黃濤，崔泳

(新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院骨科，新疆 烏魯木齊 830000)

激素性股骨頭壞死(steroid induced femoral head necrosis，SFHN)從發(fā)生起3年內(nèi)便可發(fā)生股骨頭塌陷，最終超過65%的患者不得不接受髖關(guān)節(jié)置換手術(shù)，給患者家庭和社會(huì)帶來了巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1-2]。然而，SFHN的發(fā)病機(jī)制方面的研究還有限。研究表明miRNA-27α的許多靶向基因與骨重建和骨骼發(fā)育有關(guān)[3]。如miRNA-27α通過直接抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor，PPARγ)的表達(dá)發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能[4-5]。我們的前期研究表明，載脂蛋白A5(apolipoprotein A5，ApoA5)的兩個(gè)等位基因(rs662799和rs3135506)均與國人股骨頭壞死密切相關(guān)[6]。

動(dòng)物模型的建立對(duì)于評(píng)價(jià)藥物是否有臨床價(jià)值具有重要的意義。本研究選擇大鼠做動(dòng)物模型，是因?yàn)榇笫笥?0%基因與人類一致，同時(shí)構(gòu)建成功率高，發(fā)生骨壞死的病理特征也與人類一致。同時(shí)大鼠與人類的股骨頭形狀有著較為類似的前傾角和頸干角，力學(xué)性能可能更接近人類[3]。本研究擬通過構(gòu)建激素性股骨頭大鼠模型，在模型成立前腹腔注射含高表達(dá)和低表達(dá)miRNA-27α質(zhì)粒的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)細(xì)胞懸液，進(jìn)一步觀察股骨頭壞死進(jìn)展情況。探討激素調(diào)控鼠股骨頭內(nèi)miRNA-27α的表達(dá)機(jī)制，進(jìn)一步分析下游靶基因PPARγ和ApoA5的表達(dá)，最終為有效地干預(yù)SFHN的進(jìn)展提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 激素型股骨頭壞死大鼠模型構(gòu)建和分組 30只SPF級(jí)SD雌性大鼠(體重200～230 g)購自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(動(dòng)物合格證號(hào)：NO.801205226112)。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字法分為5組，每組6只，分別為生理鹽水肌注組，甲潑尼龍肌注4周組，甲潑尼龍4周+轉(zhuǎn)染含miRNA-27α mimics慢病毒BMSCs細(xì)胞懸液組，甲潑尼龍4周+轉(zhuǎn)染含miRNA-27α inhibitor慢病毒BMSCs細(xì)胞懸液組，甲潑尼龍4周+轉(zhuǎn)染含空載慢病毒BMSCs細(xì)胞懸液組。所有需甲潑尼龍注射組(模型組)給予腹腔注射脂多糖(20 ng/kg，溶于1 mL生理鹽水中，Sigma，美國)，24 h后兩側(cè)臀肌交替注射甲潑尼龍(40 mg/kg，溶于1 mL生理鹽水中，輝瑞，美國)3次，每次間隔24 h。空白對(duì)照組腹腔及臀肌注射等量(1 mL)生理鹽水。本研究獲得新疆醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 組織病理學(xué)檢查 將股骨置入中性甲醛溶液固定72 h后，使用30%甲酸脫鈣3 d，脫鈣完全后梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片厚度4um，常規(guī)伊紅-蘇木精(hematoxylin eosin，HE)染色。骨壞死定義：HE染色觀察到空骨陷窩形成、骨髓壞死、骨小梁斷裂為骨壞死形成。

1.3 BMSCs的分離與培養(yǎng) 磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)沖洗大鼠股骨骨髓，獲得BMSCS，用Percoll溶液重懸(密度1.083)，室溫下以2 500 rpm離心20 min，并用PBS洗滌兩次。細(xì)胞在含有10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)，100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的Dulbecco’s改良Eagle培養(yǎng)基：營養(yǎng)混合物F-12(dulbecco’s modified eagle media：nutrient mixture F-12，DMEM/F12)1︰1完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待細(xì)胞匯合度為90%時(shí)，用含有0.02%乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)的胰蛋白酶消化后傳代。

1.4 miRNA-27α mimics和inhibitor慢病毒的構(gòu)建 向培養(yǎng)好的BMSCs中加入含目的序列(miRNAbas查詢miRNA-27α的序列GCGGCGGTTCACAGTGG CTAAG)的穿梭質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)混勻。配置轉(zhuǎn)染混合物，逐滴加入15 cm培養(yǎng)皿中后溫育。離心后收集病毒用于轉(zhuǎn)染。

1.5 慢病毒轉(zhuǎn)染BMSCs 實(shí)驗(yàn)前1天將細(xì)胞按照(3～5)×103的濃度接種于96孔板中，每孔加培養(yǎng)基100 μL。確定Polybrene是否可以促進(jìn)轉(zhuǎn)染及最佳感染復(fù)數(shù)值(multiply of infection，MOI)，按MOI分別加入不同分組的慢病毒mimics、inhibitor、vector，同時(shí)每瓶T75加入5 μg/mL polybrene，共同培養(yǎng)后熒光觀察。

