魯明騫 周東奎 高嫣 馮雪松 陸海燕 李薇 孔慶志 盧宏達 李莉娥

(1三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院腫瘤防治中心 宜昌市中心人民醫(yī)院腫瘤科，湖北 宜昌 443003；2武漢市中心醫(yī)院 武漢市腫瘤研究所；3宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)估計2017年美國婦女中有25萬例新發(fā)浸潤性乳腺癌患者和4萬乳腺癌死亡病例，其發(fā)病率和死亡率均占惡性腫瘤的第二位〔1〕。我國乳腺癌發(fā)病率和死亡率也呈逐年增加趨勢，位居女性惡性腫瘤的第一位，而且具有年輕化趨向。乳腺癌的治療目前已形成了以手術(shù)治療為主，聯(lián)合化療、放療、內(nèi)分泌、靶向藥物、免疫和中醫(yī)中藥等多種手段的綜合治療措施，但仍易出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移〔2，3〕。因此，尋找新的分子靶點和新的治療藥物，來進一步闡明乳腺癌的發(fā)病機制，對乳腺癌的診治具有十分重要的意義。

miRNA是一類十分重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子的非編碼小分子RNA，其長度由20～25個核苷酸組成，參與并調(diào)控人類約30%的編碼基因，具有高度的穩(wěn)定性和組織細胞來源的特異性，能影響蛋白質(zhì)的表達〔4〕。通過調(diào)控靶基因miRNA的降解或抑制其翻譯后，細胞的發(fā)育、增殖、分化和凋亡等會受到一定影響〔5〕。目前研究已發(fā)現(xiàn)的miRNA多達2 000多種，參與多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展〔6～8〕，在腫瘤診斷、治療與預(yù)后中發(fā)揮重要作用。

前期研究我們發(fā)現(xiàn)槐耳清膏能抑制乳腺癌MCF-7細胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡〔9〕。既往研究表明，miR-126在乳腺癌的進程中起著重要作用，但槐耳清膏作用于乳腺癌MCF-7細胞的具體機制目前還不十分清楚，本研究將槐耳清膏作用于乳腺癌MCF-7細胞后，探討miR-126表達與乳腺癌細胞增殖的影響，進一步了解槐耳清膏治療乳腺癌的分子作用機制。

1 材料與方法

1.1細胞株 人乳腺癌MCF-7細胞購自美國Amercian Type Culture Collection(ATCC)。

1.2藥物與主要試劑 槐耳清膏由江蘇啟東蓋天力藥業(yè)有限公司提供，將精確重量的槐耳清膏溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)中，制成濃度為100 mg/ml的槐耳清膏儲備液，并過濾除菌，-20℃儲存?zhèn)溆?。RPMI1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司，10%胎牛血清購自美國Hyclone，RNA提取試劑盒、miR-126引物系列試劑盒及RT-PCR試劑盒購自德國Qiagen公司。

1.3細胞培養(yǎng)及分組 乳腺癌MCF-7細胞平鋪于六孔板中，5% CO2，37℃培養(yǎng)24 h后，分別加入濃度為3、6、9 mg/ml槐耳清膏溶液，并加入相同體積PBS，5% CO2，37℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，待提取RNA。取槐耳清膏儲備液，加入RPMI1640培養(yǎng)液和DMEM培養(yǎng)基制成濃度分別為3、6、9 mg/ml的槐耳清膏作為實驗組，取RPMI1640培養(yǎng)液為空白對照組，采用RT-PCR相對定量法來檢測miR-126的相對表達量，噻唑藍(MTT)法測定MCF-7細胞轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染miR-126 inhibitor或control的值。

1.4RNA的提取 加入Trizol和0.2 ml三氯甲烷，室溫放置5～10 min，4℃ 25 000 r/min離心10 min，上層水相加入等體積的異丙醇沉淀水相中的RNA，室溫放置20 min，離心沉淀，加入1 ml現(xiàn)配的75%乙醇，離心5 min，棄上清，-70℃超低溫冰箱保存。

1.5實時熒光定量PCR 采用實時熒光定量PCR中的2-△△Ct法，以對照組濃度為0 mg/ml的量作為內(nèi)參，檢測到的Ct值來計算miR-126的表達量，取出少量的RNA溶液用Tris-EDTA緩沖液稀釋后，測定其在分光光度計為260 nm和280 nm處的吸光度值，來測定RNA溶液濃度。miR-126引物序列根據(jù)TaqMan miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書進行(正義鏈：CTCGCCCACCTACAGCAT，反義鏈：GACTTGACCACCGAACCC)，共40個循環(huán)，以U6 RNA作為內(nèi)參值，2-△△Ct作為相對定量計算公式。

