茹能，梁杰

(三峽大學(xué)人民醫(yī)院骨科，湖北 宜昌 443000)

臨床上?？梢姷礁鞣N原因引起的關(guān)節(jié)及關(guān)節(jié)周圍骨組織破壞，關(guān)節(jié)周圍的腱性組織喪失了正常的腱-骨附著點(diǎn)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)活動(dòng)障礙的病例，尋找一種簡(jiǎn)單有效的修復(fù)方式成為骨科修復(fù)領(lǐng)域的難題。目前在治療骨缺損、修補(bǔ)腱-骨止點(diǎn)的手術(shù)方法中，骨膜移植已成為臨床最佳選擇方法[1]。其優(yōu)點(diǎn)為骨膜質(zhì)地軟易于成形，便于原位切取、不需要增加額外損傷，對(duì)供區(qū)傷害小等。因此，本實(shí)驗(yàn)探討能否利用游離骨膜在修復(fù)骨缺損的同時(shí)重建腱-骨止點(diǎn)，能否利用游離骨膜在內(nèi)植物假體表面原位建立腱-骨-假體連接的可能性。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 本研究實(shí)驗(yàn)對(duì)象為30只兔齡在18周齡新西蘭大白兔，雌雄不限，體重2.5～3.5 kg。

1.2 動(dòng)物模型及手術(shù)方法 隨機(jī)挑選實(shí)驗(yàn)兔2只，取雙側(cè)上肢做為正?？瞻讓?duì)照組。余下28只隨機(jī)分為A、A1、B、B1組，分別選取左、右上肢顯露肱二頭肌肌腱在橈骨上端止點(diǎn)切斷，游離尺動(dòng)脈，尺動(dòng)脈較為恒定的在鷹嘴下1.2～1.5 cm處發(fā)出一支粗大的骨膜支長(zhǎng)入骨膜，以穿入點(diǎn)為中心切取骨膜面積為1.0 cm×0.8 cm。咬除橈骨骨組織，制造不低于0.5 cm的骨性缺損。骨斷端以人指骨內(nèi)固定鈦板固定，采用4種不同方法修復(fù)。A組：將肌腱斷端置于缺損處中央，取帶尺動(dòng)脈的尺骨后外側(cè)骨膜瓣，包裹缺損部及肌腱斷端并縫合固定。A1組：將肌腱止點(diǎn)斷端縫合于骨缺損處骨組織斷端，不以游離骨膜覆蓋。B組：將肌腱止點(diǎn)縫合于鈦板上，骨膜瓣包裹骨缺損及鈦板-肌腱止點(diǎn)縫合處。B1組：將肌腱止點(diǎn)斷端縫合于內(nèi)固定鈦板上，不以游離骨膜覆蓋。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 透視觀察 術(shù)后6周、12周進(jìn)行X線透視觀察，按Lane-Sandhu X射線評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)從成骨程度、連接程度、骨髓腔改建程度3方面進(jìn)行評(píng)分(見表1)。

1.3.2 鏡下觀察 術(shù)后6周和12周樣本切片后行蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)鏡下觀察，檢測(cè)指標(biāo)為：(1)HE染色細(xì)胞密度的計(jì)數(shù)；(2)腱長(zhǎng)入厚度；(3)腱-骨止點(diǎn)周圍毛細(xì)血管計(jì)數(shù)。

1.3.3 細(xì)胞因子測(cè)定 以腱-骨結(jié)合部免疫組化染色積分光密度(integral optical density，IOD)檢測(cè)骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)表達(dá)量。

1.3.4 生物力學(xué)測(cè)試 樣本固定于生物力學(xué)試驗(yàn)機(jī)，肱二頭肌肌腱與橈骨骨干呈20°進(jìn)行拉力測(cè)試，先行上下循環(huán)負(fù)荷加載，加載區(qū)間為10～80 N，拉力達(dá)到2.0 N時(shí)用電子游標(biāo)卡尺測(cè)量腱-骨止點(diǎn)橫截面積，然后按0.5 mm/s拉伸速度行拉斷實(shí)驗(yàn)，比較各組腱-骨界面的抗拉強(qiáng)度。

2 結(jié) 果

2.1 透視觀察 A、B兩組6周后有明顯骨痂生成，12周后骨缺損處已恢復(fù)骨連續(xù)性，A1、B1組透視12周后僅1份標(biāo)本可見骨痂連續(xù)，其余均為骨不連。按Lane-SandhuX射線評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)，見表2。

