杜欣娜 戚家峰 張虎

(1江蘇醫(yī)藥職業(yè)學院基礎醫(yī)學部，江蘇 鹽城 224005；2佳木斯大學基礎醫(yī)學院；3哈爾濱市兒童醫(yī)院心胸外科)

在全球新增癌癥中死亡率排名前5位的癌癥類型分別是肺癌、結腸直腸癌、胃癌、肝癌、乳腺癌。女性中發(fā)病率和死亡率最高的均是乳腺癌〔1，2〕。經(jīng)典的乳腺癌分型為：雌激素受體(ER)陽性、人表皮生長因子受體(HER)2陽性和三陰性乳腺癌(TNBC)。TNBC占比為15%～20%，好發(fā)于年輕女性(<50歲)，組織學分級較高，侵襲性強，易發(fā)生內臟轉移和腦轉移，生存期短且預后差〔3，4〕。盡管內分泌治療和靶向治療顯著提高了ER+和HER2+乳腺癌患者群體的存活率，但TNBC主要以細胞毒性化療為主，仍然缺乏較為理想的治療措施，因為傳統(tǒng)的細胞毒性和靶向治療都無法產生良好的臨床療效，原因可能歸咎于遺傳異質性、對治療的快速進化反應、信號通路互補及反饋回路〔5〕。因此臨床上迫切需要開發(fā)新的TNBC治療靶點和方法。合成致死可以看作細胞的一種表型，同時敲除、沉默或者突變兩個基因，細胞發(fā)生凋亡或者壞死，如果只改變其中一個基因的功能，細胞可以正常生存〔6〕。突變是腫瘤發(fā)生的主要誘因，包括TNBC在內的各種腫瘤也存在廣泛的基因突變。一些重要信號通路或生物學過程中的關鍵基因發(fā)生突變，失去原有功能，為開發(fā)合成致死治療策略和靶點提供了前提，其優(yōu)勢在于基于該靶點開發(fā)的藥物可以特異性殺傷腫瘤細胞。因為正常細胞不存在關鍵基因的突變，即使藥物作用于靶點，細胞也會通過關鍵基因發(fā)揮功能存活下來〔7〕。近十幾年來，合成致死策略為治療TNBC開辟了新途徑。

1 基于乳腺癌易感基因(BRCA)/聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)-1合成致死研究

1.1DNA損傷修復類型 截至目前，已發(fā)現(xiàn)5種DNA損傷修復機制：直接修復、堿基切除修復(BER)、錯配修復(MMR)、雙鏈斷裂重組修復和核苷酸切除修復〔6〕。BRCA參與雙鏈斷裂重組修復〔8〕，PARP參與堿基切除修復〔9〕。

1.2BRCA參與雙鏈斷裂重組修復 大多數(shù)TNBC伴有BRCA突變、DNA甲基化改變、mRNA和蛋白表達改變，DNA同源重組(HR)修復異?！?0〕?；熕幬锘蜉椛湟?DNA斷裂損傷。MRN復合體(Mre11、RAD50和NBS1)識別雙鏈斷裂(DSBs)，結合DNA斷裂末端，活化并招募ATM絲氨酸/蘇氨酸激酶，MRN復合體連同CtIP和BRCA1切除DNA末端。RPA復合體覆蓋單鏈DNA末端，同時，以BRCA1和PALB2依賴的方式招募BRCA2，進而招募RAD51，替換RPA，在單鏈DNA上形成核蛋白纖維，在同源姐妹染色單體上尋找同源序列并起始DNA鏈間互換〔8，11〕。

