闞琦繽，劉瑞雪，王曉婭，蘇建青，褚秀玲

（聊城大學農(nóng)學院，山東 聊城 252000）

0 引 言

【研究意義】抗生素類飼料添加劑的禁用，導致畜禽消化道疾病的高發(fā)，而氧化應激是造成消化道損傷的重要因素[1]。臨床研究顯示刺五加［Acanthopanax senticosus （Rupr. Maxim.） Harms］對畜禽消化道具有較好的抗氧化作用，而刺五加總黃酮是其中主要的抗氧化成分[2,3]。通過現(xiàn)代化的提取技術，高效提取刺五加總黃酮，能夠緩解刺五加原料藥材的緊缺狀況，評價其抗氧化能力，開發(fā)新型中藥飼料添加劑，應用于畜禽臨床養(yǎng)殖，對預防畜禽消化道疾病具有重要意義。【前人研究進展】王彥博等[4]采用正交試驗優(yōu)化了麥積山野生刺五加黃酮的提取工藝，發(fā)現(xiàn)提取溫度和料液比對黃酮得率影響顯著（P＜0.05），優(yōu)化后總黃酮得率為（28.11±0.19 ）mg·g?1，并評價了提取物清除DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基和總抗氧化能力的作用，顯示提取物的抗氧化能力均優(yōu)于對照品L-抗壞血酸。高騰等[5]采用響應面優(yōu)化了刺五加莖皮黃酮的提取工藝，結果顯示提取溫度和提取時間對黃酮得率影響顯著（P＜0.05），黃酮的最大得率為38.0 mg·g?1。吳桐等[6]用正交試驗優(yōu)化了快速溶劑萃取法提取刺五加葉中的蘆丁，結果顯示提取溫度和循環(huán)次數(shù)對蘆丁的得率影響差異顯著（P＜0.05），蘆丁得率達到0.155 mg·g?1。響應面法是一種解決多變量問題的統(tǒng)計方法，能利用合理性試驗設計，采用多元二次回歸方程擬合因素與響應值之間的函數(shù)關系，分析回歸方程來尋求最優(yōu)的工藝參數(shù)[7]?！颈狙芯壳腥朦c】前人關于提取刺五加根莖總黃酮的研究鮮有報道，抗氧化活性是評價其提取效果的關鍵因素?！緮M解決的關鍵問題】本試驗擬通過響應面法優(yōu)化刺五加總黃酮的超聲波輔助乙醇提取工藝，在單因素試驗的基礎上，通過Box-Benhnken Design響應面優(yōu)化，獲得超聲波輔助乙醇提取刺五加總黃酮的最佳提取工藝，并通過體外抗氧化試驗評價刺五加總黃酮的抗氧化能力，為刺五加臨床的高效應用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺五加飲片（聊城利民大藥房），蘆丁標準品（中國藥品生物制品檢定所），RAW264.7細胞（中國科學院干細胞庫），RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Hyclone公司），胎牛血清（美國Gibco公司），CCK-8試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），試驗中所用其 他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

LE203E/02電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SB-600DTY超聲波多頻清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；UV-5900紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；1530酶標儀 ，賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 試驗流程

刺五加飲片→清洗干燥（60 ℃）→粉碎過篩（60目）→超聲波浸提→過濾→測定總黃酮得率→AB-8 樹脂純化→體外抗氧化能力評價。

1.4 試驗方法

1.4.1 刺五加總黃酮提取工藝優(yōu)化

1.4.1.1 蘆丁標準曲線的制備 采用本實驗室建立的標 準曲線制作方法[5]制備蘆丁標準曲線。

1.4.1.2 刺五加總黃酮的提取 稱取2 g刺五加干粉放入150 mL錐形瓶中，加入乙醇溶液并搖晃均勻，然后放入超聲波清洗儀中進行提取試驗。采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH的顯色體系[8]測量溶液中刺五加總黃酮 的得率。

1.4.1.3 單因素試驗 本試驗選用乙醇-水混合溶劑體系，準確稱取2.0 g刺五加干粉，采用控制變量法分別對乙醇體積分數(shù)、液料比、提取時間、提取溫度進行探究，考查各因素對刺五加總黃酮得率的影響 。各因素條件見表1。

1.4.1.4 響應面試驗 在單因素試驗基礎上，依據(jù)Box-Benhnken Design原理，將刺五加總黃酮得率（Y）作為響應值，選取乙醇體積分數(shù)（A）、液料比（B）、提取時間（C）和提取溫度（D），設計四因素三水平響應面試驗，以優(yōu)化刺五加總黃酮提取工藝。各因素 水平見表2。

