高雅媚，王斌，李中信，賈漪濤

0 引言

免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors,ICIs）是繼手術(shù)、化療和放療之后腫瘤治療的一個新手段，已被批準用于治療黑色素瘤、肺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、頭頸部鱗狀細胞癌等[1]。盡管近年來ICIs在臨床應(yīng)用中取得了突破性進展，但多數(shù)患者并不能從ICIs單藥治療中獲益[1-2]。ICIs對各類腫瘤患者的總有效率僅20%～30%[3]。因此，臨床上迫切需要尋找提高ICIs療效的方法。色氨酸（tryptophan,Trp）是人體必需氨基酸，除了參與蛋白質(zhì)的合成，還是許多微生物和宿主代謝物的合成前體，同時也是免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用的重要能量來源[4]。色氨酸代謝紊亂可導(dǎo)致免疫細胞的凋亡及功能障礙，有利于形成免疫抑制微環(huán)境，進而影響ICIs的療效[5]。此外，色氨酸代謝有三條途徑，其中最主要的是犬尿氨酸（kynurenine,kyn）途徑，95%以上的Trp經(jīng)由此通路進行代謝；剩余兩條途徑分別是5-羥色胺（5-hydroxytryptamine,5-HT）途徑及吲哚途徑[4-5]。近年來，靶向抑制Trp代謝以提高ICIs療效的研究主要集中于kyn途徑，并且已經(jīng)進入臨床試驗階段，而另外兩條代謝途徑即5-HT和吲哚途徑也正在成為研究的熱點。本文就這一領(lǐng)域的最新進展進行綜述。

1 Trp代謝

Trp代謝主要有三條通路：（1）犬尿氨酸通路：Trp首先被吲哚胺2,3雙加氧酶（indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO）和色氨酸2,3雙加氧酶（tryptophan-2,3-diocygenase,TDO）分解代謝成N-甲?；虬彼?，然后被芳犬尿氨酸甲酰胺酶（arylformamidase,AFMID）轉(zhuǎn)化為kyn，kyn再通過犬尿氨酸單加氧酶（kynurenine 3-monooxygenase,KMO）、犬尿氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（kynurenine amino transferases,KATs）及犬尿氨酸酶轉(zhuǎn)化為3-羥基犬尿酸（3-hydroxykynurenine,3-HK）、犬尿喹啉酸（kynurenic acid,KA）、3-羥基鄰氨基苯甲酸（3-hydroxyanthranilic acid,3-HAA）、喹啉酸（quinolinic acid,QA）、吡啶甲酸（picolinic acid,PA）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）以及鄰氨基苯甲酸（anthranilic acid,AA）等代謝產(chǎn)物[5-7]；（2）5-HT通路：1%～2%的Trp在色氨酸羥化酶（tryptophan hydroxylase,TPH）的催化下轉(zhuǎn)化為5-羥色胺酸（5-hydroxytryptophan,5-HTP），再經(jīng)脫羧酶脫羧生成5-HT[5]。其中，TPH有兩種同工酶，即TPH1和TPH2。TPH1主要在腸嗜鉻細胞中表達，TPH2主要表達于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和腸神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)細胞。因此，外周5-HT是由TPH1催化形成的[8]。研究發(fā)現(xiàn)，腸道中的微生物可以代謝Trp并促進5-HT生成，如乳桿菌屬和雙歧桿菌屬可以將Trp直接轉(zhuǎn)化為5-HT；干酪乳桿菌-327可以通過增加TPH1表達間接促進5-HT合成[9]；（3）經(jīng)上述兩條通路代謝之后，剩余的Trp被腸道微生物分解代謝為吲哚類衍生物，如梭狀芽孢桿菌將Trp轉(zhuǎn)化為色胺、吲哚乳酸（indole-3-lactic acid,ILA）和吲哚丙酸（indole-3-propionic Acid,IPA）；乳酸桿菌屬將Trp轉(zhuǎn)化為吲哚醛（indole-3-aldehyde,IAld）和ILA；消化鏈球菌屬則可將Trp代謝為吲哚丙烯酸（indole acrylic acid,IA）和IPA；擬桿菌屬和梭菌可以將Trp轉(zhuǎn)化為ILA和吲哚乙酸（indoleacetic acid,IAA），雙歧桿菌屬可將Trp代謝為ILA等[5,7]。

