潘鶴立，張鑫鑫，潘騰飛,3，潘東明，于 遠(yuǎn),3

（1. 福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；2. 福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；3. 福建農(nóng)林大學(xué)園藝產(chǎn)品貯運(yùn)保鮮研究所，福建 福州 350002）

0 引言

【研究意義】柑橘是我國廣泛栽培，面積和產(chǎn)量均居前茅的果樹種類，主要包括寬皮橘類、甜橙類、柚類、雜柑類、金柑類和枸櫞等，其中以寬皮橘類、甜橙類、柚類栽培最為廣泛。柚子是中國的特產(chǎn)水果，果實(shí)碩大，揮發(fā)性物質(zhì)含量較高，蕓香味濃郁?，g溪蜜柚以果大色美味佳、皮薄汁多耐貯而聞名海內(nèi)外，堪稱“柚中之冠”，香氣是琯溪蜜柚果實(shí)品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。【前人研究進(jìn)展】已有研究報(bào)道，在柚子[1?4]、葡萄柚[5,6]、甜橙[7?12]、酸橙[11,12]、血 橙[10,13,14,]、寬 皮 柑 橘[11,15?18]、檸 檬[19?21]、枸櫞[22]、雜柑[23?26]上均有果實(shí)香氣物質(zhì)的研究。不同種類、不同品種之間存在基因型差異，其果實(shí)香氣成分也存在較大的差異，且因檢測分析方法不同，已有研究的結(jié)果不盡一致?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】柚類不同種類和品種的果實(shí)主要香氣成分存在差異，而琯溪蜜柚及其芽變品種紅肉蜜柚和三紅蜜柚果實(shí)的香氣成分如何，尚未見深入研究；也未見對引起琯溪蜜柚芽變品種香氣組分差異的分子機(jī)理進(jìn)行研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究探明琯溪蜜柚及其芽變新品種果汁的香氣組分種類、相對含量與差異，以及引起香氣組分變化的可能分子機(jī)理，以期為高品質(zhì)蜜柚的選育和產(chǎn)品深度開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為琯溪蜜柚［Citrus maxima（Burm.）Merr］及其芽變1代品種紅肉蜜柚、芽變2代品種三紅蜜柚，樣品采自于平和縣厝坵村福建平和祥紅紅肉蜜柚開發(fā)有限公司果園，8年生結(jié)果樹，取成熟果實(shí)果汁為供試樣品。

主要試劑C8-C20烷烴混標(biāo)（40 mg·L?1，Sigma），3-己酮（0.815 g·mL?1，Sigma），正己烷（色譜純，羅 恩），超純水，氯化鈉（色譜純，Sigma）。

