG-3’;GAPDH上游引物:5’-ATGACCCCTTCATTGACCTCA-3’,下游引物:5’-GAGATGATGACCCTTTTGGCT-3’。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30 s;95℃變性20 s,60℃退火30 s,72℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計(jì)算PRR11 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

        1.3.5 CCK-8檢測細(xì)胞增殖活性 收集感染后的三組細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度,以每孔3 000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中,分別培養(yǎng)12、24、48、72 h后,每孔加入10 μl CCK-8溶液,在搖床上充分混勻,37℃孵育1 h,采用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處各孔吸光度值(OD450)。

        1.3.6 平板克隆形成實(shí)驗(yàn) 收集感染后的三組細(xì)胞,制備成單細(xì)胞懸液,以每孔300個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中,充分混勻,置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔2~3 d換液1次,培養(yǎng)2~3周。當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)即終止培養(yǎng),棄培養(yǎng)液,加入4%多聚甲醛固定15 min,加入適量0.5%亞甲基藍(lán)染液30 min,肉眼計(jì)算克隆數(shù)。

        1.3.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長期感染后各組細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度,以每孔3×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中培養(yǎng)48 h,收集細(xì)胞沉淀及培養(yǎng)液,1 000 r/min離心5 min,預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105個(gè)/毫升,取1 ml細(xì)胞懸液,依次加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI,避光孵育15 min,上流式細(xì)胞儀檢測。

        1.3.8 Western blot實(shí)驗(yàn) 收集細(xì)胞沉淀,加入適量RIPA裂解液,冰上充分裂解30 min,12 000 r/min離心20 min,收集上清液,采用BCA法測定蛋白濃度。取25 μg蛋白加入上樣緩沖液中沸水浴變性,SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白,并濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,分別加入PRR11抗體(1:1 000)、Caspase3抗體(1:1 000)、Bcl-2抗體(1:1 000)、Bax抗體(1:1 000)和GAPDH抗體(1:1 000),4℃條件下孵育過夜。TBST洗滌3次,加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔或小鼠IgG二抗(1:10 000),室溫孵育1 h,TBST洗滌3次,滴加ECL化學(xué)發(fā)光液,顯影。以GAPDH為內(nèi)參,采用Image J軟件分析條帶灰度值,并計(jì)算各目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料以()表示,計(jì)數(shù)資料用率(%)表示,多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),組間兩兩比較采用t檢驗(yàn),采用χ2檢驗(yàn)分析PRR11表達(dá)水平與患者臨床病理特征之間的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 PRR11在膀胱尿路上皮癌組織及膀胱癌細(xì)胞中的表達(dá)

        免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示,PRR11蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá),見圖1。PRR11蛋白在膀胱尿路上皮癌組織中高表達(dá)率為71.93%(41/57),低表達(dá)率為28.07%(16/57),而在癌旁組織中高表達(dá)率為22.81%(13/57),低表達(dá)率為77.19%(44/57),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=27.585,P=0.000)。與SV-HUC-1細(xì)胞比較,HTB-9、T24、J82和UM-UC-3細(xì)胞中PRR11 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低(FmRNA=215.711,P=0.000;F蛋白=384.777,P=0.000),見圖2。其中T24細(xì)胞最為顯著,為此后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)選擇T24細(xì)胞作為研究對(duì)象。

        圖1 PRR11在膀胱尿路上皮癌組織及癌旁組織中的表達(dá) (免疫組織化學(xué) ×100)Figure 1 PRR11 expression in bladder urothelial carcinoma tumor tissues and adjacent tissues (IHC ×100)

        圖2 各細(xì)胞中PRR11 mRNA(A)和蛋白(B)表達(dá)Figure 2 Expression of PRR11 mRNA(A) and protein(B) in each cell lines detected by qRT-PCR and Western blot

