王 芬，裴會(huì)敏，文 狄，陳 志，李 靜

（黔南民族師范學(xué)院生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)院，貴州 都勻 558000）

0 引言

【研究意義】假眼小綠葉蟬（Empoasca vitis Gothe）屬葉蟬科，是小綠葉蟬的優(yōu)勢種群，也是茶葉的主要害蟲之一[1,2]，其成蟲和若蟲刺吸為害茶樹新梢、嫩葉，嚴(yán)重影響茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)[3,4]。該蟲1年可發(fā)生9～13代，蟲態(tài)混雜，世代重疊。通常在5～6月份、9～10月份形成2個(gè)蟲口高峰[5,6]，廣泛分布于浙江、福建、貴州、海南、云南、安徽等茶區(qū)，一般可致夏、秋茶損失20%左右[7]，目前主要以物理、化學(xué)和生物方法進(jìn)行防治。通過構(gòu)建被假眼小綠葉蟬侵染和未侵染的茶樹差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPIN）[8?10]，探尋差異基因參與的信號(hào)通路發(fā)生改變的分子機(jī)制，為培育良種茶苗提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】蛋白質(zhì)是茶葉的重要組成成分，占茶鮮葉干物質(zhì)的20%～30%[11?13]。茶樹在抵抗害蟲脅迫時(shí)往往會(huì)表現(xiàn)出抗蟲性狀，合成大量的脅迫誘導(dǎo)蛋白[14]。如何增強(qiáng)茶樹生長適應(yīng)性，提高抗寒、抗旱、抗病等能力，已日益成為茶樹栽培生產(chǎn)和品種選育中亟待解決的問題。杜鵑[15]研究了平陽特早茶樹在Pb脅迫下，接種根內(nèi)球囊菌和未接種的茶樹葉片中蛋白組差異，對(duì)茶樹Pb脅迫的進(jìn)一步探究提供了重要的線索。朱俊慶等[16,17]通過不同茶樹品種對(duì)假眼小綠葉蟬抗性的研究發(fā)現(xiàn)，嫩葉柵狀組織和嫩莖皮層越厚，抗蟲性越強(qiáng)。還有研究者從茶小綠葉蟬侵染烏龍茶和鐵觀音前后茶樹的揮發(fā)物組成和含量都發(fā)生較大的變化的角度，來研究茶樹的抗蟲性[18]。此外，有研究通過外源MeSA誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)茶樹應(yīng)對(duì)假眼小綠葉蟬的取食行為通過產(chǎn)生防御蛋白來抵抗外界的侵害[19]。另外，有研究人員通過分析假眼小綠葉蟬取食嫩葉后的CsRIP1和CsRIP2表達(dá)情況，來研究茶樹防衛(wèi)反應(yīng)[20]在植物與害蟲相互作用機(jī)理方面，大多數(shù)植物在受到害蟲侵害時(shí)，將通過改變體內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)來完成信號(hào)的感應(yīng)和傳遞，從而引起植物相應(yīng)的反應(yīng)，研究相關(guān)蛋白質(zhì)有利于更好地了解生物體應(yīng)對(duì)害蟲侵害時(shí)的分子機(jī)制?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】假眼小綠葉蟬對(duì)茶樹的危害的應(yīng)對(duì)方式目前研究得還不夠深入，因此，亟須構(gòu)建茶樹的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)來探究侵害的分子機(jī)理?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過對(duì)有無受假眼小綠葉蟬侵害的都勻毛尖茶樹鳥王種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，基于同源比對(duì)算法構(gòu)建0 h與12 h、0 h與24 h的差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，在蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上研究茶樹抵御假眼小綠葉蟬侵害，為都勻毛尖病蟲害防治、保證都勻毛尖產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量，對(duì)地方社會(huì)經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

茶葉選用黔南民族師范學(xué)院大棚培養(yǎng)的都勻毛尖茶樹鳥王種扦插苗，假眼小綠葉蟬取自黔南州都勻市螺絲殼茶園。

1.2 假眼小綠葉蟬侵染茶苗

選取9盆長勢一致的茶苗分別放在3個(gè)封閉良好的紗網(wǎng)籠子中，分別標(biāo)記為0 h、12 h和24 h。8月份將從茶園捉來的4齡假眼小綠葉蟬在第2個(gè)籠子和第3個(gè)籠子各放50只，第1個(gè)籠子不放。假眼小綠葉蟬取食0 h、12 h和24 h后，分別在3個(gè)籠子中進(jìn)行采樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。取樣時(shí)要選擇長勢一致相同葉位的嫩葉，置于－80℃冰箱保存，之后送往北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.3 差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將二代得到的轉(zhuǎn)錄本與安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)宛曉春團(tuán)隊(duì)的中國種茶樹基因組[21]進(jìn)行序列比對(duì)，并分析0 h與12 h，0 h與24 h的差異基因，運(yùn)用同源比對(duì)的方法將差異基因與STRING數(shù)據(jù)庫[22]進(jìn)行比對(duì)，利用Cytoscape 3.3.0[23]將比對(duì)上的差異基因進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，最后通過GO和KEGG對(duì)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行注釋。