1.2 試驗(yàn)儀器

氣相色譜質(zhì)譜儀器（7890B，Agilent），自動進(jìn)樣架（GERSTEL MPS），飛行時(shí)間質(zhì)譜（Pegasus HTC- LECO），毛細(xì)管色譜柱（0.25 μm ×0.25 mm ×30 m，RESTEK Rxi-5 Sil MS），分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司 d = 0. 1 mg），純水系統(tǒng)（Millipore，Elix Essential 5，Milli-Q Advan-tage A10），纖維針（1 cm，50/30 μm，DVB/CAR/PDMS，Supelco，Bellefonte, PA, USA），稱量紙，藥匙，試管架，移液 槍。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 香氣組分分析 采用氣相色譜質(zhì)譜法。稱取1.5 g NaCl粉末，吸取6 ml果汁，加入6 μl內(nèi)標(biāo)3-己酮（0.163 g·L?1）于20 mL頂空瓶中，蓋上帶有硅膠/聚四氟乙烯隔膜（18 mm，GERSTEL）的螺旋卷曲帽，迅速混勻。備好的樣品于?20 ℃保存。每個(gè)基因型設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。采用固相微萃?。⊿PME）法進(jìn)行香氣物質(zhì)的提取時(shí)，樣品于室溫下解凍，放置于氣相色譜質(zhì)譜儀（7890B，Agilent）支架上，以待檢測。分析時(shí)，果汁樣品在40 ℃下溫育30 min后，由1 cm纖維針（50/30 μm，DVB/CAR/PDMS，Supelco，Bellefonte, PA, USA）暴露在頂空瓶上方吸附60 min，再經(jīng)由纖維針將吸附的香氣化合物注入氣相色譜質(zhì)譜儀（7890B，Agilent）注入器端口，釋放5 min。GC設(shè)備設(shè)置為：色譜柱，Rxi-5 Sil MS；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；傳輸線溫度：270 ℃；載氣：氦氣；氦氣流速：1 mL·min?1；程序升溫：40 ℃保持5 min，以3 ℃·min?1的 速 率 升 至230 ℃，保 持3 min，以15 ℃·min?1的速率升至260 ℃；不分流進(jìn)樣。MS條件：溶劑延遲，5 min；掃描范圍：45～600；采集速率：10譜圖/s；檢測器電壓：1 530 V；EI電離能量：70 eV；離子源溫度：250 ℃。每天進(jìn)樣前，先跑一針C8-C20烷烴混標(biāo)（10 mg·L?1，Sigma），通過自動解卷積與鑒定系統(tǒng)（AMDIS）計(jì)算正構(gòu)烷烴C8-C20數(shù)據(jù)文件得到正構(gòu)烷烴保留指數(shù)（RI）。采用各組分在圖譜庫NIST05.L中匹配度大于99%的鑒定結(jié)果進(jìn)行定性分析，并與文獻(xiàn)資料中相關(guān)化合物保留指數(shù)進(jìn)行比對分析。采用內(nèi)標(biāo)法對樣品的峰面積進(jìn)行 校正。

1.3.2 轉(zhuǎn)錄組分析 材料 以琯溪蜜柚及其芽變品種紅肉蜜柚和三紅蜜柚果實(shí)為材料。每個(gè)品種選取3株8年長勢一致的蜜柚樹，分別采集花后80 、120和180 d的果實(shí)，每株樹采3個(gè)果，共27個(gè)樣品；取果肉液氮速凍，?80 ℃低溫冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

方法 采用BioTeKe總RNA抽提試劑盒提取柚果實(shí)總RNA；委托廣州華大生物科技有限公司建庫、測序（Illumina HiSeqTM 2500）、De novo組裝和注釋等生物信息學(xué)分析；差異表達(dá)基因篩選與FPKM趨勢 分析參照文獻(xiàn)[27]～[28]。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì) 試驗(yàn)結(jié)果為3次重復(fù)的平均值，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel軟件進(jìn)行處理和圖表制作，采用JMP 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行主成分分析，采 用prism軟件進(jìn)行FPKM值趨勢預(yù)測。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試3個(gè)品種果汁香氣組分與相對含量

圖1-A、B和表1至表8顯示，琯溪蜜柚及其芽變品種紅肉蜜柚、三紅蜜柚果汁樣品中共檢出150種香氣組分，各品種的香氣組分?jǐn)?shù)量與含量相差較大。

圖 1 紅肉蜜柚、三紅蜜柚和琯溪蜜柚果汁樣品的揮發(fā)性組分Fig. 1 Volatile profile in juice samples from Hongroumiyou, Sanhongmiyou and Guanximiyou

琯溪蜜柚果汁中共檢測到59種香氣化合物，總相對含量4.56，占多數(shù)的化合物種類為芳香烴類、倍半萜烯類、醛類、醇類、酮類等。紅肉蜜柚果汁中共檢測到129種香氣化合物，總相對含量8.02，占多數(shù)的化合物種類為芳香烴類。三紅蜜柚果汁中共檢測到67種香氣化合物，總相對含量9.90，占多數(shù)的化合物種類為芳香烴類、醛類、醇類等。相對含量較高的主要香氣組分為醛類、醇類、酮類，相對含量較低的有呋喃類、芳香烴類、倍半萜烯類、酯類、單萜類化合物，此外還檢出相對含量很低或微量的其他類的香氣組分32種，且均為未見報(bào)道的未知化合物。