        2.2 PRR11表達(dá)水平與膀胱尿路上皮癌患者臨床病理特征的關(guān)系

        PRR11 高表達(dá)與膀胱尿路上皮癌患者年齡(χ2=0.057,P=0.812)、性別(χ2=0.957,P=0.328)、腫瘤直徑(χ2=0.768,P=0.381)、N分期(χ2=2.172,P=0.141)和M分期(χ2=0.537,P=0.464)均無顯著相關(guān)性,而與患者病理分級(jí)(χ2=12.055,P=0.001)和T分期(χ2=6.293,P=0.012)有顯著相關(guān)性,見表1。

        表1 PRR11表達(dá)與膀胱尿路上皮癌患者臨床病理特征的關(guān)系Table 1 Correlation of PRR11 expression with clinicopathological features of patients with bladder urothelial carcinoma

        2.3 干擾PRR11表達(dá)對(duì)T24細(xì)胞中PRR11表達(dá)水平的影響

        與Blank組或shRNA-NC組比較,shRNAPRR11組細(xì)胞中PRR11 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低,見圖3。

        圖3 慢病毒感染后T24細(xì)胞中PRR11 mRNA和蛋白表達(dá)水平Figure 3 Expression levels of PRR11 mRNA (A) and protein (B) in T24 cells after lentivirus infection detected by qRT-PCR and Western blot

        2.4 干擾PRR11表達(dá)對(duì)T24細(xì)胞增殖的影響

        CCK-8檢測結(jié)果顯示,培養(yǎng)24、48、72 h后,各組細(xì)胞增殖活性存在顯著性差異(F=22.795,45.415,56.778,均P<0.05)。與Blank組或shRNANC組比較,shRNA-PRR11組細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h后其細(xì)胞增殖活性顯著降低(均P<0.05),見表2。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示,Blank組、shRNA-NC組和shRNA-PRR11組細(xì)胞克隆形成數(shù)目分別(247.67±12.01)個(gè)、(234.33±16.56)個(gè)和(69.00±17.35)個(gè)。與Blank組或shRNA-NC組比較,shRNA-PRR11組細(xì)胞克隆形成數(shù)目顯著減少(t=14.128,13.074,均P=0.000),見圖4。

        圖4 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測各組T24細(xì)胞克隆形成能力 (亞甲基藍(lán)染色 ×10)Figure 4 T24 cell clonality of each group detected by plate cloning assays (methylene blue staining ×10)

        表2 各組T24細(xì)胞增殖活性比較 (OD450,)Table 2 Comparison of T24 cell proliferation activity among three groups (OD450,)

        表2 各組T24細(xì)胞增殖活性比較 (OD450,)Table 2 Comparison of T24 cell proliferation activity among three groups (OD450,)

        Notes:a:P<0.05,compared with Blank group;b:P<0.05,compared with shRNA-NC group.

        2.5 干擾PRR11表達(dá)對(duì)T24細(xì)胞凋亡的影響

        流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,Blank組、shRNA-NC組和shRNA-PRR11組細(xì)胞凋亡率分別為(7.13±2.10)%、(8.00±1.35)%和(32.23±3.04)%。與Blank組或shRNA-NC組比較,shRNA-PRR11組細(xì)胞凋亡率顯著增加(t=13.546,13.081,均P=0.000),見圖5。與Blank組或shRNA-NC組比較,shRNA-PRR11組細(xì)胞Cleaved-caspase3和Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05),而Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),見圖6。

        圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組T24細(xì)胞凋亡Figure 5 Apoptosis rate of each group T24 cells detected by flow cytometry

        圖6 Western blot檢測各組T24細(xì)胞中Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)Figure 6 Protein expression levels of Caspase-3,Bcl-2 and Bax of T24 cells detected by Western blot