1.4.1.5 驗證試驗 采用響應面優(yōu)化后的最佳提取工藝，對刺五加進行3次平行提取，驗證新工藝的刺五 加總黃酮得率。

1.4.1.6 刺五加總黃酮純化 根據(jù)響應面優(yōu)化條件提取刺五加總黃酮，并參照Xie 等[9]研究的大孔樹脂純化總黃酮方法，純化刺五加總黃酮提取液。將純化后的刺五加總黃酮提取液減壓濃縮至總黃酮質量濃度為2.5 mg·mL?1，置于?20 ℃保存，用于體外抗氧化試驗。1.4.1.7 細胞培養(yǎng) RAW264.7細胞采用含有10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi) 培養(yǎng)。待細胞生長至80%～90%時進行傳代培養(yǎng)。1.4.1.8 H202誘導RAW264.7細胞氧化損傷模型 取對數(shù)生長期細胞，將細胞密度調(diào)整為5×104個·mL?1，以每孔200 μL接種于96孔板。待細胞生長至80%～90%時，吸去培養(yǎng)基，并使用PBS清洗一遍。加入200 μL含有不同體積分數(shù)H2O2的無血清1640培養(yǎng)基，孵育2 h后采用CCK-8法[10]計算細胞存活率。CK組使用不含H202的無血清1640培養(yǎng)基。每個試驗 組設定6個重復孔。

表 1 單因素試驗水平Table 1 Level of single factor experiment

表 2 四因素三水平響應面試驗Table 2 Response surface experiment of 4 factors and 3 levels

1.4.1.9 刺五加總黃酮提取液對RAW264.7細胞氧化損傷的保護作用 取對數(shù)生長期細胞，將細胞密度調(diào)整為5×104個·mL?1，以每孔200 μL接種于96孔板。將細胞分為CK組、H2O2組、H2O2+刺五加總黃酮低劑量（30 μg·mL?1）組、H2O2+刺五加總黃酮中劑量（60 μg·mL?1）組、H2O2+刺五加總黃酮高劑量（90 μg·mL?1）組。待細胞生長至80～90%時，吸去培養(yǎng)基，并使用PBS清洗一遍。刺五加黃酮組給予相應計量的刺五加總黃酮作用24 h，CK組和H2O2組以無血清1640培養(yǎng)基代替刺五加總黃酮。處理結束后去除培養(yǎng)基，使用PBS清洗一遍后加入含有400 μM H2O2的無血清1640培養(yǎng)基作用2h，CK組使用無血清1640培養(yǎng)基代替 H2O2。采用CCK-8法計算細 胞存活率。

1.4.2 刺五加總黃酮提取工藝優(yōu)化

1.4.2.1 DPPH自由基清除能力 按照Sridhar Kandi等[11]的方法測定刺五加總黃酮提取液的DPPH自由基清除活性，并計算清除率和半數(shù)抑制濃度（IC50）。以同等質量濃度的L-抗壞血酸作陽性對照。

式中，A1：空白組吸光值；A2：刺五加總黃酮組吸 光值；A3：黃酮背景組吸光值

1.4.2.2 ABTS自由基清除能力測定 參考Zhao Z Y等[12]的方法，測定刺五加總黃酮提取液對ABTS自由基的清除活性，并計算清除率和半數(shù)抑制濃度（IC50）。以同等質量濃度的L-抗壞血酸作陽性對照。

式中，B1：空白組吸光值；B2：刺五加總黃酮組吸 光值；B3：黃酮背景組吸光值。

1.4.2.3 羥基自由基清除能力測定 采用Dai C Y等[13]的研究方法測定刺五加總黃酮提取液對羥基自由基的清除活性，并計算清除率和半數(shù)抑制濃度（IC50）。以同等質量濃度的L-抗壞血酸作陽性對照。

式中，C1：空白組吸光值；C2：刺五加總黃酮組 吸光值；C3：黃酮背景組吸光值

1.4.2.4 總還原能力測定 按照Shang H M等[14]的研究方法測定刺五加總黃酮提取液的總還原能力，以同 等質量濃度的L-抗壞血酸作陽性對照。

1.5 數(shù)據(jù)分析

每1組試驗重復3次，試驗結果數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示。利用 Design Expert 10.0.7 軟件進行響應面設計和結果分析；使用 GraphPad Prism 8.0.1軟 件進行作圖；使用 SPSS 22.0 進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 蘆丁標準曲線