2 Trp代謝影響腫瘤免疫微環(huán)境

腫瘤免疫微環(huán)境主要包括多種腫瘤浸潤性免疫細胞如T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺傷（natural killer,NK）細胞、骨髓來源的抑制性細胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）及多種細胞因子如轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）、白細胞介素-10（IL-10）、IL-17等，并受到缺氧和pH值等多種因素的影響。Trp代謝過程中的某些關(guān)鍵酶與產(chǎn)物可以參與免疫調(diào)節(jié)，進而影響腫瘤免疫微環(huán)境，也是近年來研究的重點。

2.1 參與色氨酸代謝的關(guān)鍵酶

2.1.1 IDO IDO有兩種同工酶——IDO1和IDO2，其過表達與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。IDO1可以加速腫瘤微環(huán)境中的Trp代謝，大量招募并激活MDSCs[10]。并且，隨著腫瘤微環(huán)境中的Trp被耗竭，T淋巴細胞、NK細胞等因能量缺乏而發(fā)生凋亡；同時，轉(zhuǎn)運Trp的tRNAs處于游離狀態(tài)，游離的tRNAs通過應(yīng)激激酶2（general control non-derepressible-2,GCN2）通路直接激活調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory cells,Tregs），并抑制效應(yīng)T淋巴細胞的增殖及抗原提呈細胞的功能[11-12]。因此，IDO1過表達可導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境處于嚴重的免疫抑制狀態(tài)。

研究發(fā)現(xiàn)，IDO2 對Trp 的親和力遠低于IDO1，且只在不足1%的腫瘤中表達[13]。其高表達可提高Tregs細胞的免疫抑制功能，激活B淋巴細胞并產(chǎn)生自身抗體，參與腫瘤免疫微環(huán)境的形成[14]。由于IDO2在免疫耐受中的作用機制尚未闡明，因此其對腫瘤免疫微環(huán)境的抑制作用還有待進一步探究。

2.1.2 TDO 雖然TDO與IDO1均可分解代謝Trp，但兩者之間也存在不同：（1）IDO1是單體酶，可耗竭局部微環(huán)境中的Trp；而TDO是一種血紅素四聚體蛋白，負責(zé)維持血液Trp的穩(wěn)態(tài)[13]；（2）生理狀態(tài)下，IDO1存在于大多數(shù)非肝臟組織，TDO則主要在肝臟中表達[15]；（3）IDO1受炎性細胞因子如干擾素-γ（interferon-γ,IFN-γ）、IL-6的調(diào)節(jié)，TDO的表達水平則受Trp、膽固醇以及脂質(zhì)代謝產(chǎn)物如前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2）等的調(diào)節(jié)[16]。

TDO可在多種腫瘤中表達，其過表達不僅會導(dǎo)致Trp減少，抑制效應(yīng)T淋巴細胞及NK細胞的增殖并促進其凋亡，還會誘導(dǎo)CD4+T淋巴細胞及樹突狀細胞分別向Tregs細胞及耐受性表型方向分化；此外TDO還可促進CD4+T淋巴細胞分泌IL-10、IL-17等細胞因子[17]。因此，TDO過表達與腫瘤免疫抑制微環(huán)境的形成密不可分。

2.1.3 犬尿氨酸酶 近年來，人們一直致力于研究通過抑制Trp分解代謝的第一步限速酶IDO和TDO進而阻止Trp耗竭及代謝產(chǎn)物kyn生成以達到治療腫瘤的目的，而對以kyn為底物的酶研究較少。

有研究顯示，在以kyn 為底物的三種酶（KMO、KAT、犬尿氨酸酶）中，只有犬尿氨酸酶具有生物化學(xué)和藥理學(xué)特性，可以作為體內(nèi)給藥的候選藥物。犬尿氨酸酶可以分解代謝kyn，減輕其對免疫細胞的抑制作用，而KMO、KAT主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達[18]。目前關(guān)于KMO、KAT在腫瘤方面作用的研究鮮有報道，因此犬尿氨酸酶對改善腫瘤免疫抑制微環(huán)境具有重要作用。

2.1.4 其他 目前，尚不清楚5-HT通路中的代謝酶TPH1、TPH2以及脫羧酶在腫瘤中的表達情況及其意義。資料表明，TPH1可在耐受型肥大細胞中高表達，并且與野生型小鼠相比，TPH1基因敲除小鼠的移植瘤生長緩慢[19]。理論上，TPH分解代謝Trp可導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中Trp減少，對維持腫瘤免疫抑制性微環(huán)境有一定促進作用。

