王琳 趙麗 魏慧麗 趙俊峰 安志超 謝惠迪 郭燕 宿家銘 柳紅芳

(1北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院，北京 100700；2河南省中醫(yī)院)

糖尿病腎臟病(DKD)是全球?qū)е陆K末期腎病的主因〔1〕，其治療以降低尿蛋白為主，而足細(xì)胞損傷引起的蛋白尿是DKD進(jìn)展的關(guān)鍵。芪地糖腎方(QDTS)(專(zhuān)利號(hào)：201711097315.2)由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院柳紅芳教授依據(jù)明代醫(yī)家張介賓“真陰精氣”學(xué)說(shuō)為理論基礎(chǔ)并結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)擬創(chuàng)而成〔2〕。QDTS針對(duì)DKD 蛋白尿的臨床療效頗佳〔3,4〕。研究證明QDTS可激活db/db小鼠腎臟自噬相關(guān)營(yíng)養(yǎng)感知信號(hào)通路，調(diào)控自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ、P62、Beclin1等表達(dá)起到保護(hù)小鼠腎臟的作用〔5,6〕，本研究探討QDTS對(duì)高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞自噬相關(guān)因子表達(dá)的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)藥物：QDTS凍干粉(原藥材購(gòu)自北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院)。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：小鼠足細(xì)胞MPC5(東直門(mén)實(shí)驗(yàn)室劉偉敬老師團(tuán)隊(duì)饋贈(zèng))。主要試劑和儀器：TRYPSIN 0.25%乙二胺四乙酸(EDTA、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(無(wú)糖)、胎牛血清、青霉素-鏈霉素溶液購(gòu)自Invitrogen公司；二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自SIGMA公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)購(gòu)自美國(guó)Solarbio公司；蛋白提取放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑、蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)均購(gòu)自Solarbio公司；移液器購(gòu)自Eppendorf；兔多克隆抗體兔抗鼠LC3Ⅱ、P62、SIRT1一抗購(gòu)自Abcam公司；電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影劑購(gòu)自Biorad；蛋白上樣緩沖液購(gòu)自普利萊。其他生化試劑：無(wú)水乙醇、氯仿、異丙醇、多聚甲醛、過(guò)硫酸銨(APC)、水等均由北京中醫(yī)藥大學(xué)附屬東直門(mén)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供。HDL潔凈工作臺(tái)：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱：Thermo公司；臺(tái)式低溫高速離心機(jī)：3K15型，德國(guó)Sigma公司；渦旋機(jī)：QL-861，Qilinbeibr；細(xì)胞刮刀：購(gòu)自Corning；自動(dòng)超純水蒸饋器：Milli-Q型，Integral公司；光譜掃描多功能酶標(biāo)儀：Promega公司；倒置相差顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus公司；電泳儀購(gòu)自Biorad公司。

1.2實(shí)驗(yàn)分組 體外培養(yǎng)小鼠足細(xì)胞MPC5，葡萄糖35 mmol/L干預(yù)48 h成功建立高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞模型，分為空白對(duì)照組(正常足細(xì)胞)、高糖模型組、QDTS低、中、高劑量組(中藥凍干粉分別為0.1、0.2、0.4 mg/ml)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) 取出細(xì)胞凍存管，于37℃水浴鍋中融化，1 000 r/min室溫離心5 min，棄凍存液用完全培養(yǎng)基洗滌，離心重懸后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置33℃、5%CO2恒溫箱增殖培養(yǎng)2～3 d，轉(zhuǎn)移至37℃、5%CO2分化。細(xì)胞計(jì)數(shù)：制備單個(gè)細(xì)胞懸液，在細(xì)胞計(jì)數(shù)板中央放置計(jì)數(shù)專(zhuān)用的蓋玻片，細(xì)胞懸液吹打均勻后轉(zhuǎn)移EP管中，沿蓋玻片邊緣加入，置顯微鏡計(jì)數(shù)四角大方格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)，細(xì)胞密度=(4個(gè)大格子細(xì)胞總數(shù)/4)×104個(gè)/ml。

