師中迪,宋雪婷,余旭亞

(昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,云南 昆明,650500)

化石燃料過(guò)度使用導(dǎo)致的土地坍塌、溫室效應(yīng)及環(huán)境污染問(wèn)題日益嚴(yán)重,開(kāi)發(fā)新型能源成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)[1]。生物柴油具有碳中和、閃點(diǎn)高、可再生等優(yōu)點(diǎn),被視為化石能源的理想替代品。而微藻因其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、光合效率高且生長(zhǎng)周期短等優(yōu)勢(shì),被視為生物柴油的第三代原料[2]。但在傳統(tǒng)養(yǎng)殖條件下,油脂產(chǎn)率低、生產(chǎn)成本高等問(wèn)題限制了微藻生物柴油的商業(yè)化進(jìn)程[3]。

微藻的生物量積累與油脂合成受諸多環(huán)境因素影響。強(qiáng)光、缺氮、高鹽及重金屬離子等非生物脅迫條件被證明可直接促進(jìn)微藻油脂的合成[4]。在諸多脅迫條件中,鹽脅迫被證明是促進(jìn)微藻產(chǎn)油的有效方式[5-6]。另外,植物激素可調(diào)控微藻生物量的積累和代謝物的合成[7-8]。近期研究表明,在非生物脅迫條件下,植物激素能夠通過(guò)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)來(lái)促進(jìn)油脂合成[9-10]。因此,鹽脅迫聯(lián)合植物激素可能是促進(jìn)微藻油脂產(chǎn)率的有效策略。

褪黑素(melatonin,MT),是一種具有抗氧化活性的內(nèi)源性植物激素,可以消除活性氧(reactive oxygen species,ROS)、提高植物抗脅迫能力等[11-12]。而這些作用近似于黃腐酸,在非生物脅迫下黃腐酸被證明可以促進(jìn)微藻的油脂含量[13]。由此推測(cè),鹽脅迫下,外源添加 MT可能會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)微藻中油脂的合成。

本實(shí)驗(yàn)探索了MT對(duì)鹽脅迫下富油微藻單針藻Monoraphidiumsp.QLY-1油脂合成及相關(guān)生理生化指標(biāo)的影響,并探討了MT對(duì)胞內(nèi)ROS含量及抗氧化劑谷胱甘肽(glutathione,GSH)活性的影響,分析了外源MT調(diào)控藻細(xì)胞中ROS水平和油脂合成之間的關(guān)系,為促進(jìn)微藻產(chǎn)油提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

單針藻Monoraphidiumsp.QLY-1由本實(shí)驗(yàn)組篩選、保存；BG-11培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；植物激素(褪黑素)，生工生物工程有限公司；TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒，寶 (TaKaRa) 生物工程(大連)有限公司；活性氧(reactive oxygen species,ROS)測(cè)定試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；谷胱甘肽(GSH)測(cè)定試劑盒,南京建成生物技術(shù)有限公司。本文所用試劑均為分析純級(jí)，鼎國(guó)試劑公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

分析天平(FA2004 N),上海箐海儀器有限公司；恒溫(恒濕)振蕩搖床(TS-2011GZ),上海百典儀器設(shè)備有限公司；高速離心機(jī)(5804R),Eppendorf；滅菌鍋(LDZX-50KBS)上海申安醫(yī)療器械廠；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(Ultrospec 2100 pro),Amersham Biosciences；真空冷凍干燥機(jī)(FD5-12),上海一恒科學(xué)儀器有限公司；qPCR儀(ABI-7500),江蘇天瑞精準(zhǔn)醫(yī)療科技有限公司；超凈工作臺(tái)(VS-840-1),上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微藻培養(yǎng)

采用BG-11培養(yǎng)基,添加葡萄糖至質(zhì)量濃度為10 g/L,將單針藻Monoraphidiumsp.QLY-1接種于含有250 mL培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中,用搖床(溫度25 ℃,轉(zhuǎn)速150 r/min)異養(yǎng)培養(yǎng)11 d至對(duì)數(shù)期末端。將異養(yǎng)種子液接種到含有20 g/L NaCl的BG-11培養(yǎng)基(初生物量約為0.9 g/L),作為對(duì)照組；同時(shí)添加MT(1、10、100 μmol/L)作為實(shí)驗(yàn)組,在搖床中培養(yǎng)3 d,光強(qiáng)30 μmol/(m2·s)、溫度25 ℃、轉(zhuǎn)速150 r/min,,每組設(shè)置3個(gè)平行樣。

