王子晨 林 峰 高騰云 劉深賀

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，鄭州 450046)

夏季牛場(chǎng)面臨嚴(yán)峻的熱應(yīng)激問(wèn)題，導(dǎo)致產(chǎn)奶量、奶品質(zhì)、采食量、繁殖力下降，免疫功能受損，生理機(jī)能障礙，造成代謝疾病和蹄病多發(fā)，使牧場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益下降[1-3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，熱應(yīng)激造成美國(guó)每年奶牛業(yè)損失達(dá)8.97億～15.00億美元[4]，是限制養(yǎng)牛業(yè)發(fā)展的重要因素?；诖?，牧場(chǎng)多采取3種措施緩解熱應(yīng)激：1)物理降溫，如安裝水簾、噴淋設(shè)備以及通風(fēng)、遮陰設(shè)施，從而改善牛場(chǎng)環(huán)境[5];2)營(yíng)養(yǎng)調(diào)控，主要是在飼糧中補(bǔ)充中草藥、氨基酸類(lèi)、維生素和微生態(tài)制劑等添加劑[6];3)培育耐熱品種，雖能夠從根源上降低熱應(yīng)激帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失，但周期較長(zhǎng)[7]。由于熱誘導(dǎo)下細(xì)胞功能受損的主要因素是引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，研究者應(yīng)用多酚、視黃醇、蝦青素、維生素E和褪黑素(melatonin,MT)等抗氧化劑來(lái)降低熱應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡[8-9]。有研究發(fā)現(xiàn)褪黑素在清除自由基方面比谷胱甘肽更有效，甚至是維生素效果的2倍[10]。

MT又稱(chēng)為抑黑素、松果腺素，作為色氨酸衍生物，首次在脊椎動(dòng)物的松果體中被發(fā)現(xiàn)，后陸續(xù)在胃腸道、胎盤(pán)、卵巢、視網(wǎng)膜和皮膚中被發(fā)現(xiàn)[11]。MT廣泛參與機(jī)體生理活動(dòng)，是季節(jié)性繁殖和晝夜節(jié)律的重要調(diào)節(jié)因子，與免疫調(diào)節(jié)、腫瘤發(fā)生、神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)、清除自由基、抗氧化和延緩衰老等密切相關(guān)[12]。MT及其代謝產(chǎn)物作為一種強(qiáng)效的內(nèi)源性自由基清除劑和抗氧化劑，通過(guò)一系列抗氧化反應(yīng)來(lái)清除活性氧(reactive oxygen specie,ROS)，從而防止自由基介導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷[13]。天然來(lái)源的MT安全可靠、價(jià)格便宜、易提取、半衰期短且毒副作用小[14]，對(duì)其功能和作用機(jī)理的深入研究，將為畜牧工作者對(duì)緩解奶(水)牛熱應(yīng)激的研究工作提供新思路。

1 外源MT緩解奶(水)牛熱應(yīng)激

1.1 奶牛熱應(yīng)激

我國(guó)奶牛多為北歐的荷斯坦牛，繁殖力低下和奶品質(zhì)下降等難題在夏季熱應(yīng)激期間尤為突出[15]。奶牛熱應(yīng)激通常用溫濕度指數(shù)(temperature humidity index,THI)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，隨著奶牛產(chǎn)奶量的提高，THI閾值已從72降為68，高于此值時(shí)奶牛出現(xiàn)熱應(yīng)激反應(yīng)[16]。輕度熱應(yīng)激引起奶牛直腸溫度與呼吸頻率升高，奶牛生理狀況、采食量、免疫能力和健康狀況下降，最終導(dǎo)致奶?；疾÷噬遊17]。Lecchi等[18]指出熱應(yīng)激導(dǎo)致ROS水平升高從而引起奶牛免疫抑制。因此，不同學(xué)者采用不同給藥方式，在夏季應(yīng)用MT進(jìn)行了奶牛抗熱應(yīng)激方法的研究(表1)。

表1 外源MT緩解奶牛熱應(yīng)激的應(yīng)用效果

MT能夠緩解熱應(yīng)激對(duì)奶牛繁殖性能產(chǎn)生的負(fù)面影響。史建民等[20]研究MT在荷斯坦奶牛體內(nèi)的分泌規(guī)律及代謝速度，發(fā)現(xiàn)皮下注射和靜脈注射時(shí)血液MT含量最高。皮質(zhì)醇含量與母牛卵母細(xì)胞質(zhì)量有關(guān)，在熱應(yīng)激條件下血清皮質(zhì)醇含量升高，補(bǔ)充MT后能夠抑制這種變化并提高孕激素含量[21]。此外，皮下注射MT，降低了奶牛死胎率、妊娠損失和繁殖障礙綜合征，提高了情期受胎率、產(chǎn)后首次配種受胎率[18]。Garcia等[22]對(duì)熱應(yīng)激牛進(jìn)行皮下埋植MT，同樣使奶牛妊娠損失和繁殖障礙綜合征下降，并降低了死胎率、難產(chǎn)率和流產(chǎn)率。