1.4細(xì)胞免疫熒光染色 12孔板細(xì)胞爬片分組培養(yǎng)至其生長(zhǎng)融合到70%～80%，PBS洗3遍；4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS洗3遍；0.2%Triton X-100通透5 min，PBS洗3遍；5%牛血清白蛋白(BSA)室溫封閉30 min；一抗?jié)窈?℃內(nèi)過(guò)夜，PBS洗3遍，二抗室溫2 h(避光)，PBS洗3遍；4',6'-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染細(xì)胞核：在避光的條件下，加入用PBS稀釋5 000倍的1 μg/ml DAPI，在室溫下放置5 min，然后使用預(yù)冷的1‰ Tween清洗2次，每次清洗5 min，繼而用預(yù)冷PBS洗5 min，蒸餾水洗掉PBS，95%甘油封片。免疫熒光分析：圖中柔和的小亮點(diǎn)即目的蛋白的具體表達(dá)部位，3位病理從業(yè)者獨(dú)立對(duì)其進(jìn)行了盲法評(píng)分，根據(jù)數(shù)量從最小到最大分為5個(gè)層次。

1.5Western印跡蛋白提取 PBS清洗，加入蛋白裂解液(RIPA+蛋白酶抑制劑)，細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞移至離心管，4℃、3 000 r/min、5 min離心。蛋白定量(Solarbio BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒)96孔板設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品、樣品、設(shè)2個(gè)復(fù)孔；每孔200 μl BCA工作液；稀釋待測(cè)樣品至合適濃度，總體積20 μl，BCA工作液200 μl、37℃、30 min、酶標(biāo)儀562 nm波長(zhǎng)，記錄OD值；5×蛋白上樣緩沖液加入混勻后，100℃，水浴10 min。配分離膠(H2O、30%Acr-Bis、分離膠緩沖液、10%APS、TEMED)，配濃縮膠(H2O、30%Acr-Bis、分離膠緩沖液、10%APS、TEMED)，加TEMED后，將孔梳插入濃縮膠后置入電泳槽，加電泳液(Tris-甘氨酸緩沖液 SDS)，拔出梳子，加樣，Mark，按上樣質(zhì)量為20 μg的體積加入電泳道內(nèi)；電泳100 V、1.5 h分離膠；80 V濃縮膠；NC膜浸潤(rùn)甲醇中15 s活化，將聚偏氟乙烯(PVDF)膜、濾紙浸入1×電轉(zhuǎn)移液中(Tris、甘氨酸、甲醇)半干轉(zhuǎn)15 V 1.5 h；TBST洗，5%脫脂奶粉(2 g脫脂奶粉+4 ml TBST混勻)封閉后TBS清洗，孵育一抗LC3Ⅱ、P62、SIRT1、β-actin 4℃過(guò)夜；TBS洗7次，5 min/次，二抗羊抗鼠1.5 h，顯色。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行ANOVA單因素方差分析、Welch檢驗(yàn)、LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1QDTS對(duì)高糖刺激足細(xì)胞MPC5自噬相關(guān)蛋白表達(dá)影響 與空白對(duì)照組比較，高糖模型組LC3Ⅱ、SIRT1表達(dá)顯著降低，P62表達(dá)顯著升高(均P<0.01);與高糖模型組比較，QDTS低、中、高各劑量組LC3Ⅱ、SIRT1表達(dá)均顯著升高，P62表達(dá)均顯著降低(均P<0.001)。見(jiàn)圖1、表1。

2.2QDTS對(duì)高糖刺激足細(xì)胞MPC5 LC3Ⅱ、P62免疫熒光表達(dá)影響 與空白對(duì)照組比較，高糖模型組P62表達(dá)顯著升高,而LC3Ⅱ表達(dá)顯著降低(P<0.001)；與高糖模型組比較，QDTS低、中、高各劑量組LC3Ⅱ表達(dá)顯著升高，P62表達(dá)顯著降低(均P<0.001)。見(jiàn)表1、圖2。

1～5:空白對(duì)照組，高糖模型組，QDTS低劑量組，QDTS中劑量組，QDTS高劑量組圖1 各組MPCS細(xì)胞SIRT1、P62、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)

表1 各組MPC5細(xì)胞SIRT1、P62、LC3Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

圖2 QDTS刺激高糖足細(xì)胞LC3Ⅱ、P62免疫熒光蛋白表達(dá)(DAPI，×100)