2.1 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

分別取假眼小綠葉蟬侵染0 h、12 h和24 h的鳥王種嫩葉進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，根據(jù)不同樣品的基因表達(dá)量篩選0 h與12 h、0 h與24 h的差異表達(dá)基因，并利用同源比對(duì)和SRTING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（表1、圖1），圖中紅色的菱形和紫色的V形代表相互作用數(shù)目最多的蛋白，可能是網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，如果將關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)去除，整個(gè)網(wǎng)絡(luò)就會(huì)癱瘓，因此，關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中具有重要的 作用。

表 1 差異基因相互作用數(shù)目Table 1 Number of PPIs in DEGs

圖 1 侵染0 h和侵染24 h差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig. 1 PPINs of DEGs between 0 h and 24 h after infestation

2.2 差異蛋白功能預(yù)測

通過差異基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)可以預(yù)測關(guān)鍵蛋白和蛋白質(zhì)的功能，如果已知一個(gè)蛋白質(zhì)的功能，那么與這個(gè)蛋白相連接的其他蛋白可能具有類似的功能。在假眼小綠葉蟬侵染0 h與12 h的差異基因蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中共212個(gè)互作，其中

TEA027317、TEA020609、TEA009850、TEA015801、TEA007831、TEA002561、TEA007510和TEA010299是連接度最大的8個(gè)蛋白，即可能為關(guān)鍵蛋白。通過GO和KEGG注釋，發(fā)現(xiàn)TEA027317是rac樣GTP結(jié)合蛋白ARAC7，具有GTP酶活性，參與脫落酸激活信號(hào)通路和GTP酶介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)。與其互作的蛋白有19個(gè)，由此可以推出這19個(gè)蛋白也可能具有類似的功能。TEA002561、TEA010299、TEA000210、TEA010470的互作主要參與DNA復(fù)制、堿基切除修復(fù)、核酸切除修復(fù)、錯(cuò)配修復(fù)。TEA000833、TEA030826、TEA027049的相互作用涉及植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。TEA012289與亞油酸和亞麻酸代謝相關(guān)。因此，在假眼小綠葉蟬侵染茶葉的過程中，茶樹通過各種蛋白互作啟動(dòng)相應(yīng)通路來應(yīng)對(duì)假眼小綠葉蟬的侵害。

在假眼小綠葉蟬侵染都勻毛尖葉片0 h和24 h的差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中共有3 551個(gè)互作，TEA019056、TEA009394、TEA027713、TEA003559、TEA021407、TEA022367、TEA027317、TEA009850、TEA020609和TEA015585是度最大的10個(gè)蛋白，也是網(wǎng)絡(luò)中最重要的蛋白。TEA019056是周期蛋白依賴性激酶，具有ATP結(jié)合活性，與之相連的蛋白有139個(gè)，也可能具有類似的功能。對(duì)相互作用的蛋白進(jìn)行GO和KEGG分析，TEA002561、TEA010299、TEA026104、TEA018073、TEA029227、TEA006566、TEA031297、TEA005054、Camellia_sinensis_newGene_2675、TEA031525、TEA019489、TEA020024、TEA021543、TEA010470、TEA016435、Camellia_sinensis_newGene_1068、TEA028102、Camellia_sinensis_newGene_28382的蛋白質(zhì)相互作用主要參與DNA復(fù)制，嘌呤代謝，嘧啶代謝、堿基切除修復(fù)，核酸切除修復(fù)、錯(cuò)配修復(fù)和同源重組。TEA025148、TEA000500、TEA021043、Camellia_sinensis_new Gene_249、TEA008785的互作與植物病原體互作有關(guān)。TEA014197、TEA025845、TEA000833、TEA004537的相互作用主要參與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。TEA012289參與的互作主要進(jìn)行亞油酸代謝和亞麻酸代謝。以上結(jié)果說明，取食24 h比12 h需啟動(dòng)更多的蛋白質(zhì)相互作用來應(yīng)對(duì)假眼小綠葉蟬的侵害，并且需大量的代謝通路來應(yīng)對(duì)外界的侵害。

2.3 差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵傩?/h3>

將0 h與12 h、0 h與24 h的差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行綜合得到合并的差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)共531個(gè)節(jié)點(diǎn)，3 605個(gè)互作。對(duì)3個(gè)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行比較分析，均表現(xiàn)出網(wǎng)絡(luò)的小世界特性。網(wǎng)絡(luò)的聚合系數(shù)、特征路徑長度、最短路徑和半徑表明，它們的全局屬性沒有顯著的差異（表2）。

將0 h與12 h、0 h與24 h的差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)0～12 h與0～24 h共同的互作有158個(gè)，節(jié)點(diǎn)80個(gè)，不同的互作有3 447個(gè)，節(jié)點(diǎn)有525個(gè)（圖2），說明都勻毛尖茶苗在侵染12 h后繼續(xù)啟動(dòng)更多的蛋白互作來應(yīng)對(duì)假眼小綠葉蟬的侵染。

