廖致紅，代小麗，吳春鳳，劉志華，李麗敏，徐 鵬，沈開元

(柳州市人民醫(yī)院檢驗科 廣西 柳州 545001)

桿狀病毒是一種基因組為80 ～160 kb 的環(huán)狀DNA 雙鏈病毒。根據(jù)包涵體的形態(tài)和病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞病理學(xué)特征，桿狀病毒分為核多角體病毒屬（nucleopolyhedrovirus,NPV）和顆粒病毒屬（granulovirus, GV）。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)（baculovirus expression vector systerm, BEVS）是一種利用桿狀病毒作為載體，轉(zhuǎn)染昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞或蟲體中表達(dá)外源蛋白的真核表達(dá)系統(tǒng)。桿狀病毒具有宿主專一性，其在自然條件下不能感染脊椎動物，生物安全性好；利用真核生物昆蟲的細(xì)胞作為宿主，表達(dá)的外源蛋白能夠進(jìn)行正確的蛋白加工和修飾；病毒本身基因組大，容納量高，而且能夠攜帶多個基因；這些優(yōu)點(diǎn)使得BEVS 成為一項成熟、安全、經(jīng)濟(jì)、高效的蛋白質(zhì)表達(dá)技術(shù)，廣泛用于生物防治、臨床醫(yī)療、藥品開發(fā)等領(lǐng)域[1ˉ3]。本研究構(gòu)建重組桿狀病毒載體后，將p53 基因轉(zhuǎn)染至該載體，并調(diào)控其在肝癌細(xì)胞特異表達(dá)，為臨床實現(xiàn)p53 基因精準(zhǔn)治療肝癌奠定基礎(chǔ)。現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1.資料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及復(fù)蘇

實驗所用細(xì)胞株為HepG2、LO2，按細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)及凍存。

1.2 p53 過表達(dá)載體構(gòu)建

1.2.1 細(xì)胞總RNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄 取適量HepG2、LO2 細(xì)胞置于Trizol 裂解液（索萊寶，R1100）中，按照說明書進(jìn)行總RNA 提取后，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript ? RT Master Mix 說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作，所得cDNA 置于ˉ20℃保存待用。

1.2.2 過表達(dá)質(zhì)粒載體pB513Bˉ1 提取以及純化 使用質(zhì)粒小量提取試劑盒（Solarbio,D1100）提取質(zhì)粒，按照說明書完成質(zhì)粒提取以及純化。

1.2.3 PCR 體系和反應(yīng)條件 使用引物擴(kuò)增基因CDS區(qū)域外源片段。反應(yīng)體系和PCR 擴(kuò)增條件參照說明書執(zhí)行，引物由上海生工設(shè)計，見表1。

表1 擴(kuò)增的引物序列

1.2.4 DNA 酶切實驗 對外源片段和過表達(dá)質(zhì)粒載體進(jìn)行酶切。使用全氏金公司的限制性內(nèi)切酶和反應(yīng)Buffer，操作按照說明書進(jìn)行。

1.2.5 DNA 純化以及回收實驗 使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（Solarbio,D2500ˉ01）和DNA 產(chǎn)物純化試劑盒（Solarbio, D1300）進(jìn)行DNA 的純化和膠回收。

1.2.6 DNA 連接實驗 將擁有粘性末端的外源片段和質(zhì)粒載體進(jìn)行連接反應(yīng)。連接酶購自Promega 公司的T4 DNA 連接酶，操作按照說明書進(jìn)行。

1.2.7 感受態(tài)細(xì)胞CaCl2化學(xué)轉(zhuǎn)化實驗 按照感受態(tài)細(xì)胞的操作說明書進(jìn)行。

1.2.8 陽性克隆菌篩選驗證 挑取單菌落培養(yǎng)于含抗生素的LB 液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)物送至上海生工進(jìn)行測序，選取測序成功克隆菌使用EasyPure? HiPure Plasmid MiniPrep Kit 提取質(zhì)粒，用于后續(xù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

實驗分組HepG2：空白對照組、p53 過表達(dá)組LO2：空白對照組、p53 過表達(dá)組。細(xì)胞轉(zhuǎn)染的操作程序按照漢恒Lipo Fiter3 轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。

1.4 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株篩選

細(xì)胞轉(zhuǎn)染或感染48 h 后，將細(xì)胞置于含有適當(dāng)濃度（2μg/mL）嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細(xì)胞穩(wěn)定生長后，傳代培養(yǎng)及凍存，進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.5 細(xì)胞總RNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄

參照1.2.1 的操作步驟進(jìn)行。

1.6 實時熒光定量PCR 檢測p53 基因mRNA 表達(dá)