如圖1所示，當黃酮質量濃度在0～50 μg·mL?1時，方程線性關系良好，可用于測定刺五加總黃酮得 率。

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇體積分數(shù)對刺五加總黃酮得率的影響 如圖2所示，當乙醇從30%增加到50%，刺五加總黃酮得率逐步提高；當乙醇超過50%，刺五加總黃酮得率與乙醇濃度呈負相關趨勢。說明乙醇-水相系統(tǒng)的濃度不同，其極性也不同，對黃酮分子的萃取能力也有變化[15]。在乙醇為50%時，溶劑的萃取能力最強，刺五加總黃酮得率達到最高值（18.58±0.32 ）m g·g?1。

2.2.2 液料比對刺五加總黃酮得率的影響 液料比是影響黃酮得率的一個重要因素，較高的液料比可以增加黃酮分子與溶劑的質量傳遞，從而提高黃酮得率[16]；如圖3所示，當液料比從10 mL·g?1增加至40 mL·g?1，總黃酮得率增長較為明顯，并在40 mL·g?1達 到峰值（19.39±0.17） mg·g?1。

圖 1 蘆丁標準曲線Fig. 1 Standard curve of rutin

圖 2 乙醇體積分數(shù)對刺五加總黃酮得率的影響Fig. 2 Effect of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoids

2.2.3 提取時間對刺五加總黃酮得率的影響 由圖4可知，提取時間從25 min增加到70 min，刺五加總黃酮得率持續(xù)上升；當時間超過70 min時，黃酮得率隨時間增長而下降，在70 min達到最高值（17.04±0.19 ）mg·g?1。其原因可能是超聲波會對黃酮分子產(chǎn)生空化作用，提取時間過長將導致黃酮化合物分解，致使得率下降[17]。

圖 3 液料比對刺五加總黃酮得率的影響Fig. 3 Effect of liquid-solid ratio on extraction yield of total flavonoids

圖 4 提取時間對刺五加總黃酮得率的影響Fig. 4 Effect of extraction time on yield of total flavonoids

2.2.4 提取溫度對刺五加總黃酮得率的影響 如圖5

所示，當提取溫度從40 ℃提高到70 ℃，刺五加總黃酮得率逐步提高，在70 ℃時，總黃酮得率達到最高值（18.86±0.25 ）mg·g?1；當提取溫度升高至80 ℃時，總黃酮得率出現(xiàn)下降。其原因可能是較高的提取溫度，能夠增加分子的運動速度，加快溶劑的滲透作用，從而使黃酮類化合物迅速擴散到溶劑中[18]。但是提取溫度過高將導致部分黃酮類化合物分解[19]，降低刺五加總黃酮的提取率。

圖 5 提取溫度刺五加總黃酮得率的影響Fig. 5 Effect of extraction temperature on yield of total flavonoids

2.3 響應面優(yōu)化試驗

2.3.1 響應面試驗設計和模型擬合 根據(jù)單因素試驗結果，將刺五加總黃酮得率作為響應值，選取乙醇濃度、提取時間、液料比和提取溫度設計四因素三水平響應面優(yōu)化試驗，共29組。結果見表3。利用Design Expert 10.0.4軟件對表3數(shù)據(jù)進行二次回歸擬合，得到回歸方程如下：

其中：Y為刺五加總黃酮得率（mg·g?1）；A為乙醇（%）；B為液料比（mL·g?1）；C為提取時間（ min）；D為提取溫度（℃）。

2.3.2 響應面試驗數(shù)據(jù)方差分析 對表3數(shù)據(jù)進行方 差分析，結果見表4，模型P＜0.000 1，說明模型所得方程與實際數(shù)據(jù)擬合較好，可用該模型設計試驗優(yōu)化刺五加總黃酮的提取。失擬項P＞0.05，說明該試驗誤差小，模型殘差由隨機誤差產(chǎn)生。其中：一次項A、B、C、D的P＜0.01，說明乙醇、提取時間、液料比和提取溫度對刺五加總黃酮得率的影響極顯著；交互項AC、AD、BC、CD的P＜0.05，說明乙醇與提取時間，乙醇與提取溫度，液料比與提取時間，提取時間與提取溫度間的交互作用影響顯著；二次項A2、B2、C2、D2的P＜0.01，說明對刺五加總黃酮得率的影響均極顯著。