2.2 HE染色鏡下觀察 A組6周后見腱-膜組織交界處不規(guī)則鈣化斑，骨母細(xì)胞較多，12周后未見“潮線”樣結(jié)構(gòu)，成熟骨細(xì)胞數(shù)量多于骨母細(xì)胞，未見直接愈合的典型4級(jí)結(jié)構(gòu)形成。A1組6周后鏡下骨母細(xì)胞數(shù)量少于A組，鈣化斑密度低于A組，12周成熟骨細(xì)胞數(shù)量和骨母細(xì)胞較6周時(shí)增多，但少于同期A組(見圖1～2)。B組6周鏡下見腱-假體-骨膜界面結(jié)合部瘢痕組織和增生的肌組織增生，骨膜內(nèi)置物側(cè)未見鈣化影，12周鏡下見內(nèi)植物-骨膜界面骨膜下骨母細(xì)胞數(shù)量增多，部分纖維組織與腱組織相互長(zhǎng)入，無(wú)sharpey樣纖維結(jié)構(gòu)形成。內(nèi)植物側(cè)骨膜下極少鈣化骨組織(見圖3)。B1組肌腱止點(diǎn)均斷裂，在本實(shí)驗(yàn)中無(wú)觀測(cè)意義，予以剔除。鏡下統(tǒng)計(jì)A組、A1組、B組成熟骨細(xì)胞和骨母細(xì)胞數(shù)量、毛細(xì)血管數(shù)量及腱-骨長(zhǎng)入厚度作對(duì)比(見表3)。

表1 Lane-Sandhu X射線評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表2 Lane-Sandhu X射線評(píng)分分)

成熟骨細(xì)胞計(jì)數(shù)：6周后A、A1組比較t=14.74，P<0.01；B、A1組比較t=21.83，P<0.01；A、B組比較，t=30.31，P<0.01。12周后A、A1組比較t=16.73，P<0.01；B、A1組比較t=31.34，P<0.01；A、B組比較，t=38.72，P<0.01。骨母細(xì)胞計(jì)數(shù)：6周后A、A1組比較t=7.25，P<0.01；B、A1組比較t=7.86，P=0.01；A、B組比較t=2.26，P>0.05。12周后B、A1組比較t=10.23，P<0.01；A、B組比較t=11.82，P<0.01；A、A1組比較t=1.52，P=0.11。毛細(xì)血管數(shù)量：6周后A、A1組比較t=4.25，P=0.01；B、A1組比較t=6.93，P<0.01；A、B組比較t=2.26，P>0.05。12周后A、A1組比較t=5.40，P=0.01；B、A1組比較t=5.96，P<0.01；A、B組比較t=1.23，P=0.15。

a A組6周切片 b A1組6周切片

a A組12周切片 b A1組12周切片

a B組6周切片 b B組12周切片

A、B組毛細(xì)血管數(shù)量、腱-骨長(zhǎng)入厚度顯著高于A1組(P<0.01，見表3～4)。6周后A、A1組比較，t=11.49，P<0.01；B、A1組比較t=13.19，P<0.01；A、B組比較t=1.23，P=0.15。12周后A、A1組比較t=11.89，P<0.01；B、A1組比較t=12.01，P<0.01；A、B組比較t=1.69，P=0.09(見圖4～7)。

2.3 BMP和bFGF染色I(xiàn)OD值測(cè)定 比較發(fā)現(xiàn)A、B組6周時(shí)BMP和bFGF染色I(xiàn)OD值顯著高于A1組(P<0.01)，A、B兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。12周時(shí)A、B組IOD仍高于A1組(P<0.05)，A、B兩組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表5～6)。BMP染色I(xiàn)OD值：6周A、B組比較，t=0.751，P=0.47；B、A1組比較，t=29.371，P<0.01；A、A1組比較，t=28.268，P<0.01。12周A、B組比較，t=-1.322，P=0.22；B、A1組比較，t=7.398，P<0.01；A、A1組比較，t=5.774，P<0.01。bFGF染色I(xiàn)OD值：6周A、B組比較，t=0.226，P=0.83；B、A1組比較，t=9.296，P<0.01；A、A1組比較，t=9.357，P<0.01。12周A、B組比較，t=0.674，P=0.52；B、A1組比較，t=5.622，P<0.01；A、A1組比較，t=5.243，P<0.01。

