程美慧 陸 巍 張 靜 丁開云 劉紅旗

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所感染和免疫實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650118

回歸熱神經(jīng)性疏螺旋體?。╮elapsing fever neuroborreliosis，RFNB）是由回歸熱疏螺旋體感染引起的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病綜合征[1]，這種感染的特征是使患者反復(fù)出現(xiàn)高熱和菌血癥，甚至出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病[2-4]。前期研究發(fā)現(xiàn)[5]，回歸熱疏螺旋體感染后，小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的出現(xiàn)與T淋巴細(xì)胞有關(guān)，但是確切的致病機(jī)制還不清楚。

白細(xì)胞介素（IL）-17是T細(xì)胞和先天免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子[6-8]。IL-17細(xì)胞因子家族包括IL-17A～F 6個(gè)細(xì)胞因子[9-10]，其中IL-17A為該家族的主要成員，參與了多種感染與免疫相關(guān)疾病[11-13]。研究顯示[14]，IL-17可誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的產(chǎn)生。另外，萊姆病螺旋體感染引起的萊姆病可通過抑制IL-17來預(yù)防關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[15-18]。但是，IL-17信號通路是否與RFNB的發(fā)生有關(guān)目前鮮見相關(guān)研究。

前期研究發(fā)現(xiàn)C57BL/6小鼠是研究RFNB最理想的小鼠模型[19]。另外，DAH菌株由于能在免疫正常的小鼠體內(nèi)快速復(fù)制，因此被廣泛地用于動(dòng)物模型研究[5]。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，探索IL-17信號通路在回歸熱疏螺旋體感染誘導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用，以期為該病的治療提供一定的理論基礎(chǔ)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 菌種

回歸熱疏螺旋體DAH株由美國托馬斯杰斐遜大學(xué)醫(yī)學(xué)院根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院的協(xié)議饋贈(zèng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6野生型小鼠共14只，雌雄各半，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所小實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證SCXK（滇）K2014-0002。IL-17信號通路缺陷（IL-17-/-）小鼠（C57BL/6背景）共8只，雌雄各半，來源于日本東京理工大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物疾病模型中心。所有小鼠均為健康8～12周齡清潔級小鼠，體重18～22 g。于室溫（20～25℃）條件下飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)鼠食，自由飲水。

1.3 主要儀器和試劑

BSK-H培養(yǎng)基（貨號：B8291）購于美國Sigma公司；10%中性福爾馬林固定液（貨號：E672001）購于BBI Life Sciences公司；DPBS（貨號：SH30028.02）購于HyClone公司；IgG酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（批號：E90-131-38）和IgM ELISA試劑盒（批號：E90-101-33）均購于Bethyl公司；酶標(biāo)儀購于TECAN公司；暗視野顯微鏡購于Nikon公司；3DHISTECH數(shù)字切片掃描儀；抗凝劑（1× ACD溶液）由感染和免疫實(shí)驗(yàn)室制備。

1.4 方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 8只IL-17-/-小鼠為IL-17-/-組；將14只C57BL/6野生型小鼠隨機(jī)分為兩組，第一組（S組）為6只，作為前期觀察，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行安樂死；第二組（E組）為8只，作為IL-17-/-組的對照，感染后第14天解剖，取脾臟和脊髓做病理分析。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染 將螺旋體用BSK-H培養(yǎng)基稀釋成5個(gè)/HPF，用1 mL注射器吸取200 mL螺旋體通過腹腔注射感染小鼠。

1.4.3 血液樣品的采集和處理 感染前后，每天采小鼠尾靜脈血5 μL，用45 μL 1×ACD抗凝劑稀釋后，吸取5 μL置于載玻片上，通過暗視野顯微鏡觀察并記錄血液內(nèi)菌體數(shù)量，之后將血液樣品保存于-80℃冰箱。

1.4.4 小鼠血液內(nèi)螺旋體特異性IgG和IgM含量測定從-80℃冰箱內(nèi)取出“1.4.3”中保存的血液樣品，采用雙抗體夾心ELISA法測定小鼠血液內(nèi)IgG和IgM的含量，操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。每組設(shè)2個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.5 神經(jīng)癥狀觀察 每天對感染回歸熱疏螺旋體小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病癥狀評分[20]：“0”為無明顯神經(jīng)癥狀；“1”為尾巴無力或一后肢無力；“2”為雙后肢無力；“3”為一后肢麻痹；“4”為雙后肢麻痹；“5”為因神經(jīng)疾病引起死亡。