表1表明，3個(gè)供試品種果汁共檢出13種醛類香氣組分，其中1種相對含量為微量（雖有被識別的峰，但相對值小于0.009 5）；琯溪蜜柚共檢出8種醛類香氣組分，其中6種內(nèi)標(biāo)峰面積的相對定量值＞0.009 5，總相對含量為3.19；微量2種、未檢出5種；紅肉蜜柚共檢出11種醛類香氣組分，其中9種內(nèi)標(biāo)峰面積的相對定量值＞0.009 5，總相對含量為4.5；微量2種、未檢出2種；三紅蜜柚共檢出13種醛類香氣組分，其中12種內(nèi)標(biāo)峰面積的相對定量值＞0.009 5，總相對含量為7.19；微量1種。己醛在醛類香氣組分中的相對含量最高，是3個(gè)品種果汁的共同主要香氣組分，但芽變品種紅肉蜜柚（3.65）和三紅蜜柚（5.77）均顯著高于琯溪蜜柚（2.24）。

表2表明，3個(gè)供試品種果汁共檢出12種醇類香氣組分，其中，2種未見研究報(bào)道，3種僅含微量；2種為未知醇類香氣物質(zhì)?，g溪蜜柚共檢出10種醇類香氣組分，其中5種內(nèi)標(biāo)峰面積的相對定量值＞0.009 5，總相對含量為0.13；微量5種，未檢出2種；紅肉蜜柚共檢出10種醇類香氣組分，其中8種內(nèi)標(biāo)峰面積的相對定量值＞0.009 5，總相對含量為2.29；微量2種，未檢出2種；三紅蜜柚共檢出12種醇類香氣組分，其中9種內(nèi)標(biāo)峰面積的相對定量值＞0.009 5，總相對含量為1.64；微量3種。正己醇和3-己烯-1-醇在醇類香氣組分中相對含量最高，是3個(gè)品種的共同香氣組分，但芽變品種紅肉蜜柚和三紅蜜柚均顯著高于琯溪蜜柚。

表 1 琯溪蜜柚、紅肉蜜柚和三紅蜜柚果汁樣品中的醛類香氣組分Table 1 Aroma volatiles（Aldehydes）in juice samples of Guanximiyou, Hongroumiyou and Sanhongmiyou

表 2 琯溪蜜柚、紅肉蜜柚和三紅蜜柚果汁樣品中的醇類香氣組分Table 2 Aroma volatiles (Alcohols) in juice samples of Guanximiyou, Hongroumiyou and Sanhongmiyou

表3表明，3個(gè)品種共檢出12種酮類香氣組分，其中8種未見研究報(bào)道，3種為微量，6種為未知酮類香氣物質(zhì)?，g溪蜜柚共檢出10種酮類香氣組分，其中5種內(nèi)標(biāo)峰面積的相對定量值＞0.009 5，總相對含量為0.21；微量5種，未檢出2種；紅肉蜜柚共檢出6種酮類香氣組分，其中2種內(nèi)標(biāo)峰面積的相對定量值＞0.009 5，總相對含量為0.18；微量4種、未檢出6種；三紅蜜柚共檢出10種酮類香氣組分，其中6種內(nèi)標(biāo)峰面積的相對定量值＞0.009 5，總相對含量為0.62；微量4種、未檢出2種。6-甲基-5-庚烯-2-酮在酮類香氣組分中相對含量最高；以三紅蜜柚相對含量最高，為0.49，紅肉蜜柚次之，為0.17，琯溪蜜柚最低，僅0.01。