目前，MT緩解夏季熱應(yīng)激奶牛相關(guān)的生理指標(biāo)數(shù)據(jù)較少見(jiàn)報(bào)道，對(duì)不同動(dòng)物生長(zhǎng)性狀的影響結(jié)果也并不一致[21]。MT更多地被應(yīng)用于提高夏季奶牛場(chǎng)熱應(yīng)激奶牛的泌乳潛能。MT作為抗氧化劑具有殺菌作用，可增強(qiáng)機(jī)體免疫活性的能力，MT的應(yīng)用能夠提高奶牛產(chǎn)奶量和奶品質(zhì)，治療乳房炎、酮病和酸中毒[23]。白細(xì)胞數(shù)量和免疫球蛋白含量是判斷熱應(yīng)激奶牛免疫能力的關(guān)鍵指標(biāo)，研究人員對(duì)熱應(yīng)激奶牛皮下注射MT后將其血液進(jìn)行常規(guī)指標(biāo)分析，發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)醇含量降低至正常范圍，血液中淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞數(shù)量增加，免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)含量升高，白蛋白含量、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和乳酸脫氫酶活性也有所升高，最終牛奶體細(xì)胞數(shù)(SCC)降低[19,24-26]。SCC作為奶牛生產(chǎn)性能測(cè)定的重要指標(biāo)用于衡量牛奶質(zhì)量和乳房健康，SCC降低伴隨著乳脂率和乳蛋白率的升高，牛奶產(chǎn)量和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值提高[27-28]。由于口服MT的生物利用率較低，皮下埋植難以準(zhǔn)確控制劑量[25]，所以研究中多應(yīng)用皮下注射MT提高熱應(yīng)激奶牛的產(chǎn)奶性能。相比易引起耐藥性和殘留物有害的抗生素，MT能更有效、安全和快速地降低SCC[18]。但連續(xù)注射MT引起的應(yīng)激不容忽視，且夏季長(zhǎng)時(shí)間的注射或許會(huì)增加奶牛注射處傷口感染機(jī)率。

1.2 水牛熱應(yīng)激

水牛多棲居于炎熱潮濕的地帶，深色的皮膚和稀疏的毛發(fā)吸收大量太陽(yáng)輻射，汗腺卻不發(fā)達(dá)，極易發(fā)生熱應(yīng)激[29]。區(qū)別于奶牛，THI>75時(shí)水牛出現(xiàn)熱應(yīng)激[30]。熱應(yīng)激是水牛乏情的主要原因，在印度，水牛產(chǎn)后不發(fā)情率為20%～80%，并在夏季達(dá)到最高[31]。熱應(yīng)激造成繁殖力低下是水牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸，主要包括母牛受孕率降低、胚胎死亡率升高、公牛精子質(zhì)量與活力降低[32-35]。因此，研究人員在夏季應(yīng)用MT來(lái)進(jìn)行水?？篃釕?yīng)激方法研究。

高溫引起精子細(xì)胞的氧化應(yīng)激，可以導(dǎo)致精子活力和活率降低，Ramadan等[34]對(duì)摩拉水牛皮下埋植18 mg/50 kg的MT后可以顯著改善這一狀況。對(duì)熱應(yīng)激下的公牛而言，MT能夠清除ROS來(lái)提高精子活力，同時(shí)MT的使用改善了精液質(zhì)量和精漿代謝產(chǎn)物，保護(hù)雄性生殖器官免受環(huán)境的氧化應(yīng)激損傷，提高水牛非繁殖季節(jié)的繁殖力[35]。郭振偉等[36]在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)MT能夠有效緩解水牛卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激，促進(jìn)孕激素的生成，促進(jìn)促黃體激素和雌二醇的生成，提高卵母細(xì)胞的體外成熟率與體外受精的胚胎發(fā)育。外源注射MT引起血液中MT含量的升高，由此引起血漿促性腺激素釋放激素(GnRH)含量升高，促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)和排卵[37]。有研究指出外源MT使血液中MT含量升高可能與抗氧化能力的提高呈正相關(guān)[38]。佟桂芝等[39]研究發(fā)現(xiàn)，MT的抗氧化能力輔助卵泡生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)，降低了繁殖綜合征和妊娠損失的發(fā)生率，促進(jìn)體外培養(yǎng)的牛胚胎質(zhì)量和發(fā)育。外源MT緩解水牛熱應(yīng)激的應(yīng)用效果見(jiàn)表2。