1.2.2 生物量和油脂含量的測(cè)定

取10 mL的培養(yǎng)液(V),5 000 r/min離心10 min后去除上清液并收集生物質(zhì),放于真空冷凍干燥機(jī)48 h,稱取干藻粉質(zhì)量(m1),按公式(1)計(jì)算生物量：

(1)

微藻油脂含量的檢測(cè)采用BLIGH等[14]的方法。向研缽中加入3 mL氯仿-甲醇溶液(體積比為2∶1)來(lái)提取油脂,在150 r/min搖床中晃動(dòng)提取30 min,5 000 r/min離心10 min,取上清液。重復(fù)以上步驟2～3次,將上清液移至預(yù)先稱質(zhì)量的管(m2)中。將管放置于40 ℃干燥箱中處理至質(zhì)量恒定(m3),按照公式(2)計(jì)算油脂含量：

(2)

1.2.3 碳水化合物和蛋白質(zhì)的測(cè)定

按照BERGES等[16]的方法提取并測(cè)定總蛋白的含量。根據(jù)MA等[17]的方法測(cè)定總碳水化合物含量。

1.2.4 油脂合成相關(guān)基因表達(dá)分析

采用TRIzol法提RNA,用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,具體操作參考CHE等[18]的方法。

以cDNA為模板,利用TB Green熒光染料,通過(guò)熒光定量 PCR 儀進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,具體步驟參照Z(yǔ)HAO等[15]的方法。酶基因熒光定量引物me和accD序列參照文獻(xiàn)[9]。依據(jù)擴(kuò)增曲線,根據(jù)2-△△T法計(jì)算各基因相對(duì)表達(dá)量[19]。

1.2.5 ROS和GSH的測(cè)定

ROS和GSH的測(cè)定,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.6 脂肪酸組成檢測(cè)

向提取的油脂中加入2 mL 體積分?jǐn)?shù)為3%的 硫酸-甲醇(V∶V=3∶97)混合溶液,在70 ℃水浴中回流4 h進(jìn)行脂肪酸甲酯化,加入2 mL正己烷振動(dòng)提取4 h,取正己烷相進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析[15]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)平行樣,數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差,通過(guò)SPSS 19.0軟件中ANOVA分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。最小顯著性差異進(jìn)行多重比較,檢驗(yàn)試驗(yàn)的組間差異。*P<0.05表示差異顯著,**P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 鹽脅迫下MT對(duì)單針藻QLY-1細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

在鹽質(zhì)量濃度20 g/L時(shí),測(cè)定了不同濃度MT下單針藻QLY-1的生長(zhǎng)情況。如圖1所示,所有組的生物量在3 d的培養(yǎng)時(shí)間中都有所增加。在20 g/L NaCl作用下,微藻生物量從1.05 g/L下降到0.96 g/L,比對(duì)照組降低了9.14%。另外,10 μmol/L MT單獨(dú)處理對(duì)微藻的生物量沒(méi)有顯著影響。在鹽脅迫下,濃度1～100 μmol/L的MT處理對(duì)單針藻QLY-1的生長(zhǎng)情況也沒(méi)有顯著影響。LI等[7]也發(fā)現(xiàn)1～100 μmol/L的MT處理對(duì)單針藻QLY-1的生物量影響不具顯著性。因此,可初步斷定,低濃度(<1 mmol/L)的MT處理對(duì)單針藻QLY-1生物量不會(huì)造成顯著影響。此外,DING等[10]發(fā)現(xiàn)10 μmol/L MT處理會(huì)抑制雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)在高光和氮缺陷條件下的細(xì)胞生長(zhǎng),但可顯著提高蝦青素的積累量。在植物中,MT可以通過(guò)提高光合作用效率、消除ROS、提高抗氧化系統(tǒng)酶活性等方式來(lái)降低不良環(huán)境帶來(lái)的氧化損傷,提高種子的發(fā)芽率和幼苗生長(zhǎng)速率[20,31]。