表4表明，3個(gè)品種共檢出40種芳香烴類香氣組分，其中，38種未見研究報(bào)道，14種相對含量僅為微量，27種為未知芳香烴類香氣物質(zhì)?，g溪蜜柚共檢出7種芳香烴類香氣組分，其中4種內(nèi)標(biāo)峰面積的相對定量值＞0.009 5，總相對含量為0.79；微量3種、未檢出33種。紅肉蜜柚檢出芳香烴類香氣組分最多，達(dá)37種，其中23種內(nèi)標(biāo)峰面積的相對定量值＞0.009 5，總相對含量為0.32；微量14種、未檢出3種。三紅蜜柚共檢出10種芳香烴類香氣組分，其中3種內(nèi)標(biāo)峰面積的相對定量值＞0.009 5，總相對含量為0.06；微量7種、未檢出30種。芳香烴類香氣組分的相對含量都較低，以RI 820相對含量最高，琯溪蜜柚為0.68，而其芽變品種紅肉蜜柚僅含微量，三紅蜜柚則未檢出；RI 1029次之，琯溪蜜柚相對含量0.07，紅肉蜜柚未檢出，三紅蜜柚僅含微量；甲苯和RI 1446再次之，紅肉蜜柚相對含量僅為0.04，三紅蜜柚僅含微量，琯溪蜜柚則未檢出。

表 3 琯溪蜜柚、紅肉蜜柚和三紅蜜柚果汁樣品中的酮類香氣組分Table 3 Aroma volatiles (Ketone) in juice samples of Guanximiyou, Hongroumiyou and Sanhongmiyou

表5表明，3個(gè)品種果汁共檢出5種呋喃類香氣組分，其中，1種未見研究報(bào)道，1種僅含微量?，g溪蜜柚共檢出5種呋喃類香氣組分，其中3種內(nèi)標(biāo)峰面積的相對定量值＞0.009 5，總相對含量為0.08；微量2種；紅肉蜜柚共檢出3種呋喃類香氣組分，其中2種內(nèi)標(biāo)峰面積的相對定量值＞0.009 5，總相對含量為0.29；微量1種，未檢出2種；三紅蜜柚共檢出5種呋喃類香氣組分，其中3種內(nèi)標(biāo)峰面積的相對定量值＞0.009 5，總相對含量為0.22；微量2種。其中，2,2,6-三甲基-6-乙烯基四氫-2H-呋喃-3-醇相對含量最高，芽變品種紅肉蜜柚和三紅蜜柚分別為0.22和0.16，而琯溪蜜柚僅含微量。

表 4 琯溪蜜柚、紅肉蜜柚和三紅蜜柚果汁樣品中的芳香烴類香氣組分Table 4 Aroma volatiles（Aromatic hydrocarbons）in juice samples of Guanximiyou, Hongroumiyou and Sanhongmiyou

表 5 琯溪蜜柚、紅肉蜜柚和三紅蜜柚果汁樣品中的呋喃類香氣組分Table 5 Aroma volatiles（Furan）in juice samples of Guanximiyou, Hongroumiyou and Sanhongmiyou

表6表明，3個(gè)品種果汁共檢出10種酯類香氣組分，均為未見研究報(bào)道；其中1種僅含微量，8種為未知酯類香氣物質(zhì)。琯溪蜜柚共檢出2種未知酯類香氣組分，其中1種內(nèi)標(biāo)峰面積的相對定量值＞0.009 5，總相對含量為0.08；微量1種。紅肉蜜柚共檢出10種酯類香氣組分，3種內(nèi)標(biāo)峰面積的相對定量值＞0.009 5，總相對含量為0.03，其中2種為未知酯類香氣物質(zhì)；微量7種，其中6種為未知酯類香氣物質(zhì)。三紅蜜柚僅檢出2種微量的未知酯類香氣組分。酯類香氣組分相對含量都較低，其中，RI896相對含量在琯溪蜜柚果汁中為0.08，而紅肉蜜柚和三紅蜜柚均為微量；草酸烯丙基壬酯、RI 1761和RI 1767只有在紅肉蜜柚果汁中檢出，僅為0.01。