        3 討論

        PRR11蛋白含有2個(gè)脯氨酸富集區(qū)和1個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域,其中鋅指結(jié)構(gòu)域是一個(gè)典型的具有結(jié)合雙鏈DNA并調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的結(jié)構(gòu)域,而脯氨酸富集區(qū)能夠與SH3結(jié)構(gòu)域或WW結(jié)構(gòu)域結(jié)合并介導(dǎo)參與細(xì)胞信號(hào)傳遞相關(guān)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。目前已有大量研究證實(shí)[4-7],PRR11在多種惡性腫瘤組織中高表達(dá),并與患者不良預(yù)后呈負(fù)相關(guān),且體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)下調(diào)PRR11表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為,如細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等。然而,有關(guān)PRR11在膀胱癌中的表達(dá)及作用目前鮮有報(bào)道。本研究證實(shí),PRR11在膀胱尿路上皮癌組織中高表達(dá),并與患者腫瘤病理分級(jí)和T分期有顯著相關(guān)性,同時(shí)干擾PRR11表達(dá)可抑制膀胱癌T24細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,因此PRR11可能在膀胱癌中發(fā)揮致癌基因的作用。

        Cai等[11]研究顯示,PRR11在原發(fā)性前列腺癌組織中高表達(dá),并且其高表達(dá)與患者腫瘤病理分期、淋巴轉(zhuǎn)移、短期生存率等顯著相關(guān),提示PRR11可能與泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。為此,本研究對(duì)57例膀胱尿路上皮癌組織及其癌旁組織中PRR11蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示PRR11在膀胱尿路上皮癌組織中高表達(dá),推測其異常表達(dá)可能影響膀胱尿路上皮癌的進(jìn)展。隨后本研究進(jìn)一步分析PRR11高表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PRR11高表達(dá)與患者病理分級(jí)和T分期有顯著相關(guān)性。Lin等[12]通過分析來自癌癥基因組圖譜(TCGA)和基因表達(dá)大棚車(GEO)兩數(shù)據(jù)庫的四組膀胱癌RNA序列及臨床資料進(jìn)行單變量Cox回歸分析并建立預(yù)后評(píng)估模型,預(yù)測PRR11是膀胱癌的風(fēng)險(xiǎn)基因,并且預(yù)測PRR11高表達(dá)患者預(yù)后較差。因此,提示PRR11可能在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中扮演致癌作用,其有可能成為分子靶向治療膀胱癌的潛在靶點(diǎn)。

        雖然PRR11作為癌基因已被證實(shí)參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期、增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等眾多生物學(xué)行為[13-15],但其對(duì)膀胱癌細(xì)胞生物學(xué)功能的調(diào)控作用目前還未知。因此本研究首先分析PRR11在膀胱癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況,結(jié)果顯示膀胱癌細(xì)胞株中PRR11 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著增高,該結(jié)果與膀胱癌組織水平結(jié)果一致,再次提示PRR11可能在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中扮演致癌作用。隨后本研究采用shRNA技術(shù)干擾膀胱癌T24細(xì)胞株中PRR11基因的表達(dá),相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,干擾PRR11表達(dá)可顯著抑制T24細(xì)胞增殖活性以及克隆形成數(shù)。同時(shí),干擾PRR11表達(dá)還可促進(jìn)T24細(xì)胞凋亡,并上調(diào)促凋亡蛋白Cleaved-caspase-3和Bax表達(dá)水平,下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá),說明干擾PRR11表達(dá)可抑制T24細(xì)胞增殖,并促進(jìn)凋亡。細(xì)胞無限增殖及抗凋亡等是腫瘤細(xì)胞的重要惡性生物學(xué)行為特征,此外Huang等[16]研究也顯示,沉默PRR11基因表達(dá)可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。由此可見,PRR11在膀胱癌組織中高表達(dá)可能是導(dǎo)致膀胱癌細(xì)胞無限增殖的原因之一,因而抑制PRR11表達(dá)可能是膀胱癌靶向治療的潛在靶點(diǎn)。

        綜上所述,PRR11在膀胱尿路上皮癌組織中高表達(dá),其高表達(dá)與患者病理分級(jí)和T分期有顯著相關(guān)性,并證實(shí)干擾PRR11表達(dá)可抑制膀胱癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡,初步闡明PRR11在膀胱癌中的表達(dá)水平及其臨床意義,但PRR11對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖及凋亡調(diào)控的具體機(jī)制,及其在膀胱癌中更多的功能,還需要進(jìn)一步研究。

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