田巧基，夏 凱，劉義鳳，潘 聰，李海枝，段盛林

（中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司 北京100015）

人類對甜味的喜愛是由遺傳基因決定的，然而甜味為人類帶來愉悅感的同時也帶來了諸多健康問題，例如：肥胖、齲齒、胰島素抵抗（IR），甚至Ⅱ型糖尿病等[1-2]。針對膳食結(jié)構(gòu)中碳水化合物過量，尤其是單糖攝入超標(biāo)的不良現(xiàn)狀，設(shè)計開發(fā)功能糖，減少單糖的攝入顯得尤為重要[3]。

NCI-H716 是1 株人結(jié)直腸腺癌細胞，常作為研究GLP-1 分泌及其信號通路的人源腸內(nèi)分泌L細胞模型，該細胞可表達G 蛋白偶聯(lián)甜味受體、Gα-味蛋白（Gα-gustducin）和TRPM5 等味覺受體及其下游信號元件[4]。小腸內(nèi)分泌L 細胞分泌的腸源性激素包括血糖素樣肽-1（GLP-1）、血糖素樣肽-2（GLP-2）和酪酪肽（PYY）。其中，GLP-1 的作用是刺激胰島素分泌，抑制胰高血糖素分泌，延緩胃排空并充當(dāng)腸胃道和回腸“制動機制”的一部分，被稱為食欲和攝食的“生理調(diào)節(jié)器”[5]。GLP-2的作用是刺激腸黏膜生長，抑制腸隱窩細胞凋亡，抑制胃排空和胃酸分泌[6-7]。PYY 的作用是增強飽腹感，抑制食欲[8]。

實驗室前期試驗表明，人源化酵母模型證明海藻糖、異麥芽酮糖醇、棉籽糖等功能糖通過去糖基化作用回補由糖基化損傷造成的酵母菌生長抑制的現(xiàn)象。人體血糖生成指數(shù)（GI）測試結(jié)果表明，富含多元功能糖的特膳米屬于低GI 食品，適合作為糖尿病人的主食選擇[9]。雖然功能糖的生理功能得到肯定，但是其作用機理還未被闡明。本研究以NCI-H716 細胞構(gòu)建的腸內(nèi)分泌細胞為模型，評價山梨糖醇、赤蘚糖醇、海藻糖、異麥芽酮糖醇、木糖醇和L-阿拉伯糖等功能糖對腸源性激素的促分泌作用，初步闡明功能糖改善人體糖、脂代謝的機理，繼續(xù)探究功能糖促GLP-1 分泌的機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人結(jié)直腸腺癌細胞NCI-H716，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所；RPMI1640 培養(yǎng)基、高糖DMEM 培養(yǎng)基、平衡鹽緩沖液（Hank's balanced salt solution，HBSS）、KRB 緩沖溶液（含10 mmol/L 葡萄糖），中科邁晨科技有限公司；胎牛牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS），美國Gibco 公司；山梨糖醇、赤蘚糖醇、海藻糖、異麥芽酮糖醇、木糖醇、L-阿拉伯糖，上海士鋒生物科技有限公司；牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA），北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；DPP-Ⅳ抑制劑，美國Med-ChemExpress 公司；鈣離子熒光探針Fluo-3AM，美國Sigma 公司；CCK-8 試劑盒（Cell counting Kit-8）、二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）、RIPA裂解液、苯甲基磺酰氟（Phenyl methane sulfonyl fluoride，PMSF）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)研究所；基質(zhì)膠、美國BD 公司；RNA 提取試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司；GLP-1、GLP-2、PYY 試劑盒（ELISA），艾恩斯生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

倒置生物顯微鏡，日本OLympus 公司；生物安全柜，濟南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；CO2培養(yǎng)箱，日本松下公司；Spectra Max i3 酶標(biāo)儀，美國MD 公司；分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；超聲波清洗儀，昆山超聲儀器有限公司KQ-250DE；pH 計，上海雷磁儀器廠；實時熒光定量PCR 儀，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；洗板機，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；手持式細胞計數(shù)器，密理博中國有限公司。