表 6 琯溪蜜柚、紅肉蜜柚和三紅蜜柚果汁樣品中的酯類香氣組分Table 6 Aroma volatiles（Ester）in juice samples of Guanximiyou, Hongroumiyou and Sanhongmiyou

表7表明，3個(gè)品種果汁共檢出24種倍半萜烯類香氣組分；其中18種未見研究報(bào)道，1種僅含微量，18種為未知倍半萜烯類香氣物質(zhì)。琯溪蜜柚共檢出4種未知倍半萜烯類香氣組分，但均含微量。紅肉蜜柚共檢出24種倍半萜烯類香氣組分；9種內(nèi)標(biāo)峰面積的相對定量值＞0.009 5，總相對含量為0.26，其中5種為未知倍半萜烯類香氣物質(zhì)；微量15種，其中13種為未知倍半萜烯類香氣物質(zhì)。三紅蜜柚共檢出4種未知倍半萜烯類香氣組分，但均含微量。倍半萜烯類香氣組分是供試3個(gè)品種中紅肉蜜柚果汁特有的香氣組分。

表 7 琯溪蜜柚、紅肉蜜柚和三紅蜜柚果汁樣品中的倍半萜烯類香氣組分Table 7 Aroma volatiles（Sesquiterpene）in juice samples of Guanximiyou, Hongroumiyou and Sanhongmiyou

表8表明，3個(gè)品種果汁共檢出2種單萜類香氣組分，相對含量都很低。琯溪蜜柚檢出2種單萜類香氣組分，均含微量。紅肉蜜柚檢出2種單萜類香氣組分，相對含量較低，總相對含量為0.02。三紅蜜柚檢出2種單萜類香氣組分，總相對含量為0.08。

表 8 琯溪蜜柚、紅肉蜜柚和三紅蜜柚果汁樣品中的單萜類香氣組分Table 8 Aroma volatiles（Monoterpene）in juice samples of Guanximiyou, Hongroumiyou and Sanhongmiyou

此外，研究結(jié)果還表明，3個(gè)品種果汁共檢出32種其他類香氣組分，均為未見研究報(bào)道的未知物質(zhì)；其中24種僅含微量?，g溪蜜柚共檢出11種其他類香氣組分，均為未知物質(zhì)，總相對含量為0.03；其中9種僅含微量。紅肉蜜柚共檢出26種其他類香氣組分，均為未知物質(zhì)，總相對含量為0.06；其中21種僅含微量。三紅蜜柚共檢出9種其他類香氣組分，均為未知物質(zhì)，總相對含量為0.05；其中7種僅含微量。

綜上所述，3個(gè)品種果汁中香氣化合物中相對含量最多的化合物是醛類香氣組分。其中己醛相對含量為最高，三紅蜜柚果汁中的己醛相對含量最多，分別是琯溪蜜柚和紅肉蜜柚的2.76倍和1.58倍。3-己烯醛和2-己烯醛在紅肉蜜柚和三紅蜜柚中含量較高，而在琯溪蜜柚中相對含量很低，分別僅有0.08和0.13。而4-甲基己醛，在琯溪蜜柚中含量較高，為0.71，在其他兩個(gè)芽變品種中均為微量。

醇類、酮類化合物的相對含量次之。反式-3-己烯-1-醇在紅肉蜜柚和三紅蜜柚中的相對含量較高，分別為0.95和0.74，而在琯溪蜜柚中僅含微量。正己醇則在紅肉蜜柚中含量較高，為1.17，分別是三紅蜜柚（0.66）和琯溪蜜柚（0.03）的1.77倍和39倍。六甲基五庚烯二酮在三紅蜜柚中含量為0.49，而在琯溪蜜柚中僅有0.01。