0≤中介中心性的值≤1，Cb(i) = ∑m≠i≠n[σmn(i)/σmn]，m、n和i都是網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)，即蛋白，σmn表示蛋白m和蛋白n之間的最短路徑數(shù)，σmn(i)代表蛋白m到蛋白n之間經(jīng)過蛋白i的最短路徑數(shù)（圖3-a）。接近中心性的值的范圍也在0～1，Cc(i) = 1/avg［S(u,v)］，S(u,v)表示u和v之間的最短路徑，avg［S(u,v)］表示平均最短路徑（圖3-b）。蛋白i的拓?fù)湎禂?shù)是Ti=avg [S(i,j)]/ni。S(i,j)表示i和j共同的相鄰蛋白數(shù)，ni表示i的鄰居數(shù)。度是指蛋白的相互作用數(shù)目，相互作用數(shù)目越多，說明蛋白的度越高，進(jìn)一步說明這個(gè)蛋白越重要。在假眼小綠葉蟬侵染0 h和12 h、0 h和24 h的差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中，我們發(fā)現(xiàn)蛋白的度服從冪律分布（圖3-d），其中0 h與12 h的差異基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中，P(x)≈40.192x?1.248，R2=0.811，相關(guān)性是0.985。0 h與24 h的網(wǎng)絡(luò)中，P(x)≈85.166x?0.956，R2=0.681，相關(guān)性是0.97。說明大部分蛋白的度比較低，少部分的蛋白的度比較高，是一種無尺度現(xiàn)象，說明預(yù)測到的差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)可靠性高。

表 2 三個(gè)網(wǎng)絡(luò)的全局特性Table 2 Global properties of 3 networks

圖 2 0 h與12 h的差異基因互作與0 h與24 h的差異基因互作的重疊數(shù)與差異數(shù)Fig. 2 Number of overlapping and different PPIs between 0-12 h and 0-24 h DEGs

圖 3 假眼小綠葉蟬侵染0 h和24 h的差異基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩訤ig. 3 Topological properties of PPINs in 0 h and 24 h DEGs

3 討論與結(jié)論

利用同源比對(duì)的方法和String數(shù)據(jù)庫預(yù)測出0 h與12 h、0 h與24 h的差異基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)及合并的網(wǎng)絡(luò)，并運(yùn)用Cytoscape 3.3.0將它們可視化，并對(duì)3個(gè)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?，發(fā)現(xiàn)蛋白的度服從冪律分布，說明只有少部分蛋白的相互作用較多，是一種無尺度現(xiàn)象，并且3個(gè)網(wǎng)絡(luò)都表現(xiàn)出小世界特性。但是，0 h與12 h的差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)跟0 h與24 h網(wǎng)絡(luò)的匹配度低，只有158個(gè)重復(fù)，造成這種結(jié)果的原因可能是預(yù)測出的0 h與12 h的差異基因的蛋白質(zhì)相互作用較少所致。

通過蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)可以預(yù)測關(guān)鍵蛋白及蛋白質(zhì)的功能，在合并網(wǎng)絡(luò)中，連接度最大的前10個(gè)蛋白與0 h與24 h的差異基因蛋白網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵蛋白一致，其中TEA027317、TEA020609、TEA009850的度分別為73、69、67，既在假眼小綠葉蟬侵染0 h和12 h的差異基因互作網(wǎng)絡(luò)中，也在0 h和24 h的網(wǎng)絡(luò)中，說明在侵染12 h的過程中這三個(gè)差異基因啟動(dòng)相應(yīng)的互作來抵抗假眼小綠葉蟬的侵害，而在侵染24 h時(shí)，除以上三個(gè)差異基因的互作，繼續(xù)啟動(dòng)更多的互作來進(jìn)行防御，與楊會(huì)敏[24]研究的假眼小綠葉蟬取食后茶樹葉片內(nèi)各種酶活性升高啟動(dòng)更多的酶促反應(yīng)對(duì)害蟲進(jìn)行防御相一致。本研究在蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的基礎(chǔ)上研究茶樹抵御假眼小綠葉蟬侵害，為更深入全面了解其抗病機(jī)理提供理論依據(jù)。

通過對(duì)差異蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中的蛋白進(jìn)行功能預(yù)測，發(fā)現(xiàn)在假眼小綠葉蟬取食茶葉過程中，主要通過植物病原體互作，植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，亞麻酸和亞油酸代謝等代謝通路來抵抗假眼小綠葉蟬的侵染，與前人的研究結(jié)果一致[25,26]。同時(shí)，茶葉在漫長的進(jìn)化過程中，演化出通過產(chǎn)生各種次級(jí)代謝產(chǎn)物抵御蟲害的自我防衛(wèi)機(jī)制[27]。通過對(duì)鳥王種的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)研究為評(píng)價(jià)茶葉及其制品的品質(zhì)及藥用價(jià)值，以及用于解讀茶樹抵御假眼小綠葉蟬侵染的代謝機(jī)理提供參考。對(duì)于選育良種并最終實(shí)現(xiàn)茶葉增產(chǎn)意義重大，為進(jìn)一步開發(fā)和利用都勻毛尖茶資源，促進(jìn)黔南州經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展提供理論依據(jù)。