1.3 方法

1.3.1 NCI-H716 細胞的培養(yǎng) 人結(jié)直腸腺癌細胞NCI-H716 在含有20% FBS、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的RPMI1640 培養(yǎng)基中，于37℃，5% CO2以及90%相對濕度的培養(yǎng)箱中懸浮生長。當(dāng)細胞生長至1.0×107 個/mL，將培養(yǎng)液移至15 mL 離心管，2 000 r/min 室溫離心5 min。離心完畢后，棄掉上清并取1 mL 的完全培養(yǎng)基吹打細胞，將細胞均勻的分成3 份，每個T75 培養(yǎng)瓶加20 mL 完全培養(yǎng)基。

1.3.2 NCI-H716 細胞內(nèi)分泌模型的建立NCIH716 細胞以3×105 個/mL 的密度接種于包被有基質(zhì)膠的12 孔板中，培養(yǎng)2 d，進行內(nèi)分泌分化試驗。內(nèi)分泌分化所用培養(yǎng)基為含有20% FBS、1%雙抗的高糖DMEM 培養(yǎng)基，分化2 d 后，培養(yǎng)基用含有0.2% BSA 的KRB 緩沖溶液代替培養(yǎng)2 h。向上清中加入50 μg/mL 的苯甲基磺酰氟和10 μg/mL 的DPP-Ⅳ抑制劑，使用ELISA 試劑盒檢測GLP-1 含量。

1.3.3 CCK-8 法測定NCI-H716 細胞存活率 取96 孔培養(yǎng)板，每孔加100 μL 細胞懸液，細胞密度為3×105個/mL，37℃培養(yǎng)24 h 后每孔加入0.5，1，2 mg/mL 3 個不同質(zhì)量濃度的功能糖，以無功能糖的相同培養(yǎng)基孵育細胞為對照組，培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μL CCK-8 溶液于37℃避光孵育2 h。用酶標(biāo)儀在波長450 nm 處測定吸光度值。以對照組細胞存活率為100%計算其余組別細胞存活率。

1.3.4 功能糖對GLP-1、GLP-2、PYY 分泌的影響試驗方法同1.3.3 節(jié)，分化后分別設(shè)對照組、樣品組（赤蘚糖醇、海藻糖、山梨糖醇質(zhì)量濃度為0.5，1，2 mg/mL）。

1.3.5 功能糖對NCI-H716 細 胞T1R2、T1R3、Gα-gustducin、PLCβ2、TRPM5 mRNA 表達量的影響NCI-H716 細胞以3×105個/mL 的密度接種于包被有基質(zhì)膠的6 孔板，分化后分別設(shè)對照組、樣品組（赤蘚糖醇、海藻糖、山梨糖醇質(zhì)量濃度為0.5，1，2 mg/mL），培養(yǎng)2 h 后，按照全式金試劑盒說明書提取細胞總RNA，用RNA/DNA 超微量測定儀對RNA 進行定量，測定RNA 純度及濃度。qPCR 反應(yīng)條件為45℃-5 min；94℃-30 s，94℃-5 s，65℃-1 min，循環(huán)40 次；PCR 擴增完畢后，進行半定量分析。引物序列及產(chǎn)物大小見表1。

表1 試驗用目標(biāo)基因特異性引物序列Tab1e 1 Sequences of primers for target genes of amplified fragment