2.2 三個(gè)品種果實(shí)果汁樣品中香氣組分的主成分分析

圖2顯示，紅肉蜜柚、三紅蜜柚和琯溪蜜柚果汁樣品中的主成分差異較大。圖2（A）中，主成分1從橫軸上看顯示出3種基因型63.2%的差異，主成分2從縱軸上看顯示出3種基因型20.2%的差異。圖2（B）中，每個(gè)數(shù)字代表了一種化合物，從直觀上看化合物兩極分化明顯，大部分特征值均接近于1，說明這些化合物在3種基因型果實(shí)果汁中的含量差異較大，為3種基因型特有的化合物；但也有一些化合物如己醛，特征值接近于1，在3種基因型的柚子果汁中的含量均為最大，故己醛應(yīng)為3種基因型柚子的共同化合物。而根據(jù)3種基因型特有的化合物，推測其合成途徑及相關(guān)差異表達(dá)基因，可用來比較3種基因型柚子的差異。

圖 2 紅肉蜜柚、三紅蜜柚和琯溪蜜柚果汁樣品的揮發(fā)性組分主成分分析Fig. 2 PCA of volatile profile in juice samples from Hongroumiyou,Sanhongmiyou and Guanximiyou.

圖2（A）與圖2（B）還顯示，多數(shù)化合物較集中于紅肉蜜柚，此結(jié)果與圖1相同，說明紅肉蜜柚果汁中化合物種類較多。最終結(jié)論顯示，紅肉蜜柚、三紅蜜柚和琯溪蜜柚這3種基因型的果實(shí)果肉香氣組分差異較大，雖紅肉蜜柚化合物種類較三紅蜜柚多，但總相對含量卻低于三紅蜜柚，故三紅蜜柚香氣較紅肉蜜柚和琯溪蜜柚更為濃郁，這個(gè)發(fā)現(xiàn)對于柚子品種的選育上具有一定意義。

2.3 與香氣組分代謝相關(guān)的差異基因轉(zhuǎn)錄組分析

上述試驗(yàn)結(jié)果表明，供試3個(gè)品種果汁中香氣組分種類和相對含量差異明顯，說明這與芽變引起的變異關(guān)系密切。供試3個(gè)品種果汁中香氣組分以醛類的相對含量最高，其次為醇類和酮類，相對含量最高的香氣化合物為己醛。因此，根據(jù)課題組的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[27,28]對α-亞麻酸代謝途徑（α-linolenic acid metabolism）中的相關(guān)基因進(jìn)行KEGG差異表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)新基因（Citrus_maxima_newGene_12651）1個(gè)，表達(dá)差異顯著的脂肪氧化酶（Lipoxidase）LOX2.1基因7個(gè)（cg2g001970、cg2g001980、cg2g002000、cg2g002010、cg2g002030、cg2g002040、cg2g002080）、LOX3.1基因1個(gè)（cg1g010660）和乙醇脫氫酶（Alcohol dehydrogenase）ADH1基因2個(gè)（cg3g017900、cg3g017890），并對其進(jìn)行FPKM值趨勢分析，預(yù)測差異表達(dá)基因的表達(dá)模式，以研究供試3個(gè)品種形成香氣差異的分子機(jī)理。

圖 3 果實(shí)香氣形成的α-亞麻酸代謝途徑KEGG差異表達(dá)分析（部分）Fig. 3 A Part of the alpha-linolenic acid metabolic pathway of differential expression analysis