表2 外源MT緩解水牛熱應(yīng)激的應(yīng)用效果

水牛作為單胎動(dòng)物，季節(jié)性發(fā)情且性成熟晚，炎熱條件下發(fā)情特征不明顯，熱應(yīng)激水牛發(fā)情持續(xù)時(shí)間縮短，生產(chǎn)上應(yīng)用同期發(fā)情技術(shù)結(jié)合人工授精、超數(shù)排卵和胚胎移植從而提高生產(chǎn)效率[41]。D’occhi等[42]的研究中發(fā)現(xiàn)，在應(yīng)用GnRH和孕酮進(jìn)行同期發(fā)情前使用MT治療的水牛，其黃體功能增強(qiáng)，且維持妊娠能力提高。Ramadan等[33]在內(nèi)控藥物釋放裝置(controlled internal drug release，CIDR)+馬絨毛膜促性腺激素(eCG)方案應(yīng)用前添加MT，通過(guò)減少大卵泡的閉鎖增加了排卵卵泡的數(shù)量，使夏季熱應(yīng)激水牛的受胎率升高至100%。不僅是水牛，高翔[38]對(duì)夏季乏情的西門(mén)塔爾牛應(yīng)用誘導(dǎo)促排卵技術(shù)(Ovsynch方案)實(shí)施前采用MT治療，卵泡直徑增大，受孕率提高。MT通過(guò)恢復(fù)熱應(yīng)激狀態(tài)下乏情水牛的發(fā)情周期，從而提高發(fā)情率和受孕率。在牛體外研究中MT的劑量多在10-6～10-9mol/L[36,40]，皮下埋植MT的劑量多為18 mg/50 kg[33,40]，然而MT的添加對(duì)?？篃釕?yīng)激的有益作用呈一定范圍的劑量依賴(lài)，不同的給藥方式效果比較以及與同期發(fā)情方案的最佳組合均有待進(jìn)一步研究。

2 外源MT對(duì)熱誘導(dǎo)動(dòng)物細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)理

2.1 MT與氧化應(yīng)激

近年來(lái),隨著分子遺傳學(xué)發(fā)展，國(guó)內(nèi)外對(duì)熱應(yīng)激的研究深入到細(xì)胞水平。相比精液質(zhì)量不佳，卵母質(zhì)量下降是造成高溫季節(jié)牛繁殖力低的主要原因[43]。與此觀點(diǎn)一致，Sakatani等[44]無(wú)論使用哪種季節(jié)采集的奶牛精液，在高溫季節(jié)受孕率都較低。Li等[45]指出熱應(yīng)激引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)是危害細(xì)胞生理功能的主要因素。

MT主要通過(guò)3個(gè)途徑保護(hù)動(dòng)物細(xì)胞免受熱應(yīng)激誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激影響(圖1)：1)作為自由基清除劑，保持細(xì)胞中氧化還原水平和保護(hù)細(xì)胞免受自由基的損傷[46];2)通過(guò)結(jié)合MT受體間接作用于抗氧化酶[47]，以更好地保護(hù)機(jī)體免受自由基的氧化損傷;3)依靠其化學(xué)結(jié)構(gòu)提供電子以及抑制一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)的活性[48]，Galano等[49]認(rèn)為電子轉(zhuǎn)移是決定MT自由基清除活性的主要機(jī)制。

NOS：一氧化氮合酶nitric oxide synthase；Nrf-Ⅱ：核因子E2相關(guān)因子-Ⅱ nuclear factor erythroid 2-related factor-Ⅱ；GSH：谷胱甘肽glutathione；CytC：細(xì)胞色素C cytochrome C；Apaf-Ⅰ：凋亡酶激活因子-Ⅰapoptotic protease activating factor-Ⅰ；Bcl-2:B細(xì)胞淋巴瘤-2 B-cell lymphoma-2;Caspase-9:半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9 cysteine aspartic acid protease-9。

清除細(xì)胞內(nèi)的ROS對(duì)牛卵母細(xì)胞成熟發(fā)育至關(guān)重要，MT通過(guò)清除ROS和NOS阻止氧化損傷可能是通過(guò)核因子E2相關(guān)因子-Ⅱ(Nrf-Ⅱ)抗氧化反應(yīng)元件信號(hào)通路[50]。通過(guò)激活抗氧化基因，降低ROS水平、升高谷胱甘肽(GSH)的表達(dá)水平和活性。Reiter等[51]指出生理劑量的MT能夠促進(jìn)GSH的大量生成，從而調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞受精能力，提高奶(水)牛卵母細(xì)胞和胚胎發(fā)育質(zhì)量。此外，MT促進(jìn)抗凋亡基因B細(xì)胞淋巴瘤-2(Bcl-2)基因的表達(dá)，抑制促凋亡基因p53的表達(dá)，減少了熱誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。在牛體細(xì)胞核移植胚胎[52]、豬卵母細(xì)胞[45]、綿羊卵母細(xì)胞[53]和小鼠顆粒細(xì)胞[54]等試驗(yàn)中均有報(bào)道MT對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激的保護(hù)作用。Fu等[55]報(bào)道了外源性MT的補(bǔ)充保護(hù)了配子和羊早期胚胎的發(fā)育，減少了DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)免受ROS和自由基損傷。Papis等[56]的試驗(yàn)在培養(yǎng)液中添加MT，減少了氧化應(yīng)激，從而提高牛體外受精胚胎發(fā)育。