3 討 論

DKD是以虛實(shí)夾雜、氣陰兩虛為病機(jī)基礎(chǔ)，日久耗氣傷陰至肝腎不足，陰陽(yáng)兩虛，脾腎陽(yáng)虛的疾病〔7〕。中醫(yī)治療應(yīng)分清標(biāo)本緩急，早期重在扭轉(zhuǎn)病勢(shì)，中后期重在延緩病情進(jìn)程〔8〕。糖尿病無(wú)腎臟疾病階段，氣陰兩虛為主要病機(jī)，伴隨疾病的發(fā)展導(dǎo)致人體陰精虧損，腎藏精，逐漸形成腎精虧損的癥狀，多體現(xiàn)為蛋白尿陽(yáng)性。腎臟精氣虧損無(wú)力推動(dòng)血脈運(yùn)行致血流不暢、脈絡(luò)痹阻〔9〕。柳紅芳教授根據(jù)長(zhǎng)期臨床經(jīng)驗(yàn)結(jié)合當(dāng)前DKD相關(guān)三焦失用說(shuō)、脾失健運(yùn)說(shuō)、微型徵瘕說(shuō)、毒損腎絡(luò)等學(xué)說(shuō)提出DKD的核心病機(jī)為精損絡(luò)痹，以填精通絡(luò)為治療法則，并擬QDTS(黃芪、熟地、芡實(shí)、水蛭、大黃等)〔10〕，經(jīng)臨床和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證療效顯著〔3，11，12〕。DKD初期以間歇性蛋白尿?yàn)橹?，隨著病情發(fā)展出現(xiàn)持續(xù)性蛋白尿、低蛋白血癥等最終導(dǎo)致腎病綜合征、慢性腎衰竭并死于尿毒癥，因此，有效控制蛋白尿的發(fā)生發(fā)展是DKD治療的關(guān)鍵因素〔13，14〕。足細(xì)胞是一種過(guò)濾血液、阻止血漿蛋白進(jìn)入尿?yàn)V液的特殊腎小球細(xì)胞，是腎小球?yàn)V膜的基本組成部分，其形成的狹縫隔膜對(duì)維持腎小球的完整性和功能至關(guān)重要，其密度降低及功能損傷可引起蛋白尿、小管間質(zhì)病變，并最終發(fā)展為終末期腎病〔15，16〕，足細(xì)胞功能改變是蛋白尿發(fā)生發(fā)展的重要影響因子〔17〕。自噬是足細(xì)胞、近端小管、系膜和內(nèi)皮細(xì)胞的重要保護(hù)機(jī)制，調(diào)控足細(xì)胞自噬可改變DKD發(fā)生發(fā)展〔18，19〕。高水平的葡萄糖會(huì)造成足細(xì)胞損傷，但很少報(bào)道高濃度葡萄糖和細(xì)胞自噬之間的關(guān)系，研究表明，高糖可促進(jìn)足細(xì)胞的自噬，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)需要自噬作用清除的毒性物質(zhì)時(shí)，LC3首先被裂解為L(zhǎng)C3Ⅰ，然后再經(jīng)過(guò)磷脂酰乙醇胺加工修飾而轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)C3Ⅱ，然后再被募集到自噬體膜上，所以L(fǎng)C3Ⅱ也被公認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)自噬活性的早期標(biāo)志蛋白〔20〕；SIRT1激動(dòng)劑白藜蘆醇能夠增強(qiáng)SIRT1表達(dá)，改善胰島素抵抗，降低血糖，促進(jìn)線(xiàn)粒體再生，還能減輕系膜細(xì)胞增生，改善足細(xì)胞損傷，增強(qiáng)腎臟自噬活性和減輕炎癥及減輕腎臟內(nèi)氧化壓力等多個(gè)途徑發(fā)揮治療DKD的作用〔21，22〕。本研究提示中藥QDTS上調(diào)了自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ、SIRT1表達(dá)，同時(shí)減少了自噬轉(zhuǎn)運(yùn)底物P62的蓄積，與db/db小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)基本一致。本研究表明QDTS對(duì)db/db小鼠具有不依賴(lài)血糖控制的腎保護(hù)作用,可能歸因于自噬相關(guān)營(yíng)養(yǎng)感知信號(hào)的調(diào)節(jié)〔5〕，該研究從體外實(shí)驗(yàn)初步探討驗(yàn)證相關(guān)結(jié)論，但仍需深入研究其相關(guān)作用機(jī)制和靶點(diǎn)。