樂莉,張亞青,宋爾群,陶曉奇*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院,重慶,400715) 2(西南大學(xué) 藥學(xué)院,重慶,400715)

非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染家豬和野豬引起的一種急性出血性嚴(yán)重傳染病。其主要特點是病程短、高熱、皮膚及內(nèi)臟出血、急性感染死亡率高[1]。世界動物衛(wèi)生組織已將ASF列為A類動物傳染病,目前尚無有效的預(yù)防疫苗[2]。ASF的持續(xù)傳播不僅影響到居民的肉類供應(yīng),也影響到全球肉類供應(yīng)的安全[3]。

目前檢測ASFV的金標(biāo)準(zhǔn)檢測方法是病毒分離,但存在耗時長、成本高等不足[4]。血清學(xué)檢測也是檢測ASFV的主要方法[5],如ELISA和熒光抗體試驗,但是不適合早期、快速檢測ASFV (抗體在感染后約14 d產(chǎn)生,檢測過程存在延遲)[6-7]。膠體金技術(shù)雖然快速簡單,但是靈敏度相對較低[8]。分子生物學(xué)方法比如PCR[9]、實時PCR[10],逆轉(zhuǎn)錄PCR[11-12]和線性指數(shù)PCR[13]因其高靈敏度被廣泛應(yīng)用于檢測ASFV。然而,PCR方法存在耗時、設(shè)備昂貴和容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果等問題。目前也出現(xiàn)了一些用于ASFV檢測的等溫擴增技術(shù),環(huán)介導(dǎo)等溫擴增[14-15],重組酶聚合酶擴增[16]和交叉引物擴增[17]方法簡單、快速,但是存在假陽性結(jié)果和相對復(fù)雜的末端檢測。以上方法大部分用于豬血、臟器等臨床標(biāo)本。目前有關(guān)直接檢測食品中ASFV的研究很少,在日常食品中檢測出ASFV可以追蹤病毒來源,更廣泛地監(jiān)測病毒,進一步減少經(jīng)濟損失。

熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)是一對光敏分子之間的非輻射能量轉(zhuǎn)移過程。FRET是一種與距離有關(guān)的物理現(xiàn)象,能量通過分子內(nèi)的偶極-偶極相互作用從激發(fā)的供體熒光團轉(zhuǎn)移到受體熒光團。能量轉(zhuǎn)移可以發(fā)生的距離被限制在10 nm左右。受體分子不一定要以熒光的方式釋放能量(比如熒光淬滅)。當(dāng)受體發(fā)色團作為供體的淬滅劑時,供體熒光強度會由于FRET而降低或消失[18]。FRET技術(shù)因其檢測簡便、快速、靈敏等優(yōu)點,被廣泛應(yīng)用于多種靶標(biāo)物的檢測[19],如小分子[20]、細菌[21]、病毒[22]、細胞[23]等。本研究開發(fā)了一種利用量子點(quantum dots,QDs)和納米金(Au nanoparticles,AuNPs)構(gòu)建基于FRET的DNA生物傳感器,用于ASFV特異性基因序列檢測。在靶DNA缺失的情況下,ss-DNA-QDs(探針1)將與ss′-DNA-AuNPs(探針2)雜交,供體QDs與受體AuNPs距離變近,引發(fā)FRET效應(yīng),QDs的熒光被AuNPs淬滅。然而,在靶DNA存在的情況下,靶DNA與探針2競爭結(jié)合探針1,導(dǎo)致FRET被破壞,QDs的熒光恢復(fù)?；贔RET的DNA生物傳感器為食品安全研究提供了簡單、快速和特異的ASFV檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉、火腿、豬肉水餃, 中國重慶北碚永輝超市; 病毒核酸提取試劑盒，北京明日達科技發(fā)展有限公司。

HAuCl4(分析純)，國藥化學(xué)試劑有限公司;鏈霉親和素-QDs525(分析純)，中國武漢珈源量子點有限公司;非洲豬瘟病毒特異性基因(靶DNA根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)T/CVMA 5—2018實時熒光PCR檢測方法選擇ASFV p72基因片段)、隨機DNA序列,均為色譜純，上海生工生物技術(shù)有限公司，序列信息如表1所示。所有的緩沖液均用超純水制備。

表1 序列信息Table 1 Sequence information

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004A型電子分析天平,上海精天電子儀器有限公司；F—7000型熒光分光光度計,日本日立公司；UV-2450 型紫外-可見分光光度計,日本島津公司；Nano ZS ZEN3600型zeta電位及納米粒度儀,英國 Malvern公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 ss-DNA-QDs(探針1)的制備