1.6 干細(xì)胞注射 造模后4周進(jìn)行干細(xì)胞注射。具體步驟如下：準(zhǔn)備已經(jīng)轉(zhuǎn)染慢病毒的干細(xì)胞。將大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后，膝關(guān)節(jié)正中縱形切口切開膝關(guān)節(jié)皮膚，以髕韌帶為定位。向股骨髓腔注射200 μL，約含106個(gè)的BMSCs。飲用水中給予口服阿莫西林抗感染1周。

1.7 骨組織RNA的提取和qPCR 用miRNAeasy試劑盒(Qiagen，USA)分離骨組織總RNA(包括miRNA)。分析提取RNA的濃度和純度后用兩步RT-PCR試劑盒(全式金，北京)合成互補(bǔ)DNA(cDNA)。采用Peimer 5.0設(shè)計(jì)引物，由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物信息見表1。qPCR反應(yīng)在Roche LightCycler 480 Ⅱ熒光定量PCR儀上進(jìn)行，每板上設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品(所有樣品的混合溶液，重復(fù)3次)和1個(gè)陰性對(duì)照(水)。

表1 引物序列及基因長度

1.8 細(xì)胞增殖與活力檢測 細(xì)胞增殖采用CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega，北京)試劑盒測定。

用5 μg/mL熒光素二乙酸酯(fluorescein diacetate，F(xiàn)DA)(Life Technologies，USA)和20 μg/mL碘化丙啶(propidium iodide，PI)(Life Technologies)在PBS中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。在激光掃描共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察和拍攝，判斷細(xì)胞活力。

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)物模型的一般結(jié)果 模型構(gòu)建過程中，模型組和對(duì)照組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物精神良好，體型健康，無其他疾病發(fā)生，體重逐漸增加。對(duì)照組體重增加(41.28±3.61)g，模型組體重增加(40.38±4.02)g。對(duì)大鼠對(duì)照組和模型組股骨頭HE染色分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組股骨頭內(nèi)骨小梁的結(jié)構(gòu)完整，無斷裂相比，激素誘導(dǎo)大鼠股骨頭切片顯示骨小梁出現(xiàn)稀疏、斷裂、排列紊亂，同時(shí)骨小梁的面積顯著減少(見圖1)。

a 對(duì)照組 b 模型組

2.2 激素誘導(dǎo)大鼠股骨頭BMSCs分離 新鮮分離和培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁生長，大多數(shù)呈多邊形形態(tài)(圖2a)。3周后，骨髓基質(zhì)細(xì)胞形態(tài)類似于成纖維細(xì)胞，幾乎沒有污染細(xì)胞(圖2b)。

a 新鮮培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 b 分化后的骨髓基質(zhì)細(xì)胞形態(tài)

2.3 激素誘導(dǎo)大鼠股骨頭壞死模型中miRNA-27α的表達(dá) qPCR分析對(duì)照組及激素誘導(dǎo)大鼠股骨頭壞死模型組中的miRNA-27α的表達(dá)水平(見圖3)。與對(duì)照組相比，模型組中miRNA-27α的含量顯著降低(P<0.05)。

圖3 miRNA-27α在對(duì)照組和SFHN模型中的表達(dá)

2.4 激素誘導(dǎo)大鼠股骨頭壞死模型中PPARγ、ApoA5的mRNA表達(dá) 應(yīng)用qPCR檢測對(duì)照組及激素誘導(dǎo)大鼠股骨頭壞死模型組中PPARγ和ApoA5 mRNA表達(dá)(見圖4)。與對(duì)照組相比，PPARγ和ApoA5 mRNA表達(dá)水平在激素誘導(dǎo)大鼠股骨頭壞死模型組中均顯著升高(P<0.05)。

圖4 PPARγ和ApoA5在對(duì)照組和SFHN模型中的表達(dá)

2.5 激素誘導(dǎo)大鼠股骨頭壞死模型中mi RNA-27α與PPARγ和ApoA5的相關(guān)性分析 PPARγ與miRNA-27α呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，其中相關(guān)系數(shù)R2=0.725；ApoA5與miRNA-27α也呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)R2=0.683(見圖5)。

2.6 注射miRNA-27α mimics/inhibitor BMSCs細(xì)胞后大鼠PPARγ和ApoA5表達(dá)變化 注射miRNA-27αmimics/inhibitor BMSCs細(xì)胞后PPARγ和ApoA5表達(dá)變化見圖6。結(jié)果表明，相對(duì)于肌注甲潑尼龍組，同時(shí)注射甲潑尼龍和miRNA-27α mimics組，PPARγ和ApoA5 mRNA表達(dá)水平均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而同時(shí)注射甲潑尼龍和miRNA-27α inhibitor組PPARγ和ApoA5 mRNA表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)。