據(jù)轉(zhuǎn)錄組分析顯示，順式-3-己烯醛（3-Hexenal）的合成受到脂氧合酶LOX2S（1.13.11.12）等酶的調(diào)控（圖3）。在HPL1通路中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)與3-Hexenal的合成相關(guān)的新基因（Citrus_maxima_newGene_12651），根據(jù)KEGG注釋，該新基因是細(xì)胞色素P450家族的一員，可能是氫過氧化物裂解酶（Hydroperoxide lyase，HPL）基因。HPL和丙二烯氧化合酶（allene oxide synthase，AOS）、聯(lián)乙烯醚合酶（divinyl ether synthase，DES）屬于同一個(gè)細(xì)胞色素P450亞家族，與C6醛或醇及相應(yīng)酯的形成有關(guān)[29,30]。而在脂氧合酶（1.13.11.12）代謝通路上，篩選獲得表達(dá)差異顯著的7個(gè)LOX2.1和1個(gè)LOX3.1基因。另外，3-Hexenal通過P類醇脫氫酶通路醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）合成3-己烯-1-醇，經(jīng)過分析也篩選獲得2個(gè)參與了合成3-Hexen-1-ol過程的ADH1基因。

根據(jù)FPKM值的趨勢分析（圖4），新基因Citrus_maxima_newGene_12651在果實(shí)發(fā)育期的表達(dá)差異極其顯著，影響了順式-3-己烯醛合成。3個(gè)品種果實(shí)膨大期（花后120-180 d）以紅肉蜜柚的表達(dá)最為突出。在開花后180 d時(shí)的果肉中，紅肉蜜柚的表達(dá)水平最高，三紅蜜柚次之，琯溪蜜柚最低，這與3個(gè)品種成熟果實(shí)果汁香氣中順式-3-己烯醛的濃度高低趨勢相符，說明它們可能呈正相關(guān)調(diào)控。

分析結(jié)果還顯示，在脂氧合酶（LOX，1.13.11.12）代謝通路中的3個(gè)LOX基因Cg2g002010（LOX2.1）、Cg2g002080（LOX2.1）和Cg1g010660（LOX3.1）差異表達(dá)明顯，花后180 d時(shí)，Cg2g002010（LOX2.1）和Cg2g002080（LOX2.1）基因在紅肉蜜柚和三紅蜜柚果實(shí)中表達(dá)水平較高，在琯溪蜜柚中較低，這兩個(gè)基因可能與順式-3-己烯醛合成呈正相關(guān)調(diào)控，而Cg1g010660（LOX3.1）則相反；而其他5個(gè)LOX基因在花后120 d和花后180 d時(shí)果實(shí)中基本不表達(dá)。

在α-亞麻酸代謝途徑（α-linolenic acid metabolism）中，P類醇脫氫酶ADH1通路（1.1.1.1）影響了乙烯醇和3-己烯-1-醇的合成，其中有2個(gè)ADH1基因（圖4）參與其中，并且在180 d時(shí)，表達(dá)差異極其顯著。Cg3g017890（ADH1）基因表達(dá)水平以紅肉蜜柚最高，琯溪蜜柚只有其一半，三紅蜜柚則最低。Cg3g017900（ADH1）基因則相反，琯溪蜜柚的表達(dá)水平最高，紅肉蜜柚和三紅蜜柚都只有琯溪蜜柚的一半。在3個(gè)品種成熟果實(shí)果汁香氣中，紅肉蜜柚的正己醇和3-己烯濃度最高，三紅蜜柚其次，琯溪蜜柚只有微量。說明上述基因參與了α-亞麻酸代謝途 徑中代謝的調(diào)控。

圖 4 果汁香氣物質(zhì)相關(guān)基因差異表達(dá)FPKM值趨勢分析Fig. 4 Trend analysis of FPKM value in differential expression of related genes related to the fruit juice aroma substances

3 討論與結(jié)論

據(jù)已有研究報(bào)道，柚果實(shí)的主要香氣物質(zhì)是檸檬烯、α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、諾卡酮、芳樟醇等[1]。蒼南四季柚果實(shí)中的主要香氣物質(zhì)為月桂烯、檸檬烯、努特卡酮、β-蒎烯、喇叭茶萜醇[4]。在玉環(huán)柚果實(shí)中，鑒定出檸檬烯、α-蒎烯、月桂烯等29種香氣物質(zhì)[3]。與果皮組織相比，α-蒎烯和月桂烯在柚果實(shí)果肉中香氣更強(qiáng)[2]。