反應(yīng)體系和酶購自Takara 公司，引物由上海生工設(shè)計合成，反應(yīng)條件根據(jù)Takara 公司的qPCR 說明書進(jìn)行操作，見表2。

表2 qPCR 引物序列

1.7 MTT 法檢測細(xì)胞增殖活性

按照實驗步驟說明書進(jìn)行操作。

1.8 流式技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

按照實驗步驟說明書進(jìn)行操作。

1.9 ELISA 法檢測p53 基因蛋白濃度

細(xì)胞懸液經(jīng)反復(fù)凍融、離心后，經(jīng)加樣、加酶、溫育、配液、洗滌、顯色、終止等步驟后測定數(shù)值，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品指標(biāo)含量。

1.10 蛋白印跡法檢測p53 基因蛋白表達(dá)

細(xì)胞蛋白提取及變性：取細(xì)胞培養(yǎng)皿，加入200～400μl RIPAˉPMSF，吹打混勻至細(xì)胞完全裂解。12 000 rpm 離心5 min，取上清采用BCA 法測定蛋白含量。經(jīng)變性、電泳、轉(zhuǎn)膜、一抗二抗孵育后顯影。所有操作步驟按照說明書進(jìn)行。

2.結(jié)果

2.1 p53 基因過表達(dá)重組質(zhì)粒載體構(gòu)建成功

選取陽性克隆進(jìn)行DNA 測序，通過軟件vector NTI 1.5.1比對序列，結(jié)果顯示插入序列與數(shù)據(jù)庫中序列一致。

2.2 p53 基因重組桿狀病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞

轉(zhuǎn)染24 h 后使用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行觀察轉(zhuǎn)染效率，觀察綠色熒光蛋白GFP 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后兩種細(xì)胞系的綠色熒光蛋白GFP 表達(dá)，表明轉(zhuǎn)染成功。

2.3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株篩選

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h 后，將細(xì)胞置于含有適當(dāng)濃度（2 μg/mL）嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)，進(jìn)行篩選，細(xì)胞穩(wěn)定生長后，綠色熒光蛋白GFP 表達(dá)穩(wěn)定，表明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株篩選成功。

2.4 實時熒光定量PCR（RTˉPCR）檢測p53 基因mRNA 表達(dá)

經(jīng)轉(zhuǎn)染后，p53 基因在LO2 和HepG2 細(xì)胞株的mRNA的表達(dá)量均顯著上升（P＜0.05），表明p53 基因重組桿狀病毒能夠在離體肝癌細(xì)胞中靶向表達(dá)，見表3。

表3 p53 基因mRNA 在離體細(xì)胞中的表達(dá)（χˉ±s）

2.5 p53 基因重組桿狀病毒抑制HepG2 細(xì)胞增殖

重組桿狀病毒感染后，HepG2 細(xì)胞增殖率明顯低于未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），表明p53 基因重組桿狀病毒能夠抑制肝癌細(xì)胞的生長，見圖1。

圖1 CCK8 細(xì)胞活力測定顯示p53 重組桿狀病毒能夠抑制肝癌細(xì)胞生長

2.6 p53 基因重組桿狀病毒促進(jìn)HepG2 細(xì)胞凋亡

重組桿狀病毒感染后，HepG2 細(xì)胞凋亡率明顯高于未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，而在LO2 細(xì)胞系未觀察到差異，表明p53基因重組桿狀病毒能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡。

2.7 p53 基因重組桿狀病毒蛋白在HepG2 細(xì)胞靶向表達(dá)

ELISA 檢測結(jié)果顯示，在HepG2 細(xì)胞中檢測到的p53基因重組桿狀病毒蛋白濃度顯著高于非感染的HepG2 細(xì)胞（P＜0.01），而在LO2 細(xì)胞中未觀察到相應(yīng)變化，表明p53 基因重組桿狀病毒蛋白在HepG2 細(xì)胞中靶向表達(dá)，見圖2。

圖2 ELISA 檢測結(jié)果顯示p53 基因重組桿狀病毒蛋白在HepG2 細(xì)胞中靶向表達(dá)

2.8 蛋白印跡法結(jié)果表明p53 基因重組桿狀病毒蛋白在HepG2 細(xì)胞靶向表達(dá)

Western blot 結(jié)果表明，與空白組相比，p53 基因重組桿狀病毒蛋白在HepG2 細(xì)胞表達(dá)增高，但在LO2 細(xì)胞中的表達(dá)無顯著差異（P＞0.05），表明p53 基因重組桿狀病毒蛋白在HepG2細(xì)胞，而非LO2細(xì)胞中靶向表達(dá)，見圖3 和表4。