采用2-△△Ct計算基因表達的相對量，具體如下：

△Ct（待測樣本）=Ct（目的基因，待測樣本）-Ct（內(nèi)參基因，待測樣本）

△Ct（對照樣本）=Ct（目的基因，對照樣本）-Ct（內(nèi)參基因，對照樣本）

△△Ct=△Ct（待測樣本）-△Ct（對照樣本）

相對表達量=2-△△Ct

1.3.6 功能糖對NCI-H716 細胞內(nèi)Ca2+含量的影響NCI-H716 細胞以3×105 個/mL 的密度接種于包被有基質(zhì)膠的黑色96 孔板，培養(yǎng)2 d。按試驗需求給予不同因素處理分為對照組、樣品組（赤蘚糖醇、海藻糖、山梨糖醇質(zhì)量濃度為0.5，1，2 mg/mL）。棄掉細胞培養(yǎng)液后，用HBSS 清洗2 次，每孔加入100 μL 熒光探針Fluo-3MA（5 μmol/L），37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min 進行探針裝載。HBSS洗滌后在37℃下避光孵育30 min，用酶標(biāo)儀檢測激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長525 nm 處的熒光值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Origin 8.0 統(tǒng)計軟件進行分析，結(jié)果用±s 表示，并對試驗結(jié)果進行單因素方差分析ANOVA，P＜0.05 表示顯著差異，信號通路圖采用Pathway Builder 2.0 軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 小腸內(nèi)分泌模型的建立

小腸內(nèi)分泌細胞受腸腔內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)刺激分泌腸源性激素，GLP-1 的合成和分泌呈葡萄糖濃度依賴性[10]。由于GLP-1 的合成是建立在一定葡萄糖濃度基礎(chǔ)之上，因此選擇適宜的葡萄糖濃度對模型建立至關(guān)重要。如圖1所示，葡萄糖能夠刺激GLP-1 分泌且具有濃度依賴性，當(dāng)葡萄糖濃度達到15 mmol/mL 時，GLP-1 分泌量較對照組顯著增加。為了研究功能糖是否具有促GLP-1 等腸源性激素分泌的特性，選取10 mmol/mL 的葡萄糖濃度作為基礎(chǔ)濃度，在此濃度之下NCI-H716 細胞具有一定的分泌GLP-1 的能力但是又不至于過量分泌影響功能糖的作用。

圖1 不同濃度葡萄糖對GLP-1 分泌的影響Fig.1 Effects of different concentrations of glucose on GLP-1 secretion

2.2 不同功能糖促腸源性激素分泌研究

2.2.1 不同功能糖對NCI-H716 細胞活力的影響圖2為功能糖處理細胞24 h 后對細胞活力的影響。從圖2中可以看出，海藻糖、木糖醇、異麥芽酮糖醇、山梨糖醇在0.5～4 mg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對NCI-H716 細胞存活率無顯著影響（圖2a～d），赤蘚糖醇、L-阿拉伯糖在0.5～8 mg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對NCI-H716 細胞存活率無顯著影響（圖2e～f）。因此選取0.5～4 mg/mL 范圍內(nèi)任意質(zhì)量濃度進行后續(xù)試驗，但是考慮到GLP-1 的分泌量可能與功能糖劑量有關(guān)，因此選擇低劑量（0.5 mg/mL），中劑量（1 mg/mL），高（2 mg/mL）3 個質(zhì)量濃度進行后續(xù)試驗。

圖2 功能糖對NCI-H716 細胞活力的影響Fig.2 Effects of functional sugars on the viability of NCI-H716 cells

2.2.2 不同功能糖對NCI-H716 細胞GLP-1、GLP-2、PYY 分泌的影響如圖3所示，異麥芽酮糖醇、L-阿拉伯糖對GLP-1、GLP-2、PYY 的分泌無顯著影響（圖3e～f）。赤蘚糖醇、山梨糖醇、木糖醇的促激素分泌能力類似。當(dāng)赤蘚糖醇質(zhì)量濃度為2 mg/mL 時，GLP-1 分泌率達到對照組的1.18倍；當(dāng)赤蘚糖醇質(zhì)量濃度為1 mg/mL 時，GLP-2 的分泌率達到對照組的1.15 倍（圖3b）。當(dāng)山梨糖醇質(zhì)量濃度為1 mg/mL 時，GLP-1 分泌率為對照組的1.08 倍；當(dāng)山梨糖醇質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 時PYY 的分泌率達到對照組的1.14 倍（圖3c）。木糖醇質(zhì)量濃度在1～2 mg/mL 范圍內(nèi)顯著促進PYY的分泌（P＜0.05）（圖3d）。海藻糖促進激素分泌作用最顯著，質(zhì)量濃度在0.5～4 mg/mL 范圍內(nèi)均顯著促進GLP-1、PYY 的分泌（P＜0.05）。當(dāng)海藻糖質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 時，GLP-1 分泌率達到對照組的1.19 倍；當(dāng)海藻糖質(zhì)量濃度為1 mg/mL 時PYY 分泌率達到對照組的1.49 倍（圖3a）。由此可見，功能糖促激素分泌不具有質(zhì)量濃度依賴性且上述6 種功能糖中海藻糖的促腸源性激素分泌能力最強。