另有研究報(bào)道，葡萄柚果實(shí)的香氣物質(zhì)以γ-松油烯、檸檬烯為主[2]。采用GC-MS方法對葡萄柚香氣活性成分進(jìn)行鑒定。鑒別出了13種風(fēng)味成分，這些成分之前從未在柚子油中報(bào)告過。香氣最強(qiáng)的化合物包括：1，8-桉葉素、辛醛、十二醛、反式-4，5-環(huán)氧-（E）-2-癸醛、-辛烯醛和諾酮。而硫化合物（如4-巰基-4-甲基-2-戊醇和甲硫醇）的香氣活性令人驚訝地低，兩種假定的柚子香氣影響化合物（4-巰基-4-甲基-2-戊酮和1-p-薄荷-8-硫醇）均未檢測到。葡萄柚油中含有200多種揮發(fā)物，但只有38種揮發(fā)物具有顯著的香氣活性，其中22種揮發(fā)物被認(rèn)為是主要的香氣影響化合物[31]。Alberto J.Nunez等采用SDE法結(jié)合GC-MS分析了葡萄柚果汁，鑒定了58種化合物組分，其中25種是當(dāng)時(shí)的首次報(bào)道，發(fā)現(xiàn)同時(shí)采收的來自相同產(chǎn)地、不同時(shí)間的葡萄柚其風(fēng)味化合物的組分上差別不大，但含量差別顯著[6]。

本研究結(jié)果表明，琯溪蜜柚及其芽變紅肉蜜柚、三紅蜜柚3個(gè)品種果實(shí)香氣物質(zhì)含量最多的化合物均為己醛，這與嵇海峰等的研究結(jié)果一致[32]。但芽變品種紅肉蜜柚和三紅蜜柚的己醛等醛類香氣化合物含量顯著高于琯溪蜜柚，可見，這是紅肉突變體的果實(shí)風(fēng)味優(yōu)于琯溪蜜柚的原因。本研究還顯示，雖然紅肉蜜柚香氣化合物種類較三紅蜜柚多，但總相對含量卻低于后者，所以，己醛類物質(zhì)總相對含量高是三紅蜜柚香氣較紅肉蜜柚更為濃郁的原因。研究還表明，醇類和酮類香氣物質(zhì)也是琯溪蜜柚及其芽變品種的主要香氣物質(zhì)。

轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，在α-亞麻酸代謝途徑中出現(xiàn)1個(gè)新基因（Citrus_maxima_newGene_12651），屬于細(xì)胞色素P450的一個(gè)亞家族，推測為HPL基因?？梢?，琯溪蜜柚芽變導(dǎo)致了香氣形成基因的突變。轉(zhuǎn)錄組分析篩選獲得7個(gè)LOX2.1、1個(gè)LOX3.1和2個(gè)ADH1與香氣形成相關(guān)的11個(gè)顯著差異表達(dá)的基因。據(jù)FPKM值的趨勢分析，可初步推測供試3個(gè)品種的果汁香氣組分差異，與脂肪酸途徑、異戊二烯途徑中的基因差異表達(dá)有關(guān)。供試3個(gè)品種的揮發(fā)性物質(zhì)與已報(bào)道的柚子、葡萄柚等柚類果實(shí)存在較大差異，這可能是由基因型差異引起的。在供試3個(gè)琯溪蜜柚及其芽變品種果汁中，也存在倍半萜烯類物質(zhì)的差異，說明在芽變的過程中，倍半萜烯類等途徑也出現(xiàn)異常。在植物中，單萜和倍半萜具有揮發(fā)性，他們是果實(shí)重要的芳香物質(zhì)，這兩類物質(zhì)分別由MVA和MEP途徑形成的。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)了不少香氣組分未知的化合物。這些都值得今后進(jìn)一步研究、驗(yàn)證，以探明芽變引起香氣差異的分子機(jī)理。