羅 樊，周建平，蔡樹瓊，鄭雪蓮，曾 翔，蔡光澤*，張 勇*

(1.西昌學(xué)院農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)院，四川 西昌 615013；2.電子科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，信息生物學(xué)中心, 四川 成都 610054)

【研究意義】水稻(OryzasativaL.)是主要糧食作物之一，全球約1/2的人口將其作為主食。在中國，水稻更是保障糧食安全和實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要糧食作物[1]。預(yù)計(jì)2030年世界人口將達(dá)到85億，這使世界范圍內(nèi)水稻產(chǎn)量提高的育種計(jì)劃面臨著巨大壓力。傳統(tǒng)水稻育種主要通過雜交和回交的方式實(shí)現(xiàn)優(yōu)良基因的聚合，存在周期長、效率低和工作量大等缺點(diǎn)，而基因編輯技術(shù)避免了傳統(tǒng)突變體獲得過程中的基因連鎖和滲透現(xiàn)象，具有育種周期較短、選育針對性強(qiáng)等特點(diǎn)，能夠精準(zhǔn)、快速地培育優(yōu)質(zhì)水稻[2-3]，為水稻育種帶來新的契機(jī)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，作為新一代基因編輯技術(shù)的CRISPR/Cas9技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用到水稻[4]、小麥[5]、玉米[6]、大豆[7]、高粱[8]、棉花[9]、番茄[10-11]、甘蔗[12]等作物的品種改良中。CRISPR/Cas9技術(shù)已經(jīng)成為水稻基因編輯最簡單、經(jīng)濟(jì)和有效的技術(shù)，能在水稻基因組水平進(jìn)行高效定向編輯[13-21]。單株水稻產(chǎn)量由單株分蘗數(shù)、每穗粒數(shù)和粒重3個(gè)因素構(gòu)成[22-23]。目前，已經(jīng)鑒定出多個(gè)影響這,3個(gè)產(chǎn)量構(gòu)成因素的基因,例如MONOCULM 1 (MOC1)、TEOSINTE BRANCHED1 (OsTB1)、和IDEAL PLANT ARCHITECTURE1 (IPA1)控制水稻的分蘗數(shù)[24-27]；GRAIN NUMBER 1a (Gn1a)、DROUGHT AND SALT TOLERANCE (DST)、IPA1和Grains.Height.Date-7 (Ghd7) 調(diào)控水稻每穗粒數(shù)[24-25,27-29]；Grain Size(GS3), Grain Weight (GW2, GW5), Squamosa Promoter Binding Protein-like 16 (OsSPL16), Ser/Thr phosphatase (OsPPKL1)和GNAT-like Protein (OsglHAT1) 等對水稻谷粒大小起到調(diào)控作用[30-38]。Li 等[39]通過 CRISPR/Cas9 技術(shù)敲除水稻中的GS3基因，其T2代籽粒表現(xiàn)出粒長和粒重增加，水稻的產(chǎn)量提高。Song等[31]研究表明GW2是負(fù)控制水稻籽粒寬度和粒重的主效基因；Ashikari等[28]研究表明GN1a基因編碼的是一種降解細(xì)胞分裂素的酶，該基因表達(dá)減弱會(huì)引起花序分生組織中細(xì)胞分裂素的積累，進(jìn)而增加穎花數(shù)量和水稻穗粒數(shù)。Zhou等[40]運(yùn)用CRISPR/Cas9 技術(shù)對水稻OsGS3、OsGW2和OsGN1a三基因進(jìn)行敲除，獲得GS3、GW2和GN1a三基因敲除突變體，該水稻突變體在溫室中籽粒的粒長、粒寬、千粒重、穗長和單穗重均明顯增加，顯現(xiàn)出巨大的育種潛力?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】但突變體在田間的主要農(nóng)藝性狀、碾米品質(zhì)、理化品質(zhì)以及食味值等是否改變尚需研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】因此，本研究對水稻吉粳809的OsGS3、OsGW2和OsGN1a三基因定向聚合敲除突變體在田間的主要農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量和品質(zhì)進(jìn)行研究，為OsGS3、OsGW2和OsGN1a三基因定向聚合編輯在育種上的應(yīng)用提供實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