圖1 鹽脅迫下不同濃度MT對(duì)單針藻QLY-1生物量的影響Fig.1 Effect of MT concentrations on the biomass of Monoraphidium sp.QLY-1 under salinity stress

而在非生物脅迫下,外源褪黑素可能更多地參與調(diào)控微藻中次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成。此外,響應(yīng)MT的分子串?dāng)_網(wǎng)絡(luò)需要進(jìn)一步的研究。

2.2 鹽脅迫下MT對(duì)單針藻QLY-1油脂積累的影響

如圖2所示,培養(yǎng)過(guò)程中,微藻油脂含量逐漸上升,并在第2天達(dá)到峰值。20 g/L NaCl 脅迫下,單針藻中油脂含量最大值由37.65%提高到42.92%。微藻在鹽脅迫下大量積累油脂可能歸因于NaCl處理對(duì)藻細(xì)胞造成氧化脅迫及ROS積累,是微藻在滲透壓增加下為保持細(xì)胞流動(dòng)性和完整性的一種適應(yīng)性機(jī)制[32]。10 μmol/L MT聯(lián)合20 g/L NaCl處理下的微藻油脂積累量達(dá)到最大(51.74%),相較于對(duì)照組(37.65%)、10 μmol/L MT處理組(45.76%)及20 g/L NaCl處理組(42.93%)分別提高了37.42%、13.07%和20.52%,并且在鹽脅迫下其他MT處理組油脂含量也有不同程度的提升。上述結(jié)果顯示,MT能夠與NaCl產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng),進(jìn)一步提高單針藻QLY-1在鹽脅迫下的油脂積累。另外,近期研究顯示,外源添加MT能夠促進(jìn)缺氮條件下單針藻QLY-1的油脂合成[21]。由此可知,在非生物脅迫下,外源添加MT可進(jìn)一步提高微藻中油脂的積累。因此,選取濃度為10 μmol/L MT進(jìn)行單針藻QLY-1在鹽脅迫下油脂合成機(jī)理的進(jìn)一步研究。

圖2 鹽脅迫下不同濃度MT對(duì)單針藻QLY-1油脂積累的影響Fig.2 Effect of MT concentrations on the lipid content of Monoraphidium sp.QLY-1 under salinity stress

2.3 鹽脅迫下MT對(duì)單針藻QLY-1生理生化指標(biāo)的影響

微藻通過(guò)光合作用固定的碳可用于合成能量物質(zhì),如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和碳水化合物。在外源MT處理下,微藻中碳水化合物量逐漸下降,并在培養(yǎng)周期的最后1 d低于對(duì)照組。同時(shí),在培養(yǎng)過(guò)程中,MT的添加抑制了鹽脅迫下的蛋白質(zhì)含量。類似地,在光誘導(dǎo)下,MT處理后單針藻細(xì)胞中碳水化合物含量相比于對(duì)照顯著下降[7]。另外,SONG等[8]的研究指出,在植物激素獨(dú)腳金內(nèi)酯處理下,單針藻QLY-1中油脂含量顯著提高,而碳水化合物和蛋白含量相較于對(duì)照組顯著下降。蛋白質(zhì)含量的降低,可能因?yàn)镸T誘導(dǎo)的藻細(xì)胞膜上蛋白質(zhì)發(fā)生降解[23]。因此,MT可能通過(guò)參與微藻中蛋白質(zhì)和碳水化合物的降解來(lái)改變碳代謝流,從而促進(jìn)油脂的積累。

a-碳水化合物；b-蛋白質(zhì)圖3 鹽脅迫下MT對(duì)單針藻QLY-1碳水化合物和蛋白質(zhì)含量的影響Fig.3 Effect of MT on the carbohydrate and protein contents of Monoraphidium sp.QLY-1 under salinity stress