1.3PARP1參與堿基切除修復(BER) PARP是一個酶家族，PARP1和PARP2在堿基切除修復過程中發(fā)揮重要作用。PARP1具有3個保守結構域：NH2-末端DNA損傷傳感器和含有鋅指的結合結構域、自動修正結構域和一個C-末端催化結構域。PARP1通過結合結構域識別并結合單鏈斷裂點(SSBs)，催化腺苷二磷酸核糖與NAD+反應生成不同大小的腺苷二磷酸核糖聚合物，進而形成長的支鏈聚腺苷二磷酸核糖，共價結合PARP1、組蛋白和其他DNA修復蛋白，鄰近DNA斷裂點形成多聚體。該多聚體攜帶負電荷，形成支架，招募其他蛋白，如XRCC1、DNA連接酶3、DNA聚合酶β，通過BER途徑修復SSB損傷〔6，12〕。如果腺苷二磷酸核糖聚合受阻或者BER被破壞，SSBs累積，就會在DNA復制叉處形成DSBs。

1.4BRCA/PARP1合成致死 同源重組是修復DNA雙鏈損傷的主要機制，BRCA1/2蛋白是同源重組修復途徑的關鍵組分，BRCA缺陷的腫瘤細胞存在天然的DNA修復缺陷。同時，抑制PARP1酶的作用將會引起高水平的DNA損傷，促進細胞凋亡，即BRCA/PARP1合成致死〔13〕。抑制合成致死靶點可以增加抗癌藥物敏感性。對于BRCA突變的乳腺癌或者卵巢癌患者，存在先天DNA損傷修復缺陷，抑制PARP1酶活性可以通過合成致死策略達到良好的治療效果和較低的副作用〔13，14〕。

PARP1抑制劑可以分為兩類：NAD類似物和非NAD類似物。NAD類似物與PARP1催化的反應底物NAD+結構類似，可競爭性結合PARP1，抑制腺苷二磷酸核糖聚合，進而阻斷BER修復途徑。目前臨床可用的PARP1抑制劑均為NAD類似物：苯甲酰胺衍生物、苯并咪唑甲酰胺衍生物、香豆酮酰胺衍生物、2，5-二酮哌嗪衍生物、4-苯基酞嗪酮衍生物和氟酞嗪酮衍生物等〔6，15～17〕。NAD+是一種重要的輔酶，廣泛存在于各代謝反應中。所以，通過抑制NAD+與PARP1反應會破壞多種細胞代謝通路，產生毒副作用。許多PARP1抑制劑臨床試驗頗具周折。因此，新穎的非NAD類似物得到科研人員親睞，其靶向作用于PARP1酶本身，副作用小，可特異性抑制癌細胞增殖〔18，19〕。Thomas等〔18〕通過篩選發(fā)現(xiàn)了可抑制PARP1活性的非NAD類似物，臨床試驗顯示該化合物比傳統(tǒng)的PARP1抑制劑效果更好。這些非NAD類似物在治療多種異種種植瘤模型中均有效，包括腎癌、前列腺癌和乳腺癌。臨床前動物實驗為進一步臨床試驗打下了堅實基礎。非NAD類似物在治療BRCA1缺陷型白血病中也取得了較好前景〔19〕。

臨床上，PARP1抑制劑具有治療BRCA突變乳腺癌和卵巢癌的潛力，不排除用于治療前列腺癌、胰腺癌和腸癌等固體腫瘤。FDA現(xiàn)已批準PARP1抑制劑包括奧拉帕尼、盧卡帕尼和尼拉帕尼，維利帕尼和他拉唑帕尼也處于臨床后期實驗中。這些分子都是非選擇性PARP1抑制劑，同時具有潛在抑制PARP2的能力。此外，PARP1抑制劑抗性也有報道。耐藥機制可以分為三類：HR恢復、PARP-1表達下調和藥物外排造成的細胞內PARP 濃度下降。其中，BRCA1/2二次突變、53BP1缺失和RAD51增加最終導致HR恢復〔20〕。