1.6miR-126 inhibitor使槐耳清膏抑制乳腺癌MCF-7的增殖作用減弱 乳腺癌MCF-7細胞經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-126 inhibitor(miR-126 inhibitor組)或者control(空白對照組)后，重鋪96孔板，每孔加入乳腺癌MCF-7，5%CO2，37℃培養(yǎng)12 h，然后加入濃度6 mg/ml的槐耳清膏溶液(轉(zhuǎn)染control+6 mg/ml槐耳清豪溶液為6 mg/ml組，轉(zhuǎn)染miR-126 inhibitor+6 mg/ml槐耳清膏溶液為6 mg/ml+miR-126 inhibitor組)，5% CO2，37℃繼續(xù)培養(yǎng)48 h。10 μl MTT試劑繼續(xù)培養(yǎng)3 h，用酶標(biāo)儀測定溶液OD490檢測細胞的存活情況。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗及單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1槐耳清膏影響miR-126的表達 當(dāng)槐耳清膏濃度為3 mg/ml、6 mg/ml和9 mg/ml時，其值分別是對照組的1.44倍、2.56倍和2.88倍，各濃度組均能上調(diào)miR-126的表達，且6 mg/ml與9 mg/ml組miR-126表達顯著高于0 mg/ml和3 mg/ml組。見表1。

2.2槐耳清膏影響Pre-miR-126的表達 槐耳清膏濃度為3 mg/ml、6 mg/ml和9 mg/ml分別是對照組的1.26倍、2.51倍和2.98倍，不同濃度組的槐耳清膏溶液均能上調(diào)Pre-miR-126的表達，且6 mg/ml與9 mg/ml組Pre-miR-126表達顯著高于0 mg/ml組和3 mg/ml組。見表1。

表1 各組miR-126、Pre-miR-126表達比較

2.3抑制miR-126使槐耳清膏對乳腺癌MCF-7細胞的抑制作用減弱 與空白對照組比較，6 mg/ml組細胞抑制作用明顯降低(1.00±0.00 vs 0.04±0.01；P<0.05)；與miR-126 inhibitor組比較，6 mg/ml+miR-126 inhibitor組細胞雖受到抑制作用，但抑制作用不強(1.19±0.23 vs 0.90±0.12;P>0.05)。

3 討 論

乳腺癌的發(fā)生是多因素、多步驟的過程，miRNA及其靶基因在細胞的生長過程中保持著相對較穩(wěn)定水平，從而維持著機體的正常生理功能〔10〕，體內(nèi)的這種相對平衡關(guān)系一旦被打破，可能是導(dǎo)致乳腺癌發(fā)生的分子機制之一。研究證實miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中參與了多種信號的調(diào)控，臨床已將miRNA表達的異常差異與惡性腫瘤的關(guān)系進行了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、療效和預(yù)后等密切相關(guān)〔11〕，它可以通過調(diào)控下游信號的傳導(dǎo)通路從而影響腫瘤的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移〔12,13〕。研究發(fā)現(xiàn)miR-126、miR-199等多個miRNA與乳腺癌中的表達及臨床具有十分重要的意義〔14,15〕，參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和遷移〔16〕。體外實驗研究發(fā)現(xiàn)miR-126除能影響原發(fā)腫瘤的大小外，對腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移灶的形成也有一定作用〔17〕。王承正等〔18〕采用RT-PCR 檢測20例乳腺癌組織和癌旁組織中miR-126的表達，進一步研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中miR-126 表達明顯低于癌旁正常組織中miR-126的表達(P<0.05)，miR-126的高表達明顯抑制了MCF-7和MDA-MB-231細胞株的侵襲性(P<0.05)。

本研究結(jié)果顯示，不同濃度的槐耳清膏溶液對miR-126及Pre-miR-126的表達具有上調(diào)作用，隨著槐耳清膏藥物濃度的增加，miR-126的表達越來越明顯。既往的實驗研究證明miR-126在乳腺癌中是抑制基因，能抑制腫瘤細胞的生長〔19〕，與本研究結(jié)果一致。乳腺癌患者中miR-126低表達與高表達的患者進行比較，總無轉(zhuǎn)移生存期更短，故miR-126表達缺失可能與無復(fù)發(fā)生存具有相關(guān)性〔20〕。

本實驗研究結(jié)果表明，miR-126作為乳腺癌的一種抑癌基因，對乳腺癌細胞的生長具有抑制作用，槐耳清膏可能通過上調(diào)miR-126的表達，達到抑制乳腺癌的增殖作用。miR-126作為人體內(nèi)一種十分重要的抑癌基因，其表達量的變化與乳腺癌細胞增殖和凋亡密切相關(guān)。米旭光等〔21〕研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染 miR-126 模擬物使乳腺癌細胞中miR-126 表達上調(diào)，增強腫瘤微血管形成相關(guān)的 VEGF 基因表達進一步降低，從而發(fā)揮著抑制乳腺癌的發(fā)展，降低乳腺癌轉(zhuǎn)移的可能。Wang等〔22〕研究認(rèn)為miR-126 作為乳腺癌轉(zhuǎn)移的抑制因子之一，miR-126表達的缺失是導(dǎo)致乳腺癌復(fù)發(fā)和預(yù)后不良的一種重要因素，其機制可能是通過抑制乳腺癌細胞的細胞周期進程有關(guān)。

綜上所述，槐耳清膏能抑制miR-126及Pre-miR-126的表達，從而抑制乳腺癌MCF-7細胞的增殖，這為槐耳清膏的抗腫瘤作用提供了新的分子機制。