2.4 鹽脅迫下MT對(duì)單針藻QLY-1油脂合成相關(guān)基因的影響

蘋果酸在NADP依賴型蘋果酸酶(malic enzyme，me)的催化下發(fā)生不可逆的脫羧反應(yīng)，產(chǎn)出丙酮酸、NADPH和CO2，從而參與微藻中多種代謝途徑，如油脂合成及光合作用。因此，me并被認(rèn)為是脂肪酸合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶[24]。乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACCase)的β碳基轉(zhuǎn)移酶(beta-carboxyltransferase，accD)編碼ACCase的β亞基，而ACCase催化乙酰輔酶A(acetyl-CoA)生成丙二酰輔酶A(malonyl-CoA)，是脂肪酸合成的第一步反應(yīng)。10 μmol/L MT誘導(dǎo)對(duì)me和accD基因相對(duì)表達(dá)量的影響如圖4所示。me和accD基因分別在第2天和第3天相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高,是鹽脅迫組的1.75和1.40倍。有研究發(fā)現(xiàn),通過(guò)過(guò)表達(dá)accD基因能夠顯著增強(qiáng)大腸桿菌(Escherichiacoli)中脂肪酸的合成[24]。此外,多個(gè)研究證明[8,13,25],微藻中me和accD基因的轉(zhuǎn)錄水平與脂質(zhì)合成情況正相關(guān)。結(jié)果顯示,MT能夠通過(guò)上調(diào)油脂合成相關(guān)基因的表達(dá)從而提高微藻的產(chǎn)油能力。

圖4 鹽脅迫下MT對(duì)單針藻QLY-1油脂合成相關(guān)基因的影響Fig.4 Effect of MT on the lipogenic genes of Monoraphidium sp.QLY-1 under salinity stress

2.5 鹽脅迫下MT對(duì)單針藻QLY-1細(xì)胞內(nèi)ROS、GSH的影響

ROS作為重要的第二信使,關(guān)聯(lián)多種代謝途徑及免疫反應(yīng),并在油脂合成過(guò)程中扮演重要角色,其信號(hào)傳導(dǎo)途徑是近年來(lái)的研究熱門[26]。圖5顯示,在高鹽條件下,ROS水平隨培養(yǎng)時(shí)間逐漸上升。而MT處理顯著地抑制了ROS水平,在第3天僅是鹽脅迫組的55.95%。GSH作為細(xì)胞中關(guān)鍵的抗氧化劑,對(duì)減輕非生物脅迫引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)起重要作用[27]。與ROS變化水平一致,在高鹽條件下,GSH含量逐漸上升。而MT顯著抑制了GSH含量,在培養(yǎng)第3天僅是鹽脅迫對(duì)照組的74.04%。

a-ROS；b-GSH圖5 鹽脅迫下MT對(duì)單針藻QLY-1 ROS和GSH水平的影響Fig.5 Effect of MT on the levels of ROS and GSH in Monoraphidium sp.QLY-1 under salinity stress

MT作為一種有效的抗氧化劑,能夠有效地清除胞內(nèi)由于缺氮引起過(guò)量積累的ROS以及細(xì)胞損傷[7]。此外,MT可通過(guò)提高紅球藻中抗氧化酶活性從而緩解由高光照及缺氮導(dǎo)致的氧化損傷[28]。因此,外源MT能夠有效地降低藻細(xì)胞內(nèi)的ROS含量,使微藻細(xì)胞避免因環(huán)境脅迫造成的氧化損傷,從而保持細(xì)胞的正常代謝。

2.6 鹽脅迫下MT對(duì)單針藻QLY-1脂肪酸組成的影響

油脂的脂肪酸組成是衡量油脂是否作為生物柴油原料的重要指標(biāo)。與鹽脅迫處理組相比, 1 μmol/L MT處理組中,C16∶0值有所下降而C18∶1含量上升,從而使飽和脂肪酸(saturated fatty acid,SFA)含量上升,單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acid,MUFA)含量下降,而多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)含量幾乎不變(表1)。相反地,10 μmol/L MT處理下的C18∶1和C20∶1含量分別提高了29.91%和94.85%,而C18∶2下降了16.03%,從而使得實(shí)驗(yàn)組中MUFA含量相比于對(duì)照組升高了27.76%,PUFA含量下降了11.89%,SFA含量幾乎不變。100 μmol/L MT處理組的脂肪酸變化與10 μmol/L MT處理組相似。提高脂肪酸中MUFA的含量,尤其是C18∶1,可以提高生物柴油的質(zhì)量[29]。此外,MT處理下脂肪酸的不飽和度(degree of unsaturation,DU)與對(duì)照組差異不顯著,且均小于137(歐盟生物柴油標(biāo)準(zhǔn)UNE-EN14214)。因此,基于DU值和MUFA含量分析,微藻油脂可作為生產(chǎn)生物柴油的原料,而通過(guò)添加適宜濃度的MT可獲得更具有市場(chǎng)價(jià)值的生物柴油。