BRCA1/2突變導致HR缺陷，易患癌癥。細胞為了增殖，傾向于RAD52蛋白介導的旁路復制叉修復通路，核酸內切酶EEPD1 介導了RAD52缺失與BRCA1/2突變產生的合成致死效應〔21〕。PARP1抑制劑臨床抗性機制之一是補償同源重組蛋白RAD51表達上調，實驗證明靶向RAD51和p38的同時，聯(lián)合靶向PARP1可以更好地抑制TNBC細胞增殖〔22〕。MYC基因擴增通常與RAD51表達上調相關，同時靶向MYC和PARP1同樣具有抑制腫瘤生長作用〔23〕。類似地，抑制RNA解旋酶DDX3、拓撲異構酶、XRCC1或PTEN，同時抑制PARP1均可在BRCA缺陷乳腺癌中產生合成致死效應〔12，24～26〕。

2 其他合成致死研究

除了PARP1外，TNBC標志物還包括表皮生長因子受體(EGFR)、血管內皮生長因子(VEGF)、PTEN、c-Myc、C-kit和基礎細胞角蛋白、p53、酪氨酸酶激酶、m-TOR和熱休克蛋白〔4〕(圖1)。TNBC標志物不僅可用于診斷和預后，還可基于合成致死策略開發(fā)為TNBC治療的新靶點。

圖1 TNBC信號通路(KEGG)

Horigome等〔27〕篩選突變TP53的合成致死基因，發(fā)現(xiàn)R248Q 突變TP53促進ADORA2B表達，敲除ADORA2B可以抑制突變TP53型 TNBC的發(fā)生和轉移，提示腺苷受體途徑是TNBC亞型治療的潛在靶點。Zhu等〔5〕發(fā)現(xiàn)G1-S檢查點異常的TNBC對TTK和CLK2激酶的抑制劑CC-671更為敏感，CC-671有望進入臨床實驗治療部分TNBC患者。PTEN不僅是PI3K信號通路的抑制因子，其缺陷還可造成DNA損傷修復缺陷，抑制ATM激酶可特異性增加PTEN缺陷細胞系MDA-MB-468對鉑類藥物的敏感性〔28〕。聯(lián)合抑制EGFR和Notch信號通路可以一定程度上降低AKT活性，導致基底樣乳腺癌細胞死亡〔29〕，同時抑制EGFR和間質-上皮轉化因子(MET)可下調核糖體蛋白S6抑制TNBC亞型間充質干細胞樣(MSL)細胞增殖〔30〕。c-MYC一方面可以促進TNBC發(fā)生腦轉移，另一方面使TNBC對腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)更為敏感，為腦轉移乳腺癌治療提供了潛在治療策略〔31〕。Liu等〔32〕報道同時抑制c-MYC和CDK1可抑制TNBC細胞生長〔32〕。E-鈣黏蛋白缺陷常見于乳腺癌中，Bajrami等〔33〕利用siRNA文庫篩選發(fā)現(xiàn)抑制酪氨酸激酶ROS1 具有很好的抗CDH1缺陷乳腺癌的作用，為ROS1抑制劑克里唑蒂尼進入Ⅱ期臨床試驗提供了重要依據(jù)。

3 問題與展望

TNBC是一類難治性乳腺癌，至今缺乏靶向治療手段。合成致死策略在TNBC“先天缺陷”的基礎上，通過阻斷其補救信號通路抑制腫瘤生長，誘導凋亡。因為正常細胞不存在“先天缺陷”，所以基于合成致死策略開發(fā)的治療方法具有選擇性殺傷TNBC細胞的優(yōu)勢。PARP1抑制劑就是基于該策略開發(fā)的治療BRCA缺陷腫瘤的藥物，但是PARP1抑制劑也具有毒副作用和耐藥性，下一代PARP1抑制劑需提高靶向性和效價，克服毒副作用和耐藥性。腫瘤是多突變、多信號通路異常、多階段的異質性疾病，合成致死提示多靶點干預是有前景的治療策略。原理上，同時干預細胞增殖、轉移、代謝或凋亡的主要和代償信號通路，都可形成合成致死效果。伴隨CRISPR基因編輯文庫的興起，研究人員通過二代測序等高通量方法找到TNBC等難治性腫瘤的“弱點”，通過CRISPR文庫篩選其合成致死基因，匹配已有藥物庫，或找到潛在的治療靶點，為個體化精準治療腫瘤提供了可能。