不含轉(zhuǎn)基因成分的水稻吉粳809的OsGS3、OsGW2和OsGN1a三基因定向敲除突變體由電子科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院植物基因組工程實(shí)驗(yàn)室提供，突變體編號為J50-2(OsGS3:+1 bp/+1 bp，OsGW2:+1 bp/+1 bp，OsGN1a:-32 bp/-32 bp)和J47-1(OsGS3:+1 bp/+1 bp，OsGW2:-1 bp/-1 bp，OsGN1a:+1 bp/+1 bp)，對照試驗(yàn)材料為野生型材料吉粳809，編號為WT，由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所林秀云研究員提供。

1.2 試驗(yàn)地點(diǎn)

水稻種植實(shí)驗(yàn)基地位于西昌市西鄉(xiāng)，土壤肥力條件良好，水源充足，排灌方便，周圍無大型的遮擋物，光照充分。實(shí)驗(yàn)地外圍1000 m內(nèi)無水稻及其它禾本科作物種植。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)，3次重復(fù)。試驗(yàn)材料J50-2、J47-1和WT于2019年4月12日播種，采用地膜秧盤育秧方式，每穴播種1粒。移栽日期為2019年5月25日，移栽時(shí)基本苗均為1苗。移栽小區(qū)面積為13.30 m2，小區(qū)長寬分別為6.19和2.15 m。株行距為19.55和16.73 cm，小區(qū)間間距33.30 cm，四周設(shè)1.00 m保護(hù)行。于移栽后7 d施用春果肥160 kg/667m2(總養(yǎng)分N+P2O5+K2O≥10 %、有機(jī)質(zhì)≥45 %、腐植酸≥10 %、有效活菌數(shù)≥0.2億/g)。成熟收獲日期為2019年9月22日，田間管理按照當(dāng)?shù)厝粘７绞竭M(jìn)行。

1.4 測定指標(biāo)

水稻成熟后，每個(gè)小區(qū)隨機(jī)選取10株進(jìn)行株高和有效分蘗數(shù)測定，并將隨機(jī)選取的10株水稻分別置于室內(nèi)自然晾干，測定穗長、每穗總粒數(shù)、每穗實(shí)粒數(shù)和結(jié)實(shí)率，。將谷粒存放3個(gè)月后，參照國家標(biāo)準(zhǔn)《GB/T17891-1999 優(yōu)質(zhì)稻谷》測定千粒重、谷粒長度、谷粒寬度、糙米率、精米率、整精米率、堊白粒率。蛋白質(zhì)含量參照國家標(biāo)準(zhǔn)《GB5009.5-2016》第三法測定。直鏈淀粉含量參照國家標(biāo)準(zhǔn)《GB/T15683-2008》進(jìn)行測定。大米食味值采用大米食味計(jì)(JSWL，日本佐竹公司)測定。堊白度采用大米外觀品質(zhì)檢測儀(JMWT12，日本佐竹公司)測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010和IBM SPSS Statistics 25進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsGS3、OsGW2和OsGN1a三基因敲除對吉粳809農(nóng)藝性狀的影響