與一些典型的可作為生物柴油生產(chǎn)原料的植物油相比,單針藻QLY-1所產(chǎn)油脂脂肪酸具有更高的C16∶0和C18∶3值以及更低的C18∶1含量,這就使得藻油的SFA值高于植物油,而PUFA含量和DU值較低。脂肪酸的SFA值越高則碳鏈越長(zhǎng),同時(shí)具有更高的十六烷值(cetane number,CN)[30]。柴油的CN值越高表明燃燒的發(fā)火性能好,燃燒均勻且滯燃期短。同時(shí),偏低的DU值和更長(zhǎng)的脂肪酸碳鏈?zhǔn)刮⒃逵椭葌鹘y(tǒng)植物油具有更好的穩(wěn)定性。因此,單針藻QLY-1可作為一種具有市場(chǎng)前景的生物柴油生產(chǎn)原料。

2.7 物料成本分析

上述結(jié)果表明,植物激素MT對(duì)鹽脅迫下培養(yǎng)的微藻的適應(yīng)性和脂質(zhì)積累有一定的改善作用。在不考慮人工成本情況下,根據(jù)本文數(shù)據(jù)進(jìn)行產(chǎn)量轉(zhuǎn)化,表2列出了對(duì)照組、鹽脅迫及鹽脅迫聯(lián)合MT三種培養(yǎng)模式下微藻油脂的物料生產(chǎn)成本。顯然,在BG-11培養(yǎng)基中添加NaCl和MT用于微藻油脂生產(chǎn)比單純使用BG-11培養(yǎng)基更加經(jīng)濟(jì),成本僅為BG-11的80.40%。這為植物激素耦合非生物脅迫進(jìn)行藻類生物燃料生產(chǎn)的概念奠定了基礎(chǔ)。此外,以MT聯(lián)合NaCl生物質(zhì)生產(chǎn)物料成本為例,生產(chǎn)1 kg微藻生物質(zhì)需要158.88元,而B(niǎo)G-11培養(yǎng)基成本為156.38元,占總物料成本的98.43 %。由此可見(jiàn),培養(yǎng)基的成本是限制微藻生物能源大規(guī)模發(fā)展的重要因素,因此,尋求廉價(jià)替代培養(yǎng)基對(duì)微藻生物能源發(fā)展進(jìn)程至關(guān)重要。

表1 不同培養(yǎng)條件下單針藻與典型生物柴油生產(chǎn)原料的植物油的脂肪酸組成比較Table 1 Comparison of the fatty acid profile in Monoraphidium sp.QLY-1 under different growth conditions and vegetable oils typically used to produce biodiesel

表2 不同培養(yǎng)條件下單針藻生物質(zhì)和油脂物料成本分析比較Table 2 Comparison of the material cost analysis of Monoraphidium sp.QLY-1 biomass and lipid production under different growth conditions

3 結(jié)論

外源MT上調(diào)了油脂合成相關(guān)基因的表達(dá)量,進(jìn)一步提高了單針藻Monoraphidiumsp.QLY-1在鹽脅迫下的油脂含量。在MT誘導(dǎo)下,胞內(nèi)蛋白質(zhì)和碳水化合物含量下降。且MT能夠通過(guò)改變GSH含量,有效地去除鹽脅迫下胞內(nèi)過(guò)量積累的ROS。隨著MT誘導(dǎo)微藻脂質(zhì)合成機(jī)制的進(jìn)一步研究,外源添加MT聯(lián)合鹽脅迫有望成為提高微藻油脂合成的有效策略。