表3 3組腱-骨止點(diǎn)細(xì)胞密度比較

表4 3組腱-骨長(zhǎng)入厚度對(duì)比

圖4 3組成熟骨細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

圖5 3組骨母細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

圖6 3組毛細(xì)血管數(shù)量比較

圖7 3組腱-骨長(zhǎng)入厚度比較

表5 BMP染色I(xiàn)OD值

表6 bFGF染色I(xiàn)OD值

2.4 生物力學(xué)測(cè)試 B1組不能進(jìn)行力學(xué)測(cè)試，予以剔除。6周樣本中抗拉強(qiáng)度正常對(duì)照組>A=B>A1；12周后抗拉強(qiáng)度正常對(duì)照組>A>B>A1組(見表7，見圖8)。最大載荷：6周A、A1組比較，t=7.38，P<0.01；B、A1組比較，t=7.22，P<0.01；A、B組比較，t=0.18，P=0.35。12周A、A1組比較，t=13.45，P<0.01；B、A1組比較，t=4.99，P<0.01；A、B組比較，t=8.12，P<0.01。腱-骨結(jié)合部面積：6周A、A1組比較，t=1.96，P=0.07；B、A1組比較，t=1.58，P=0.10；A、B組比較，t=0.79，P=0.24。12周A、A1組比較，t=4.69，P<0.01；B、A1組比較，t=6.05，P<0.01；A、B組比較，t=1.95，P=0.07?？估瓘?qiáng)度：6周A、A1組比較，t=12.21，P<0.01；B、A1組比較，t=15.22，P<0.01；A、B組比較，t=1.07，P=0.18。12周A、A1組比較，t=20.31，P<0.01；B、A1組比較，t=2.93，P=0.03；A、B組比較，t=27.69，P<0.01。

圖8 3組抗拉強(qiáng)度對(duì)比分析

表7 3組腱-骨止點(diǎn)生物力學(xué)對(duì)比

3 討 論

3.1 游離骨膜瓣對(duì)骨缺損愈合的影響 從表2可見，A、B兩組缺損處的骨愈合速度、骨缺損愈合率遠(yuǎn)高于A1、B1組，帶血供的骨膜能有效修復(fù)小段骨缺損?？紤]骨內(nèi)膜為缺損部提供了大量的間充質(zhì)細(xì)胞，間充質(zhì)細(xì)胞分化為骨母細(xì)胞，骨母細(xì)胞分泌基質(zhì)，促進(jìn)鈣沉積。而帶血管蒂的骨膜瓣具備完整的動(dòng)脈供血系統(tǒng)及靜脈回流系統(tǒng)，血供充足，局部氧分壓高；在用骨膜包裹肌腱、缺損部縫合時(shí)使其成為高張力狀態(tài)；良好血供、高氧分壓與高張力因素促進(jìn)骨母細(xì)胞向成熟骨細(xì)胞分化[2，3-4]，修復(fù)骨缺損。

3.2 游離骨膜瓣和內(nèi)植物對(duì)腱-骨止點(diǎn)骨細(xì)胞、骨母細(xì)胞數(shù)量的影響 腱-骨愈合有直接愈合和間接愈合兩種方式[5]，直接腱-骨愈合是形成具有4層“潮線”結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的腱-骨連接，而間接愈合是肌腱-骨之間被大量肉芽、成纖維組織包裹，最后改造、塑性形成Sharpey樣纖維而達(dá)到連接[6-7]，但該類愈合時(shí)間很長(zhǎng)，有報(bào)道需要12個(gè)月以上[8]。直接愈合與局部成熟骨細(xì)胞數(shù)量密切相關(guān)，只有成熟骨細(xì)胞才能形成鈣質(zhì)，為肌腱附著提供堅(jiān)強(qiáng)的“錨定界面”[9-10]。骨母細(xì)胞體積較小，位于骨質(zhì)表面，可分化為體積較大、染色較深的成骨細(xì)胞，成熟骨細(xì)胞分泌基質(zhì)和纖維并逐漸被骨質(zhì)包裹，移行于其中。由表3及圖4～5可見，A組成熟骨細(xì)胞數(shù)量始終多于其他組，6周A組骨母細(xì)胞與B組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，12周則明顯少于B組，說(shuō)明B組骨母細(xì)胞在繼續(xù)分化為骨細(xì)胞時(shí)受阻。考慮是因?yàn)锳組中骨母細(xì)胞微環(huán)境合適，骨母細(xì)胞更易于在周圍沉積鈣質(zhì)和膠原并向成熟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化；而B組骨膜瓣血供雖良好，但鈦板表面環(huán)境阻礙了骨母細(xì)胞分泌基質(zhì)、鈣沉積過(guò)程，抑制了骨母細(xì)胞向骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，故而引起骨母細(xì)胞數(shù)量隨時(shí)間推移逐漸增多，骨膜增厚，骨細(xì)胞數(shù)量卻極少。我們分析，對(duì)骨膜不能在鈦內(nèi)植物表面成骨的機(jī)制不完全明了，可能與下列因素有關(guān)：(1)鈦板光滑的表面不能為增殖的骨細(xì)胞提供黏附的空間支架結(jié)構(gòu)，骨細(xì)胞在有限的空間增殖后抑制了骨膜間充質(zhì)細(xì)胞向骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。(2)普通鈦內(nèi)植物表面不能形成富含各種成骨生長(zhǎng)因子的微環(huán)境。(3)鈦的組織相容性強(qiáng)，對(duì)機(jī)體刺激性小，引起的局部炎性反應(yīng)弱，局部各種炎性因子含量低，而炎性因子能影響多種骨生長(zhǎng)因子的分泌。本次實(shí)驗(yàn)給予的腱-骨愈合時(shí)間較短，文獻(xiàn)報(bào)道完全形成骨性愈合時(shí)間需6～12個(gè)月[7，11]，因此未觀察到腱-骨連接復(fù)合體。但對(duì)比未用骨膜覆蓋的A1組，游離骨膜移植可顯著增加成熟骨細(xì)胞數(shù)量，加快鈣質(zhì)形成速度。B組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一方面證明了附著界面對(duì)腱止點(diǎn)愈合的重要性，同時(shí)也證明了游離骨膜能夠與肌腱形成間接連接，能達(dá)到間接愈合。