有研究發(fā)現(xiàn)糖類物質(zhì)主要通過甜味受體信號通路促進GLP-1 分泌[11]，故本研究選擇促GLP-1分泌能力較強的海藻糖、赤蘚糖醇、山梨糖醇進一步探究其對甜味受體關(guān)鍵基因表達量的影響，闡明功能糖促GLP-1 分泌的機制。

2.3 功能糖對NCI-H716 細胞甜味受體信號通路相關(guān)基因T1R2、T1R3、Gα-gustducin、PLCβ2、TRPM5 mRNA 表達量的影響

甜味受體是存在于細胞膜上的跨膜異二聚體蛋白，分為T1R2 和T1R32 個亞基。當(dāng)T1R2 或T1R3 單獨存在時，對甜味的感知能力極低，然而2 個單體結(jié)合后幾乎能感知所有甜味[12]。甜味受體與細胞膜內(nèi)側(cè)Gα-gustducin 味蛋白相偶聯(lián)，甜味物質(zhì)與受體結(jié)合導(dǎo)致受體的構(gòu)象發(fā)生變化，引發(fā)細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)及腸泌激素釋放[13]。圖5的試驗結(jié)果表明：赤蘚糖醇、海藻糖、山梨糖醇質(zhì)量濃度在0.5～2 mg/mL 范圍內(nèi)可上調(diào)甜味受體T1R2/T1R3 和TRPM5 通道m(xù)RNA 表達量（圖3a，3e）；0.5 mg/mL 的赤蘚糖醇、海藻糖、山梨糖醇可上調(diào)甜味受體下游Gα-gustducin mRNA 表達量（圖3c）；0.5 mg/mL 的赤蘚糖醇和海藻糖及1 mg/mL的山梨糖醇可上調(diào)PLCβ2 mRNA 的表達量（圖3d）。

圖3 功能糖對GLP-1、GLP-2、PYY 分泌的影響Fig.3 Effects of functional sugars on secretion of GLP-1，GLP-2 and PYY

上述研究表明，赤蘚糖醇、海藻糖、山梨糖醇通過上調(diào)甜味受體信號通路相關(guān)基因T1R2、T1R3、Gα-gustducin、PLCβ2、TRPM5 mRNA 表 達量促進腸源性激素分泌，且海藻糖對5 種基因表達量的上調(diào)能力遠高于其它2 種。腸腔通過葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白和甜味受體感應(yīng)糖類物質(zhì)促進激素分泌[14]。Margolskee 等[15]研究表明甜味受體T1R2/T1R3 可以調(diào)控鈉依賴性葡萄糖轉(zhuǎn)運載體1（SGLT1）的基因表達。海藻糖是一種非還原型雙糖，可分解為2 分子葡萄糖被人體吸收利用，因此推測海藻糖能夠同時激活甜味受體與葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白，兩者之間存在協(xié)同作用可增強腸腔對海藻糖的感應(yīng)，促進海藻糖介導(dǎo)的激素分泌[16]。

圖4 功能糖對NCI-H716 細胞中T1R2、T1R3、Gα-gustducin、PLCβ2、TRPM5 mRNA 表達量的影響Fig.4 Effects of functional sugar on the mRNA expression levels of T1R2，T1R3，Gα-gustducin，PLCβ2 and TRPM5 in NCI-H716 cells