2.2 MT與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

熱應(yīng)激下未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白的積累會(huì)產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)，并引起未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)[57](圖2)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損害顆粒細(xì)胞功能，造成卵母細(xì)胞成熟延遲，損害受精和植入前胚胎發(fā)育，最終損害動(dòng)物的繁殖效率[58-59]。Alemu等[57]研究結(jié)果顯示熱應(yīng)激顯著增加了24 h培養(yǎng)的牛顆粒細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記基因葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94(glucose regulated protein 94，GRP94)的表達(dá)。

Melatonin:褪黑素；ER stress: 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 endoplasmic reticulum stress;UPR: 未折疊蛋白反應(yīng) unfolded protein response; GRP78: 葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 glucose regulated protein 78;Caspase-12: 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12 cysteine aspartic acid protease-12;Bcl-2:B細(xì)胞淋巴瘤-2 B-cell lymphoma-2;PERK-eIF2A：蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶-真核啟示因子2α protein kinase-like ER kinase-eukaryotic translation initiation factor 2 alpha；ATF6：活化轉(zhuǎn)錄因子6 activating transcription factor 6；IREⅠ-XBPⅠ：肌醇需求酶Ⅰ-盒結(jié)合蛋白Ⅰ inositol requiring enzyme Ⅰ-X-box binding protein-Ⅰ；CHOP：C/EBP同源蛋白C/EBP homologous protein；calpain：鈣蛋白酶；Caspases：細(xì)胞凋亡蛋白酶；Apoptosis：細(xì)胞凋亡。

MT可以影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中抑制蛋白合成的蛋白折疊和降解途徑，通過(guò)ER伴侶GRP78和蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶-真核啟示因子2α(PERK-eIF2A)、活化轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6)、肌醇需求酶Ⅰ-盒結(jié)合蛋白Ⅰ(IREⅠ-XBPⅠ)3種跨膜蛋白結(jié)合影響下游基因的表達(dá)，而MT對(duì)UPR通路的影響體現(xiàn)于它調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的能力[59]。MT抑制熱休克蛋白的表達(dá)，再通過(guò)細(xì)胞凋亡途徑下調(diào)促凋亡基因半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteine aspartic acid opalase-3，Caspase-3)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12(cysteine aspartic acid opalase-12，Caspase-12)的表達(dá)水平，阻止熱誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡同時(shí)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[60]。Hassan等[60]指出熱休克蛋白與家畜的耐熱性以及奶牛斷奶體重、繁殖力和疾病易感性均相關(guān)。在小鼠的卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育過(guò)程中，MT可有效抵抗熱應(yīng)激引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[61]。Park等[62]的試驗(yàn)中證實(shí)了MT在豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)過(guò)程中可調(diào)節(jié)UPR信號(hào)通路從而降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。賈甜甜等[50]研究發(fā)現(xiàn)MT的使用作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑可恢復(fù)受熱應(yīng)激影響的牛卵母細(xì)胞成熟。盡管許多研究已經(jīng)報(bào)道了MT在緩解熱應(yīng)激中的重要作用，有關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在牛產(chǎn)業(yè)上的詳細(xì)機(jī)制有待深入研究。

3 小結(jié)與展望

近幾年MT提取方法升級(jí)，利用化學(xué)合成方法制備MT的工藝較成熟,純度高,生產(chǎn)成本大大降低，基于MT生物功能的多樣性，MT應(yīng)用于奶(水)牛抵抗熱應(yīng)激的研究不斷發(fā)展，但局限于試驗(yàn)階段，諸多問(wèn)題有待解決，如MT的給藥方式和有效濃度有待進(jìn)一步探究，長(zhǎng)期使用的安全性、對(duì)奶(水)牛的生殖生理功能和機(jī)體健康的不利影響有待進(jìn)一步確定。隨著科研人員致力于MT作用機(jī)制的研究，MT正確安全的應(yīng)用于養(yǎng)牛業(yè)抗熱應(yīng)激方面指日可待。