2.2 色氨酸代謝產(chǎn)物

2.2.1 kyn通路中的代謝產(chǎn)物 芳香烴受體（aryl hydrocarbon receptor,AhR）是配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，與配體結(jié)合后進入細胞核，再與其他轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。kyn通路中的代謝產(chǎn)物kyn及其下游代謝產(chǎn)物KA是AhR的內(nèi)源性激動劑，它們通過與AhR結(jié)合不僅可以促進炎性細胞因子IFN-γ、IL-6和脂質(zhì)代謝產(chǎn)物PGE2的產(chǎn)生；更重要的是，還可以增強IDO1和TDO2的活性，介導(dǎo)腫瘤微環(huán)境的免疫抑制作用[16]。同時，kyn還可通過激活A(yù)hR促進Tregs、免疫耐受性樹突狀細胞的增殖，從而抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)[20]。因此，kyn可以明顯抑制腫瘤免疫微環(huán)境。另有研究證實，3-HK、3-HAA、QA和PA對免疫功能也具有調(diào)節(jié)作用，3-HK和3-HAA通過凋亡機制抑制T細胞增殖，QA和PA可以激活免疫細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)信號[21]。此外，代謝產(chǎn)物NAD+作為一種可提升DNA損傷修復(fù)能力的輔酶，對T細胞功能的維持也具有至關(guān)重要的作用[22]。

因此，盡管kyn通路中的部分Trp代謝產(chǎn)物對腫瘤免疫微環(huán)境的形成既有抑制作用又有促進效果，但它們均是kyn分解代謝后的產(chǎn)物，而kyn對腫瘤免疫微環(huán)境產(chǎn)生了明顯的抑制作用。因此，抑制kyn的形成仍然是近年來抗腫瘤藥物研究的重點。

2.2.2 5-HT 5-HT是一種生物源性單胺類物質(zhì)，通過作用于細胞表面的5-HT受體發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。近年來研究表明，5-HT及其受體途徑與腫瘤關(guān)系密切，該途徑在腫瘤中的作用主要表現(xiàn)在：（1）既可以促進腫瘤細胞的增殖、侵襲，誘導(dǎo)血管形成，還可以抑制腫瘤細胞增殖、收縮腫瘤血管[23]；（2）既可以促進炎性環(huán)境中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、IL-1β、IL-6和INF-γ的釋放，還可以抑制TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生[24-25]；（3）既可以介導(dǎo)中性粒細胞募集、T淋巴細胞的增殖與活化以及增強NK細胞的功能，還可以誘導(dǎo)T淋巴細胞向免疫抑制型細胞分化[24,26]。因此，5-HT對腫瘤免疫微環(huán)境的影響還有待進一步研究。

2.2.3 吲哚類物質(zhì) Trp在腸道微生物的作用下可產(chǎn)生許多吲哚類衍生物，部分吲哚類衍生物可通過作用于腸道免疫細胞中的AhR從而影響免疫調(diào)節(jié)，如IAld可誘導(dǎo)NK細胞分泌IL-22[7,27]；IA可增強被脂多糖刺激后的巨噬細胞產(chǎn)生IL-10的能力，減少健康者外周血單核細胞的IL-6和IL-1β的分泌量[28]；色胺可誘導(dǎo)腸嗜鉻細胞合成并釋放5-HT[7]。此外，某些吲哚類衍生物還可以被腸上皮細胞吸收并進入血液循環(huán)，其中IPA和IA具有抗氧化和抗炎作用[7]。

由此可見，靶向抑制色氨酸代謝的某些環(huán)節(jié)或途徑有望重塑腫瘤免疫微環(huán)境，不僅可能改善腫瘤內(nèi)的免疫狀態(tài)，還可能提高免疫檢查點抑制劑的療效，這已成為近年來的研究熱點。

3 抑制Trp代謝以提高ICIs療效的研究

ICIs主要包括抗程序性死亡受體1（programmed cell death-1,PD-1）抑制劑、抗程序性死亡配體1（programmed cell death-Ligand 1,PD-L1）抑制劑、細胞毒性T淋巴細胞抗原-4（cytotoxic T lymphocyte antigen-4,CTLA-4）抑制劑。目前，靶向Trp代謝以提高ICIs療效的研究主要集中在IDO、TDO及犬尿氨酸酶，并已經(jīng)在黑色素瘤、肺癌、肝癌、結(jié)直腸癌的治療中取得了一些重要進展，顯示出較好的應(yīng)用前景，見表1。