2.4 功能糖對NCI-H716 細胞內(nèi)Ca2+含量的影響

Ca2+是細胞內(nèi)的第二信使，也是甜味受體信號通路中的重要信號分子。因此胞內(nèi)Ca2+含量變化是甜味受體信號通路激活的重要指標(biāo)之一。由圖6可知，0.5～1 mg/mL 的赤蘚糖醇、海藻糖、山梨糖均可以促進胞內(nèi)Ca2+含量升高。

通過研究初步探索了功能糖激活甜味受體信號通路促進腸源性激素分泌的機理（圖7）。信號傳達的大致過程為：小腸內(nèi)分泌細胞表面的甜味受體識別功能糖后蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致Gα-gustducin 與甜味受體解離，Gα-gustducin 可以激活PLCβ2，PLCβ2 能將PIP2 分解為IP3，IP3激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面的IP3R，引起鈣池的Ca2+外流，Ca2+濃度升高后激活TRPM5 通道打開，引起Na+內(nèi)流，胞內(nèi)帶正點離子濃度升高引起細胞去極化，促進腸源性激素分泌。

圖5 功能糖對NCI-H716 細胞內(nèi)Ca2+含量的影響Fig.5 Effects of functional sugars on Ca2+concentration in NCI-H716 cells

3 討論

功能糖可引起PYY 的釋放，而PYY 可以起到抑制腸道蠕動、膽囊收縮及延緩胃排空的作用。除此之外，PYY 作用于下丘腦對飽腹感產(chǎn)生影響，并在干預(yù)胰島素抵抗、調(diào)節(jié)血糖、改善脂代謝等方面功能糖也有不俗的表現(xiàn)。李建文等[17]發(fā)現(xiàn)L-阿拉伯糖對減輕自發(fā)性II 型糖尿病大鼠的胰島素抵抗及高脂血癥具有顯著療效。Matsuo 等[18]研究表明D-阿洛酮糖可降低血糖，減少脂質(zhì)積累。楊志遠等[19]用木糖醇注射液作糖尿病人的營養(yǎng)用藥改善了病人糖代謝，消除酮血癥。由于功能糖的特殊功效，使得其在食品中既可作為一種功能性配料，又可作為蔗糖的替代品，降低食品中糖對特殊人群的影響[20-21]。除了功能糖以外，人參皂苷、苦瓜、龍膽根水提取物等均被證明通過促進GLP-1 分泌發(fā)揮抑制血糖升高、改善IR 和抗糖尿病的作用[22-26]。除了與腸道發(fā)生直接作用，功能糖還可以被腸道菌群利用發(fā)酵生成短鏈脂肪酸等小分子物質(zhì)，短鏈脂肪酸也具有促進腸源性激素分泌的功能[27-28]。

圖6 功能糖對NCI-H716 細胞內(nèi)Ca2+含量影響的熒光染色圖Fig.6 Fluorescence staining of effects of functional sugars on Ca2+concentration in NCI-H716 cells

圖7 功能糖激活甜味受體信號通路促進GLP-1 分泌Fig.7 Functional sugars activates sweet receptor signaling pathway to promote GLP-1 secretion

4 結(jié)論

利用NCI-H716 細胞證明了海藻糖、赤蘚糖醇、山梨糖醇、木糖醇可以促進GLP-1、GLP-2、PYY 的分泌，并發(fā)現(xiàn)海藻糖、赤蘚糖醇、山梨糖醇通過上調(diào)甜味受體信號通路關(guān)鍵基因T1R2、T1R3、Gα-gustducin、PLCβ2、TRPM5 mRNA 表 達量，增加胞內(nèi)Ca2+濃度促進GLP-1 分泌。本研究為功能糖改善糖、脂代謝的機理研究提供了新思路，也為功能糖在食品中的應(yīng)用提供了理論支持。除了激活甜味受體外，腸源性激素的分泌還受到食物狀態(tài)、胃腸中營養(yǎng)物質(zhì)含量及腸道消化吸收水平、腸道微生物等因素的影響。甜味受體信號通路的激活并不是影響GLP-1 分泌的唯一途徑，本研究中僅考慮了功能糖對腸內(nèi)分泌細胞的影響，存在一定的局限性。