表 3 響應面試驗結果Table 3 Results of response surface experiment

使用軟件繪制響應面三維曲線，如圖6所示，可直觀表現(xiàn)各因子對響應值的影響趨勢，響應面圖中曲線走勢越陡，表明該因素對黃酮得率影響越大，如走勢平滑，則影響較小。由圖6可知，乙醇（A）、料液比（B）、提取時間（C）和提取溫度（D）的曲線均較陡，說明他們對提取率影響均較大，與表4分析一致。等高線的形狀能反映出兩因素交互作用的程度，橢圓形說明交互作用顯著，若為圓形則反之。由圖6可知，圖6（B）、6（C）、6（D）和6（F）的等高線表現(xiàn)為橢圓形且較為緊密，說明乙醇與提取時間，乙醇與提取溫度，液料比與提取時間，提取時間與提取溫度之間交互作用明 顯。

2.3.3 驗證試驗 根據(jù)建立的模型預測刺五加總黃酮最佳提取工藝，即乙醇55%，提取時間73 min，液料比45∶1，提取溫度72 ℃，進行3次提取試驗，測得刺五加總黃酮實際得率為（24.11±0.17） mg·g?1，與 預測值23.89 mg·g?1接近（表5）。

2.3.4 刺五加總黃酮純化 經(jīng)過AB-8樹脂純化后，刺五加總黃酮純度由純化前24.75%±0.54%提高至47.65%±0.032%。經(jīng)過純化后，刺五加總黃酮純度約是純化前的2倍，提升了刺五加總黃酮的質量，可 用于后續(xù)抗氧化試驗。

2.4 刺五加總黃酮體外抗氧化試驗

2.4.1 DPPH自由基清除試驗 如圖7所示，質量濃度在10～100 μg·mL?1區(qū)間內(nèi)，刺五加總黃酮提取液對DPPH自由基的清除活性隨濃度的增加而增加。刺五加總黃酮在10～60 μg·mL?1時，清除活性迅速增強；當超過60 μg·mL?1時，對DPPH自由基的清除活性趨于平緩。刺五加總黃酮提取液和L-抗壞血酸對DPPH自由基的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為28.38 μg·mL?1和15.90 μg·mL?1，刺五加總黃酮提取液DPPH自由基清除能力是L-抗壞血酸的55.21%。當質量濃度達到100 μg·mL?1時，刺五加總黃酮提取液和L-抗壞血酸對DPPH自由基的清除率分別為8 8.26%和98.80%。

表 4 響應面試驗方差分析Table 4 Variance analysis of response surface experiment

2.4.2 ABTS自由基清除試驗 由圖8可知，刺五加總黃酮提取液對ABTS自由基的清除活性與濃度成正相關。同等質量濃度下，L-抗壞血酸對于ABTS自由基的清除能力要強于刺五加總黃酮提取液，刺五加總黃酮提取液和L-抗壞血酸對ABTS自由基的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為103.77 μg·mL?1和59.88 μg·mL?1，刺五加總黃酮對ABTS自由基的清除能力為L-抗壞血酸的57.70%。當質量濃度為300 μg·mL?1時，刺五加總黃酮提取液和L-抗壞血酸對ABTS自由基的最大 清除率分別為93.64%和99.23%。

2.4.3 羥基自由基清除試驗 如圖9所示，刺五加總黃酮提取液和L-抗壞血酸對羥基自由基的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為228.70 μg·mL?1和114.12 μg·mL?1，刺五加總黃酮對于羥基自由基的清除能力是L-抗壞血酸的49.90%。雖然刺五加總黃酮提取液對羥基自由基的清除活性和濃度呈正相關，但增長趨勢較為平緩。當質量濃度為300 μg·mL?1時，刺五加總黃酮提取液和L-抗壞血酸對羥基自由基的清除率分別為6 2.82%和85.33%。

2.4.4 總還原能力測定 刺五加總黃酮的還原能力由吸光值的高低表示，吸光值越高其還原能力越強。如圖10所示，隨著刺五加總黃酮濃度的提高，吸光值也隨之快速升高。當質量濃度在10～100 μg·mL?1范圍內(nèi)，刺五加總黃酮提取液吸光值從0.09增加到0.76；L-抗壞血酸吸光值從1.13增加到1.25。在質量濃度為100 μg·mL?1時，刺五加總黃酮提取液的總還原 能力占L-抗壞血酸的61.04%。

2.5 刺五加總黃酮對RAW264.7細胞氧化損傷保護作 用

2.5.1 建立H2O2氧化損傷模型 如圖11所示，當H2O2濃 度 從100 μmol·L?1增 加 到1000 μmol·L?1，RAW264.7細胞存活率下降明顯，說明H2O2對RAW264.7細胞產(chǎn)生氧化損傷作用，致使部分細胞死亡。H2O2對RAW264.7細胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）為391.4 μmol·L?1，為了方便后續(xù)試驗，因此選擇400 μ mol·L?1為RAW264.7細胞建模濃度。