表1 Trp代謝在腫瘤ICIs治療中的應(yīng)用Table 1 Application of tryptophan metabolism in treatment of tumor immune checkpoint inhibitors

3.1 黑色素瘤

PD-1抑制劑納武單抗（nivolumab）和派姆單抗（pembrolizumab）以及CTLA-4抑制劑伊匹單抗（ipilimumab）已成為治療晚期黑色素瘤的一線用藥，但PD-1抑制劑以及CTLA-4抑制劑治療黑色素瘤的有效率分別為33%～40%和10%[28]。研究證實，黑色素瘤患者在使用PD-1抑制劑后，可加速體內(nèi)Trp分解代謝為kyn，而血清kyn/Trp比值的增加與患者的總生存期呈負相關(guān)[29]。此外，在納入了706例晚期黑色素瘤患者的Ⅲ期臨床雙盲隨機對照試驗（ECHO-301）中，IDO1抑制劑epacadostat聯(lián)合派姆單抗因不能延長患者的無進展生存期或總生存期，并產(chǎn)生了較重的不良反應(yīng)而提前終止[30]。目前，IDO抑制劑indoximod聯(lián)合PD-1抑制劑或CTLA-4抑制劑治療晚期黑色素瘤的研究正處于Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗階段。最新的一項研究發(fā)現(xiàn)，黑色素瘤各亞型之間的IDO表達量不盡相同，肢端型和黏膜型黑色素瘤中IDO表達量低于皮膚黑色素瘤[31]。因此，在不同亞型黑色素瘤患者中，應(yīng)根據(jù)IDO表達水平來探討ICIs與IDO抑制劑的精準聯(lián)合。

臨床資料顯示，TDO在葡萄膜黑色素瘤的腫瘤細胞及其肝轉(zhuǎn)移組織中的表達量相對較高，提示TDO過表達可能是免疫治療耐藥的機制之一[32]。聚乙二醇化犬尿氨酸酶（PEGylated kynureninase,PEG-KYNase）是經(jīng)過人工優(yōu)化的犬尿氨酸酶，可顯著抑制小鼠黑色素瘤的生長。而且與單用PD-1抑制劑相比，PEG-KYNase與PD-1抑制劑聯(lián)合治療可提高應(yīng)答率35%。小鼠獲得了長期的腫瘤排斥反應(yīng)能力[18]。因此，TDO抑制劑及PEG-KYNase與ICIs聯(lián)合應(yīng)用治療黑色素瘤具有潛在的臨床應(yīng)用價值。

3.2 肺癌

雖然ICIs在肺癌治療中取得了一定療效，但仍面臨耐藥等許多挑戰(zhàn)。小細胞肺癌患者的血清中kyn濃度和IDO活性均顯著高于健康人群。此外，IDO在人非小細胞肺癌細胞中也呈高表達，血漿中的IDO水平還可反映非小細胞肺癌患者接受納武單抗治療后的臨床獲益程度[33]。與野生型小鼠相比，IDO2基因敲除的小鼠肺癌移植瘤生長更為緩慢，并同時伴隨著腫瘤微環(huán)境中Trp增多、kyn減少以及腫瘤組織中IFN-γ含量的升高[34]。目前，IDO1抑制劑epacadostat聯(lián)合派姆單抗，以及IDO1抑制劑BMS-986205聯(lián)合納武單抗治療肺癌的研究正處于Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗階段，結(jié)果值得關(guān)注。

TDO在肺癌相關(guān)成纖維細胞中過表達，并且TDO抑制劑能顯著改善樹突狀細胞及T細胞的免疫功能，抑制肺癌移植瘤的生長和轉(zhuǎn)移[35]。研究顯示，與IDO1抑制劑相比，IDO/TDO雙靶點抑制劑不僅能促進T細胞的增殖，還可以明顯抑制肺癌移植瘤的生長，降低kyn/Trp的比值[36]。因此，TDO抑制劑、IDO/TDO雙靶點抑制劑在肺癌的治療中具有重要意義，其與ICIs的聯(lián)合應(yīng)用可能為肺癌患者提供一個新的治療手段。