野生型吉粳809和J47-1株系、J50-2株系的農(nóng)藝性狀分析表明，突變體J47-1與J50-2的平均株高比野生型分別增加3.99 %和5.99 %，均表現(xiàn)為極顯著差異(圖1-a，圖1-d)。突變體J47-1與J50-2的平均粒長比野生型增加20.63 %和17.33 %，均呈極顯著差異(圖1-b，圖1-k)。突變體J47-1與J50-2的平均粒寬比野生型分別增加11.66 %和10.79 %，均表現(xiàn)為極顯著差異(圖1-b，圖1-j)。突變體J47-1與J50-2的平均穗長比野生型分別增加9.27 %和9.04 %，均表現(xiàn)為極顯著差異(圖1-c，圖1-f)。突變體J47-1與J50-2的平均分蘗數(shù)分別為8.53和8.83個(gè)，比野生型減少23.84 %和21.16 %，均呈極顯著差異(圖1-e)。突變體J47-1與J50-2的平均每穗總粒數(shù)與野生型相比均表現(xiàn)為增加，達(dá)到極顯著差異(圖1-g)。但突變體J47-1與J50-2的每穗實(shí)粒數(shù)比野生型僅增加3.65 %和3.68 %，差異不顯著(圖1-h)。突變體J47-1與J50-2的平均結(jié)實(shí)率比野生型分別降低7.68 %和8.49 %，均呈極顯著差異(圖1-i)。突變體J47-1與J50-2比野生型千粒重增加53.75 %和49.31 %，均呈極顯著差異(圖1-l)。GS3、GW2和GN1a三基因敲除使吉粳809的基本農(nóng)藝性狀的株高、穗長、每穗總粒數(shù)、每穗實(shí)粒數(shù)、粒長、粒寬和千粒重均有所提高，而每株分蘗數(shù)和結(jié)實(shí)率降低。

2.2 三基因敲除對吉粳809產(chǎn)量的影響

GS3、GW2和GN1a三基因敲除植株J47-1和J50-2產(chǎn)量比野生型分別增產(chǎn)12.62 %和15.78 %，均呈顯著差異(圖1-m)。表明GS3、GW2和GN1a三基因敲除使吉粳809的產(chǎn)量顯著提高。

2.3 三基因敲除對吉粳809碾米品質(zhì)的影響

GS3、GW2和GN1a的糙米率野生型相比無顯著差異(圖2-b)。突變體J47-1和J50-2的精米率比野生型分別減少4.09 %和2.78 %，其中J47-1與野生型差異顯著，而J50-2與野生型差異達(dá)極顯著(圖2-c)。突變體J47-1和J50-2的整精米率比野生型低32.83 %和22.86 %，均呈極顯著差異(圖2-d)。突變體J47-1和J50-2的堊白率分別比野生型高80 %和84 %，均達(dá)到極顯著差異(圖2-e)。突變體J47-1和J50-2的堊白度比野生型分別高16.37 %和12.20 %，均達(dá)到極顯著差異(圖2-f)。表明，GS3、GW2和GN1a三基因敲除使吉粳809的精密率和整精米率顯著降低，堊白粒率和堊白度顯著增高，而對糙米率影響不大。

2.4 三基因敲除對吉粳809理化品質(zhì)和食味值的影響

GS3、GW2和GN1a三基因敲除突變體J47-1和J50-2的直鏈淀粉與野生型的差異不顯著(圖3-a)。

蛋白質(zhì)含量上，J47-1和J50-2與野生型的蛋白質(zhì)含量差異未達(dá)顯著水平(圖3-b)。J47-1、J50-2和野生型的食味值差異也也未達(dá)顯著水平(圖3-c)。表明，GS3、GW2和GN1a三基因敲除對吉粳809的直鏈淀粉含量、蛋白質(zhì)含量和食味值均影響不大。