圖 6 兩因素間交互作用對刺五加總黃酮得率的影響Fig. 6 Effect of interaction between two factors on extraction of total flavonoids

表 5 刺五加總黃酮最佳提取條件Table 5 Optimized conditions for flavonoid extraction from A.senticosus

圖 7 DPPH自由基清除活性Fig. 7 DPPH free radical scavenging ability of extracted flavonoids

圖 8 ABTS+自由基清除活性Fig. 8 ABTS+ free radical scavenging ability of extracted flavonoids

2.5.2 刺五加總黃酮對RAW264.7細胞氧化損傷保護試驗 如圖12所示，H2O2組細胞活性與CK組相比

圖 9 羥基自由基清除活性Fig. 9 Hydroxyl free radical scavenging ability of extracted flavonoids

圖 10 刺五加總黃酮還原能力Fig. 10 Reducing power of flavonoids extract from A. senticosus

圖 11 H2O2對RAW264.7細胞增殖的影響Fig. 11 Effects of H2O2 on proliferation of RAW264.7 cells

下降明顯，說明H2O2對RAW264.7細胞造成了一定的氧化損傷。刺五加總黃酮提取液高、中、低組（90、60、30 μg·mL?1）與H2O2組相比，RAW264.7細胞活性明顯提高，說明刺五加總黃酮對RAW264.7細胞氧化損傷有較強的保護作用。

圖 12 刺五加總黃酮對RAW264.7細胞氧化損傷保護作用Fig. 12 Effect of extracted flavonoids in protecting oxidative damage on RAW264.7 cells

3 討論與結論

刺五加傳統(tǒng)的提取方法主要是水提法和醇提法，具有使用操作簡便、成本低和適用性廣的優(yōu)勢，但是隨著中藥的用量增加，中藥成本的升高，需要用更先進的現(xiàn)代化提取技術進行提取。超聲波輔助提取具有提取時間短，提取溫度低和提取效率高等優(yōu)點，溫和的提取條件能夠更好地保護提取物的活性，減少對有效成分的破壞。優(yōu)化方法常用的有正交設計法和響應面法，正交設計法選取的試驗點并不能完全反應整體的情況，且最終結果僅是對所選水平的優(yōu)化，而響應面法將數(shù)據(jù)進行多項式擬合后，以圖形表達函數(shù)關系，且能檢查出各因素之間的交互性，具有更好的優(yōu)化作用。本試驗用響應面優(yōu)化出的提取條件是：乙醇55%，提取時間73 min，液料比45 mL·g?1，提取溫度72 ℃，總黃酮得率達到24.11 mg·g?1。和傳統(tǒng)的溶劑提取法相比，超聲波輔助提取法具有提取時間短、提取溫度低和提取效率高的優(yōu)點。

提取物的活性是評價其提取效果更重要的因素，畢竟提取物最終的藥效才是其臨床應用的關鍵價值。氧化應激是體內(nèi)氧化與抗氧化作用調(diào)節(jié)失衡，氧化作用處于優(yōu)勢地位，導致機體細胞出現(xiàn)炎性浸潤，從而產(chǎn)生過量的氧化中間產(chǎn)物，對機體造成損傷，降低機體的免疫功能[20]。目前，對于中藥提取物的抗氧化活性測定主要集中于體外氧化自由基清除試驗[21]。結果表明，刺五加總黃酮提取液對3種自由基都具有一定的清除能力，并且劑量依賴性顯著。其中刺五加總黃酮提取液對DPPH自由基、ABTS自由基、羥基自由基清除能力的IC50值為28.38 μg·mL?1、107.77 μg·mL?1和228.70 μg·mL?1，分別是L-抗壞血酸IC50值的55.21%、57.70%和49.90%。但是，隨著質量濃度的提高，刺五加總黃酮提取液同L-抗壞血酸對3種自由基清除率的差異逐漸縮小。刺五加總黃酮提取液的總還原能力與質量濃度呈正相關，當質量濃度達到100 μg·mL?1，刺五加總黃酮提取液的總還原能力是L-抗壞血酸的0.61倍。其次，試驗通過H2O2刺激RAW264.7細胞建立氧化損傷模型，結果表明，30 μg·mL?1、60 μg·mL?1、90 μg·mL?1的刺五加總黃酮組與H2O2處理組比較，均具有顯著的抗氧化損傷作用，差異性顯著（P＜0.05）。由此可見，刺五加總黃酮提取液具有較好的體外抗氧化活性，為刺五加活性成分的深入研究奠定了一定的理論基礎。