1.4.6 組織病理學(xué)分析 在回歸熱疏螺旋體感染后第14天用CO2麻醉E組和IL-17-/-組小鼠，用DPBS進(jìn)行心臟透析后解剖小鼠，取出脊髓，用10%中性福爾馬林固定液固定后進(jìn)行包埋、切片和蘇木精-伊紅（HE）染色，之后用3DHISTECH數(shù)字切片掃描儀進(jìn)行切片掃描。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 回歸熱疏螺旋體感染S組小鼠血液中螺旋體數(shù)、特異性抗體發(fā)生情況及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)病情況

用回歸熱疏螺旋體DAH菌株感染S組小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)有效地復(fù)制擴(kuò)增并引起菌血癥（圖1A），產(chǎn)生螺旋體特異性IgG和IgM（圖1B）。用回歸熱疏螺旋體DAH菌株感染S組小鼠，從感染后第8天開始，小鼠開始出現(xiàn)尾巴無力、后肢無力和癱瘓等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病癥狀，之后疾病呈現(xiàn)漸進(jìn)性的發(fā)展，發(fā)病率達(dá)到100%，見圖2。綜合上述結(jié)果選取感染14 d為實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)間。

圖1 回歸熱疏螺旋體感染S組小鼠血液中螺旋體數(shù)和特異性抗體發(fā)生情況

圖2 回歸熱疏螺旋體感染S組小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀發(fā)生情況

2.2 回歸熱疏螺旋體感染E組和IL-17-/-組小鼠血液中螺旋體數(shù)和特異性抗體發(fā)生情況

用回歸熱疏螺旋體DAH菌株感染E組和IL-17-/-組小鼠后發(fā)現(xiàn)，E組和IL-17-/-組小鼠體內(nèi)的菌血癥變化水平基本一致，見圖3A。此外，回歸熱疏螺旋體均能誘導(dǎo)E組和IL-17-/-組小鼠螺旋體特異性IgG和IgM產(chǎn)生，見圖3B。

圖3 回歸熱疏螺旋體感染E組和IL-17-/-組小鼠血液中螺旋體數(shù)和特異性抗體發(fā)生情況

2.3 回歸熱疏螺旋體感染E組和IL-17-/-組小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀評分比較

感染9-14 d，IL-17-/-組感染回歸熱疏螺旋體后的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病評分低于E組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05或P ＜0.01），見圖4。此外，IL-17-/-組小鼠脊髓組織中小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量少于E組小鼠，見圖5。

圖4 回歸熱疏螺旋體感染E組和IL-17-/-組小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀評分比較

圖5 回歸熱疏螺旋體感染引起E組和IL-17-/-組小鼠組織內(nèi)的炎性浸潤情況（HE染色）

3 討論

回歸熱疏螺旋體感染能引起包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病在內(nèi)的多系統(tǒng)疾病[1]。在前期研究中已發(fā)現(xiàn)回歸熱疏螺旋體感染免疫正常的小鼠誘導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病癥狀與T淋巴細(xì)胞有關(guān)[5]，被激活的T淋巴細(xì)胞可能通過分泌多種炎性細(xì)胞因子參與致病過程[21-22]。

本研究發(fā)現(xiàn)，盡管回歸熱疏螺旋體在IL-17-/-小鼠與C57BL/6野生型小鼠體內(nèi)均能有效復(fù)制，但是與野生型小鼠比較，IL-17-/-小鼠的炎癥和神經(jīng)癥狀顯著減輕，提示IL-17信號通路在RFNB中具有重要作用。最近研究發(fā)現(xiàn)[23-25]，IL-17信號通路的激活可能與m-TOR信號通路有關(guān)，需進(jìn)一步探索RFNB中m-TOR信號通路和IL-17信號通路激活的聯(lián)系，這對于闡明回歸熱疏螺旋體感染導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的致病機(jī)制至關(guān)重要。