3 討 論

隨著水稻全基因組測序完成，大量調(diào)控水稻重要性狀的基因的克隆與鑒定，將控制重要性狀的基因應(yīng)用于育種實(shí)踐的需求越來越迫切。GS3、GW2和GN1a三基因分別是水稻粒長、粒寬和每穗粒數(shù)的負(fù)調(diào)控因子，對水稻產(chǎn)量因素調(diào)控起著重要作用[28,31,39]。GS3、GW2和GN1a三基因的敲除對水稻吉粳809的田間基本農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量有不同程度的影響。與GS3、GW2和GN1a三基因的敲除獲得的突變體與野生型相比，每穗總粒數(shù)、穗長、粒長、粒寬和千粒重均顯著增加，達(dá)到差異極顯著水平，其中每穗總粒數(shù)增加13.99 %～15.57 %，穗長增加9.04 %～9.27 %，粒長和粒寬分別增加17.33 %～20.63 %和10.79 %～11.66 %，千粒重增加49.31 %～53.75 %，該結(jié)果與Zhou等[40]的研究結(jié)果基本一致。另外本研究發(fā)現(xiàn)，突變體的每穗總粒數(shù)增加，但是結(jié)實(shí)率卻顯著下降，使每穗實(shí)粒數(shù)僅增加了3.65 %～3.68 %，且差異未到達(dá)顯著水平。分蘗也減少21.16 %～23.84 %，差異達(dá)到極顯著水平。而在Zhou等[40]的研究中卻未見結(jié)實(shí)率和分蘗數(shù)下降的報(bào)道，造成這些現(xiàn)象的可能原因是本實(shí)驗(yàn)在大田環(huán)境下，植株與植株間相互競爭有限的肥力、陽光和CO2等資源造成。本研究中突變體的株高增加3.99 %～5.99 %，且差異達(dá)到極顯著水平，而在Zhou等[40]的研究，川農(nóng)香粳(CNXJ)的GS3、GW2、GN1a三基因敲除突變體與野生型相比卻表現(xiàn)出株高顯著降低的現(xiàn)象，這可能是2個(gè)不同背景水稻品種的基因相互作用產(chǎn)生的，具體原因有待進(jìn)一步研究。雖然水稻產(chǎn)量三要素中每穗實(shí)粒數(shù)和粒重表現(xiàn)出增加，分蘗表現(xiàn)出減少，但最終產(chǎn)量增產(chǎn)達(dá)到12.62 %～15.78 %，且差異達(dá)到極顯著水平。可見GS3、GW2和GN1a三基因敲除方法在水稻增產(chǎn)中有巨大潛力。

GS3、GW2和GN1a三基因的敲除對吉粳809的品質(zhì)有較大影響。在碾米品質(zhì)方面，與突變體野生型相比，在糙米率方面無顯著差異，但是精米率和整精米率卻降低，其中精米率下降2.78 %～4.09 %，而整精米率卻下降了22.86 %～32.83 %，且差異都達(dá)到顯著水平。而整精米率是判斷優(yōu)質(zhì)米標(biāo)準(zhǔn)的重要指標(biāo)，所以提高水稻碾米的整精米率是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)米的必要途徑[41]。因而突變體的碾米品質(zhì)劣于野生型。在外觀品質(zhì)方面，突變體的堊白粒率和堊白度相比野生型分別增加80.00 %～84.00 %和12.20 %～16.37 %，且差異達(dá)到極顯著水平。產(chǎn)生這種差異的原因可能是在水稻灌漿期，由于突變體水稻籽粒變大，胚乳沒有積累足夠的淀粉，導(dǎo)致淀粉粒形狀、大小不規(guī)則，淀粉粒排列不緊密產(chǎn)生空隙，從而導(dǎo)致堊白度增加，堊白粒率變高。而堊白粒率和堊白大小又和精米率和整精米率成極顯著負(fù)相關(guān)[42]，因而堊白粒率的增加又極有可能是導(dǎo)致突變體精米率和整精米率下降的原因。雖然突變體的外觀品質(zhì)要劣于野生型。但在理化品質(zhì)方面，J50-2和J47-1的直鏈淀粉含量和蛋白質(zhì)含量都與對照J(rèn)809(WT)差異不大。在食味值方面，突變體和野生型差別也不大。

4 結(jié) 論

GS3、GW2和GN1a三基因敲除突變體與野生型相比，在株高、分蘗、穗長、穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒重等田間農(nóng)藝性狀上都有不同程度的變化，產(chǎn)量表現(xiàn)出明顯增加，因而GS3、GW2和GN1a三基因敲除模式在水稻增產(chǎn)中蘊(yùn)含巨大潛力。但是其外觀品質(zhì)中的堊白粒率和堊白度極顯著增加，碾米品質(zhì)中的精米率和整精米率又表現(xiàn)出極顯著降低，使得該方法下獲得的整精米產(chǎn)量和品質(zhì)都會(huì)有所下降，因而該方法不適合用在以精米作為商品出售的品種改良中。但是由于其理化品質(zhì)中的直鏈淀粉含量、蛋白質(zhì)含量以及食味值變化不明顯，因而該方法用于以糙米(如紅米和紫米)和米粉(如糯米粉)的形式作為商品的品種改良上擁有巨大的前途。