3.3 肝癌

長期以來，細胞毒性藥物甚至靶向藥物在肝癌中的療效都不令人滿意。研究發(fā)現(xiàn)，IDO1、TDO、AhR的表達與肝癌患者的總體生存率均呈負相關(guān)[37]。目前，IDO或TDO抑制劑在肝癌治療中的研究甚少。研究顯示，在肝癌荷瘤小鼠中，IDO抑制劑可通過升高IL-12、IFN-γ水平，增加腫瘤浸潤性T細胞和中性粒細胞的數(shù)量而抑制腫瘤生長[38]。Brown等發(fā)現(xiàn)IDO抑制劑聯(lián)合CTLA-4抑制劑或PD-1抑制劑與任一單藥治療組（IDO抑制劑、CTLA-4抑制劑或PD-1抑制劑）相比，均能夠更明顯地抑制肝癌移植瘤生長[39]。另外，含有小分子TDO抑制劑的配合物可以增強T細胞免疫功能，并通過線粒體依賴性凋亡途徑促進肝癌細胞的死亡，具有顯著的抗腫瘤活性[40]。研究證實，與IDO抑制劑相比，IDO/TDO雙靶點抑制劑對肝癌移植瘤的抑制作用更為明顯，可以升高小鼠血清中Trp水平，減少kyn水平，使kyn/Trp的比值顯著降低[36]。因此，IDO、TDO抑制劑及IDO/TDO雙靶點抑制劑可抑制肝癌移植瘤的生長，其與ICIs的聯(lián)合應(yīng)用具有重要的臨床應(yīng)用前景。

3.4 結(jié)直腸癌

迄今，PD-1抑制劑僅被推薦用于治療高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定性或錯配修復(fù)基因缺失的晚期結(jié)直腸癌患者，即使在這部分人群中，有效率也只有30%[41]。Venkateswaran等發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織中的kyn水平高于正常結(jié)腸組織，并與IDO1、TDO和AFMID的過表達呈正相關(guān)[7]。但也有研究表明，kyn通路中的終末代謝產(chǎn)物8-羥基喹啉酸（8-Hydroxyquinoline Acid）可以阻礙結(jié)腸癌細胞的線粒體活性及DNA合成并抑制結(jié)腸癌細胞HT-29和LS-180的增殖和遷移[42]。因此，IDO、TDO抑制劑在結(jié)直腸癌的療效有待進一步證實。

動物實驗證實，相較于單用IDO1抑制劑，IDO1/TDO雙靶點抑制劑在較大劑量（80 mg/kg）下對結(jié)直腸癌移植瘤具有更強的抗腫瘤效果[43]。另有研究表明，與TDO抑制劑或PD-1抑制劑單藥相比，TDO抑制劑聯(lián)合PD-1抑制劑明顯抑制了結(jié)直腸癌移植瘤的生長；此外，PEG-KYNase和PD-1抑制劑聯(lián)合治療的小鼠腫瘤體積明顯小于對照組及單藥治療組，且PEG-KYNase比IDO1抑制劑更能提高PD-1抑制劑的療效[18]。因此，TDO抑制劑和PEG-KYNase與免疫檢查點抑制劑聯(lián)合應(yīng)用具有廣闊的臨床應(yīng)用價值。目前，IDO1抑制劑epacadostat與派姆單抗用于高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定性結(jié)直腸癌的研究正處于Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗招募階段。

4 問題與展望

Trp代謝參與形成腫瘤免疫抑制微環(huán)境，與ICIs的療效密不可分。理論上，抑制Trp代謝的關(guān)鍵酶IDO、TDO以及犬尿氨酸酶可以提高ICIs的療效，具有重要的潛在臨床應(yīng)用價值。但這一策略仍面臨許多挑戰(zhàn)：（1）目前許多抑制Trp代謝的IDO、TDO抑制劑仍處于研發(fā)階段，一些臨床前研究并未取得預(yù)期治療效果甚至還產(chǎn)生了比較嚴重的不良反應(yīng)；（2）完全阻斷Trp代謝可能會產(chǎn)生一系列的不良反應(yīng)，包括Trp濃度顯著升高、kyn下游代謝產(chǎn)物包括起神經(jīng)保護作用及對腫瘤生長具有抑制作用的化合物減少，這反過來可能會促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展；（3）目前提高ICIs的療效研究集中于kyn通路，對其他兩條通路的研究甚少；（4）尚未對Trp代謝與其他代謝如氨基酸代謝糖代謝或脂代謝途徑進行橫向比較，以尋找更為合適的靶向代謝途徑。因此，研發(fā)更加有效的lDO抑制劑、探索IDO/TDO雙靶點阻斷方法，研究靶向Trp代謝的另外兩條途徑等將是未來的研究方向。