圖3 Western blot 圖顯示p53 基因重組桿狀病毒蛋白在HepG2 細(xì)胞靶向表達(dá)

表4 p53 基因重組桿狀病毒蛋白在離體細(xì)胞的灰度值分析

3.討論

桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)在學(xué)術(shù)界和工業(yè)中廣泛用于生產(chǎn)真核蛋白，應(yīng)用范圍從結(jié)構(gòu)分析、藥物篩選、提供蛋白質(zhì)生物學(xué)和癌癥、病毒等的治療方法[4ˉ5]。桿狀病毒作為常見病毒載體的獨(dú)特地方在于具有容納大量異源DNA 的能力，并且能夠?qū)愒碊NA 完整地遞送至所選的宿主細(xì)胞。因此科學(xué)家們利用了這個強(qiáng)大的功能開發(fā)了多種產(chǎn)品，從而在異源蛋白表達(dá)過程中賦予了新功能。通過改變其向性，重組桿狀病毒顆粒可用于在哺乳動物細(xì)胞和組織中高效遞送定制的DNA。合成生物學(xué)的最新進(jìn)展極大地促進(jìn)了構(gòu)建或重組桿狀病毒基因組的構(gòu)建，以用于基因編輯和基因組工程等方面[6ˉ7]。

桿狀病毒載體在哺乳動物細(xì)胞基因傳遞中具有廣泛應(yīng)用前景，其優(yōu)勢在于桿狀病毒不會在哺乳動物細(xì)胞中復(fù)制、其基因整合到哺乳動物基因組中的水平低，更重要的是桿狀病毒載體具有強(qiáng)大的攜帶轉(zhuǎn)基因能力（最多可38kb 的外源DNA）且無細(xì)胞毒性。因此，近幾年來有科學(xué)家的研究焦點(diǎn)集中在使用桿狀病毒載體運(yùn)送外源DNA 用于癌癥等治療[8]。本研究選取宿主域狹窄的桿狀病毒作為載體，以肝組織特異性啟動子載脂蛋白AˉI 啟動p53 基因，利用肝臟組織特異性啟動子apoE 和miRˉ122 反義序列雙調(diào)控，構(gòu)建了p53 基因重組桿狀病毒。通過RTˉPCR 法檢測p53 基因重組桿狀病毒基因mRNA 在HepG2 細(xì)胞系中表達(dá)、ELISA 法檢測p53 基因重組桿狀病毒蛋白濃度、流式細(xì)胞術(shù)檢測p53 基因重組桿狀病毒蛋白誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞凋亡，MTT 法檢測p53 基因重組桿狀病毒蛋白抑制HepG2 細(xì)胞增殖、Western blot 技術(shù)檢測p53 基因重組桿狀病毒蛋白在HepG2 細(xì)胞中靶向表達(dá)，結(jié)果顯示，在正常肝臟細(xì)胞LO2 細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染p53 基因重組桿狀病毒，病毒基因mRNA 表達(dá)無明顯改變，病毒蛋白在LO2 細(xì)胞系中的增殖無顯著改變，無抑制LO2 細(xì)胞系凋亡的能力，但p53 基因重組桿狀病毒基因mRNA 在HepG2 細(xì)胞中表達(dá)增加，病毒蛋白在HepG2 細(xì)胞中靶向表達(dá)，證明本研究p53 基因重組桿狀病毒載體構(gòu)建成功，可達(dá)到靶向治療肝癌患者的目的。

國外研究顯示，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)將靶DNA 插入桿狀病毒包膜GP64 信號序列和成熟域之間，通過GP64 的跨膜區(qū)域?qū)⑷诤系鞍族^定在病毒的包膜中，從而將外源蛋白展示于病毒表面粒子，進(jìn)一步增強(qiáng)其免疫識別和免疫反應(yīng)性[9ˉ10]。本研究結(jié)果顯示，桿狀病毒載體攜帶的外源DNA（p53 基因）具有良好的生物安全性，易于操作以插入外源DNA 片段，表達(dá)的重組蛋白很容易純化等，與國外的研究一致[11ˉ13]，表明具備了桿狀病毒載體攜帶外源DNA 達(dá)到肝癌替代治療的應(yīng)用價值。

綜上所述，本研究構(gòu)建的p53 基因重組桿狀病毒載體具有安全性、經(jīng)濟(jì)性和便利性的獨(dú)特優(yōu)勢，在未來肝細(xì)胞癌的基因治療中具有巨大的潛力。