3.3 游離骨膜瓣對(duì)腱-骨止點(diǎn)血供建立及腱-骨長(zhǎng)入厚度的影響 重建良好的血液供應(yīng)對(duì)促進(jìn)腱-骨愈合非常必要[12]。豐富的毛細(xì)血管網(wǎng)提供給肌腱殘端良好血供，有助于肌腱末端血供系統(tǒng)再生，從而促進(jìn)腱組織的“自愈合能力”[13]。表2中通過(guò)毛細(xì)血管計(jì)數(shù)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，帶骨膜瓣的A、B組對(duì)恢復(fù)重建止點(diǎn)部位微循環(huán)有顯著促進(jìn)作用。B1組實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單純依靠肌腱的“自愈合能力”不能在3個(gè)月的時(shí)間內(nèi)形成腱-內(nèi)植物的有效連接，肌腱短期內(nèi)即可因腱遠(yuǎn)端壞死而使重建失敗，也不能依靠周圍的軟組織重建局部循環(huán)。

腱-骨長(zhǎng)入厚度是評(píng)價(jià)腱-骨愈合程度及影響腱-骨愈合強(qiáng)度最重要的指標(biāo)之一[14]。包裹肌腱止點(diǎn)的成骨細(xì)胞使腱-骨止點(diǎn)有充分的接觸面積，肌腱和骨組織更易于相互長(zhǎng)入，此過(guò)程被學(xué)者稱為“腱-骨整合過(guò)程”，是腱-骨堅(jiān)強(qiáng)愈合過(guò)程的重要一步[15]。A組12周時(shí)已可見部分腱-骨組織重塑，而腱-骨愈合的本質(zhì)，就是肌腱與骨組織各種因素作用下相互長(zhǎng)入、重塑，形成牢固纖維連接或骨性連接的過(guò)程。對(duì)骨膜的張力性縫合起到了細(xì)胞支架作用，使新生骨及肌腱能夠通過(guò)支架生長(zhǎng)，恢復(fù)了骨缺損原有腱-骨解剖結(jié)構(gòu)。

3.4 游離骨膜對(duì)細(xì)胞因子BMP、bFGF的影響 已證實(shí)BMP和bFGF有誘導(dǎo)局部未分化細(xì)胞向成骨細(xì)胞或成軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化，加強(qiáng)成骨細(xì)胞功能的作用[16-17]。表5～6可見A、B組上述兩組細(xì)胞因子的表達(dá)對(duì)比A1組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其來(lái)源為：(1)游離骨膜本身就具有完整的血供系統(tǒng)，含毛細(xì)血管網(wǎng)、纖維結(jié)締組織和成纖維細(xì)胞，bFGF即由成纖維細(xì)胞分泌。(2)游離骨膜促進(jìn)了肌腱斷端毛細(xì)血管網(wǎng)的重建，損傷的肌腱細(xì)胞和腱鞘中的成纖維細(xì)胞也大量分泌bFGF。(3)止點(diǎn)周圍肉芽組織分泌bFGF。(4)游離骨膜中的多功能間充質(zhì)細(xì)胞分化為骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞，BMP主要由骨細(xì)胞、骨母細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分泌。分泌的BMP促進(jìn)更多骨細(xì)胞成熟，其含量進(jìn)一步增多[18-19]。(5)骨膜細(xì)胞自身表達(dá)BMP。