2.7 注射miRNA-27α mimics/inhibitor BMSC細(xì)胞對(duì)股骨頭BMSCs增殖和活力的影響 從第2天到第8天，對(duì)照組的細(xì)胞增殖水平明顯高于甲潑尼龍誘導(dǎo)的股骨頭壞死組，添加miRNA-27α mimics組細(xì)胞增殖水平顯著高于miRNA-27α inhibitor組(見圖7)。細(xì)胞活力結(jié)果如圖7所示，添加甲潑尼龍組軟骨細(xì)胞的存活率都顯著降低，但同時(shí)添加甲潑尼龍和miRNA-27α inhibitor組產(chǎn)生了更大的抑制作用。說明miRNA-27α能延緩甲潑尼龍產(chǎn)生對(duì)BMSCs產(chǎn)生的抑制作用。這些結(jié)果與細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖5 SFHN模型中miRNA-27α與PPARγ和ApoA5的相關(guān)性分析 圖6 注射miRNA-27α mimics/inhibitor BMSC細(xì)胞后大鼠股骨頭PPARγ和ApoA5表達(dá)變化

注：miRNA-27α inhibitor/mimics處理后對(duì)BMSCs活性和凋亡影響

3 討 論

酗酒和長期使用激素藥物是導(dǎo)致FHN的主要因素[7-9]。激素可引起高脂血癥，進(jìn)而影響股骨頭微循環(huán)從而在多方面導(dǎo)致股骨壞死，如微血管內(nèi)脂肪栓子形成等[10-12]。甲潑尼龍是臨床上常用的糖皮質(zhì)激素類藥物。本研究目的之一是通過甲潑尼龍誘導(dǎo)建立大鼠股骨頭壞死的體外模型。結(jié)果表明，與正常小鼠相比，激素誘導(dǎo)大鼠股骨頭切片顯示骨小梁出現(xiàn)稀疏、斷裂、排列紊亂，同時(shí)骨小梁的面積顯著減少。該結(jié)果得到了先前發(fā)表的研究的支持[13-14]。

miRNAs是多種生理過程的有效調(diào)節(jié)因子，包括細(xì)胞增殖、分化和凋亡[15]。最近有報(bào)道稱miRNAs對(duì)成骨細(xì)胞分化的調(diào)控至關(guān)重要[16-17]。Schoolmeesters等[10]在研究人間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化時(shí)發(fā)現(xiàn)，miR-148b、miRNA-27α、miR-489參與調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。其中，miRNA-27α的許多靶向基因與骨重建和骨骼發(fā)育有關(guān)。已有研究證明，PPARγ的3′-UTR區(qū)域包含miRNA-27α結(jié)合位點(diǎn)，miRNA-27α通過直接抑制PPARγ的表達(dá)發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能[9-10]。同時(shí)，Vu-dacN等[11]發(fā)現(xiàn)ApoA5啟動(dòng)子上包含過氧化物酶體增殖物反應(yīng)元件(peroxisome proliferators responsive element，PPRE)是PPARγ的靶基因。我們的前期研究中也顯示，ApoA5的兩個(gè)等位基因(rs662799和rs3135506)均與國人股骨頭壞死密切相關(guān)[12]。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，激素誘導(dǎo)大鼠股骨頭壞死模型組中miRNA-27α的含量顯著降低，而PPARγ和ApoA5 mRNA表達(dá)水平在激素誘導(dǎo)大鼠股骨頭壞死模型組中均顯著升高，PPARγ和ApoA5與miRNA-27α表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

骨髓基質(zhì)細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化的過程中多種因子調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子PPARγ的表達(dá)，引起骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化減少，最終導(dǎo)致股骨頭發(fā)生壞死[18]。PPARγ基因突變的小鼠脂肪細(xì)胞分化受抑制的同時(shí)，成骨細(xì)胞分化的相關(guān)基因高表達(dá)，成骨細(xì)胞大量分化[19]。ApoA5啟動(dòng)子上包含PPRE反應(yīng)元件，是PPARγ的靶基因，并且干預(yù)骨髓干細(xì)胞的成脂成骨分化，而miRNA-27α的許多靶向基因與骨重建和骨骼發(fā)育有關(guān)。本研究中，相對(duì)于肌注甲潑尼龍組，同時(shí)注射甲潑尼龍和miRNA-27α mimics組，PPARγ和ApoA5 mRNA表達(dá)水平均顯著降低，而注射甲潑尼龍和miRNA-27α inhibitor則結(jié)果相反，同時(shí)在大鼠激素股骨頭壞死模型中還觀察到添加miRNA-27α mimics組細(xì)胞增殖水平顯著高于miRNA-27α inhibitor組。表明miRNA-27α可通過PPARγ/ApoA5通路調(diào)控骨髓干細(xì)胞的成脂成骨分化并在激素性股骨頭壞死發(fā)生過程中起到延緩作用。