正常骨組織并不表達(dá)BMP，一旦骨組織損傷，骨細(xì)胞中BMP被迅速激活，參與骨修復(fù)，一旦修復(fù)完成，則其表達(dá)再次靜止[20]。這也解釋了A、B組在12周后樣本中BMP含量較6周時(shí)降低的現(xiàn)象。與BMP相似，bFGF含量也在修復(fù)完成后逐漸下降。A1組中因?yàn)樾迯?fù)未完成，BMP和bFGF持續(xù)表達(dá)，含量逐漸增高。

3.5 游離骨膜對(duì)腱-骨生物力學(xué)的影響 對(duì)各組的生物力學(xué)測(cè)試結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6周時(shí)A、B組最大載荷和抗拉強(qiáng)度無(wú)明顯差別，均為正?？瞻讓?duì)照組的37%左右，而12周后A組明顯高于B組，說(shuō)明后期隨著A組骨、腱組織的重塑改建完成，直接愈合的強(qiáng)度優(yōu)于間接愈合，能在更早時(shí)間內(nèi)接受更大的功能活動(dòng)鍛煉。正常的腱-骨骨性連接所具備的腱組織-非鈣化軟骨-鈣化軟骨-骨復(fù)合結(jié)構(gòu)是一個(gè)逐層緩沖結(jié)構(gòu)，能夠?qū)?yīng)力逐層分散遞減承擔(dān)，避免了應(yīng)力集中而使得腱-骨止點(diǎn)承受更大拉力，完成直接愈合達(dá)到正常腱-骨止點(diǎn)強(qiáng)度的過(guò)程需要長(zhǎng)于24周的時(shí)間[20-21]。有文獻(xiàn)報(bào)道骨性腱-骨愈合過(guò)程中典型“潮線”結(jié)構(gòu)形成時(shí)間需1年左右，同時(shí)肌腱完全韌帶化的時(shí)間需10余月[22]，A組肌腱止點(diǎn)雖然被骨性組織包裹，并在其中長(zhǎng)入、重塑，但并未達(dá)到完全愈合時(shí)間，因此A組腱-骨愈合強(qiáng)度弱于正常對(duì)照組。12周后B組抗拉強(qiáng)度為正常47%，高于A1組35%，比較后證明，即使單純利用帶血管游離骨膜通過(guò)間接連接方式修復(fù)腱-骨止點(diǎn)的抗拉強(qiáng)度，也優(yōu)于使用傳統(tǒng)修復(fù)方式的A1組。間接腱-骨愈合的標(biāo)志是形成Sharpey樣纖維，此結(jié)構(gòu)能夠有效將應(yīng)力分散到骨面上，以對(duì)抗更強(qiáng)的拉力，但其過(guò)程也耗時(shí)頗長(zhǎng)，有的實(shí)驗(yàn)甚至在14個(gè)月后才觀察到該纖維形成[23-24]，但通過(guò)該實(shí)驗(yàn)證明游離骨膜能為腱-骨間接愈合提供更有利的條件。

綜上所述，針對(duì)關(guān)節(jié)周圍腱-骨缺損修復(fù)目前的常用方法為游離骨移植修復(fù)骨缺損，再行腱-移植骨止點(diǎn)重建。但其缺陷顯而易見：操作步驟增多導(dǎo)致手術(shù)時(shí)間長(zhǎng)、感染概率增大、手術(shù)創(chuàng)傷增加、供區(qū)骨組織永久缺損等。因此，尋找一種新的修復(fù)重建方法成為大家關(guān)注的熱點(diǎn)。利用帶血管系統(tǒng)的游離骨膜直接修復(fù)關(guān)節(jié)周圍的骨缺損并同時(shí)重建腱-骨、腱-假體止點(diǎn)的相關(guān)研究較少，尤其是在重建后對(duì)其生物力學(xué)的研究方面。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)方面，選擇兔肱二頭肌肌腱橈骨止點(diǎn)模擬腱骨止點(diǎn)缺損并利用帶尺動(dòng)脈游離骨膜瓣修復(fù)的建模方法也未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用帶血管骨膜重建關(guān)節(jié)周圍骨缺損部位腱-骨、腱-假體止點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)研究有極強(qiáng)的臨床針對(duì)性，在關(guān)節(jié)外科、創(chuàng)傷骨科及運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有應(yīng)用價(jià)值，為臨床骨缺損修復(fù)，重建腱-骨、腱-假體止點(diǎn)提供了一種新的治療選擇。