基于鏈霉親和素與生物素的特異性親和力實現(xiàn)ss-DNA與QD的偶聯(lián)[24],鏈霉親和素-QDs525(1 μmol/L,10 μL)和生物素-ss-DNA(10 μmol/L,16 μL)同時加入到硼酸緩沖液(borate buffered saline，BBS)中(50 mmol/L,pH 8.4,174 μL),在37 ℃恒溫搖床中(150 r/min)反應(yīng)1 h。用截留分子質(zhì)量為50 kDa的超濾管4 ℃ 進行純化,10 000 r/min離心10 min,重懸于50 mmol/L pH 8.4的BBS中,用超濾管回收,3 400 r/min離心2 min。純化后的探針1置于4 ℃冰箱中避光保存。

1.3.2 AuNPs的制備

采用檸檬酸還原法[25]制備AuNPs。將三頸燒瓶在食人魚溶液[V(H2SO4)∶V(30%H2O2)=7∶3]中浸泡1 h,超純水清洗后備用。將50 mL去離子水和0.5 mL HAuCl4(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%)加入到三頸燒瓶中,用電熱套加熱攪拌至煮沸,迅速加入1.25 mL檸檬酸三鈉(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%)溶液,在300 ℃下攪拌反應(yīng)30 min,關(guān)閉熱源,繼續(xù)攪拌直至冷卻,最終產(chǎn)品在室溫下保存。

1.3.3 ss′-DNA-AuNPs(探針2)的制備

根據(jù)之前的報道[26]進行巰基修飾的DNA與AuNPs的偶聯(lián),將巰基修飾的ss′-DNA(27 μL,0.1 mmol/L)與醋酸緩沖液(3 μL,500 mmol/L,pH 5.2)混合,然后用三(2-羧乙基)膦(4.5 μL,10 mmol/L)進行活化,反應(yīng)在微離心管中于室溫下進行1 h。將活化的ss′-DNA加入到AuNPs(2 mL,3 nmol/L)中,輕輕搖勻,室溫避光孵育16 h。然后逐滴加入Tris-醋酸緩沖液(22 μL,500 mmol/L,pH 8.2)和NaCl (220 μL,0.1 mol/L),輕輕搖勻,室溫避光孵育24 h以上。探針2通過離心純化15 min(12 000 r/min)。收集底部剩余沉淀,用去離子水沖洗2次,去除未反應(yīng)的ss′-DNA,溶解于Tris-醋酸緩沖液(100 mmol/L NaCl,25 mmol/L 醋酸鹽,pH 8.2),最終產(chǎn)品取200 μL濃縮至60 μL,此時ss′-DNA-AuNPs終濃度為10 nmol/L。

“軍人出身的人，動不動會有軍事機密，執(zhí)行前不準(zhǔn)外泄，所以一般情況下，他說什么我就按他說的辦，不問為什么，問了也不講，白問，這些年習(xí)慣了。他今天走前，叫我也去，叫我一定把你和丫頭拉上。說你們五個也到團里開會。只交待這么多，哪知道今天是這樣啊?！?/p>

1.3.4 探針的表征

制備15 g/L的瓊脂糖凝膠。電泳液為5×TBE(54 g Tris,27.5 g硼酸,20 mL 0.5 mol/L EDTA,pH 8.0)稀釋成0.5×TBE備用。瓊脂糖(0.45 g)和電泳溶液(30 mL)置于錐形瓶中,微波加熱1 min,待瓊脂糖溶解后,加入1 μL GoldView核酸染料,冷卻成凝膠。ss-DNA-QDs(20 nmol/L,8 μL)與2 μL loading buffer混合均勻之后上樣,電壓120 V,電泳時間60 min,電泳后取出凝膠,用凝膠成像儀進行成像。利用Nano ZS ZEN3600動態(tài)光散射測量了AuNPs的粒度和zeta電位。采用紫外可見分光光度計進行AuNPs吸收光譜測量。使用熒光分光光度計進行QDs發(fā)射光譜測量。

1.3.5 基于FRET的DNA傳感器標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將8 μL探針1和20 μL探針2在52 μL Tris-HCl(10 mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDTA,50 mmol/L NaCl,pH 7.4)中于37 ℃孵育1.25 h。然后將不同濃度(1.0、1.25、1.5、1.75、2.0 μmol/L)的ASFV靶DNA(20 μL)加入體系中于37 ℃孵育1.25 h,用熒光分光光度計測定熒光強度,在相同的條件下記錄所有熒光強度,每個實驗重復(fù)3次。

1.3.6 實際樣品分析

在豬肉、火腿香腸和豬肉餃子樣品中加入不同濃度的靶DNA(1.0、1.5、2.0 μmol/L)制備加標(biāo)樣本,按照病毒核酸提取試劑盒程序進行預(yù)處理。按照基于FRET的DNA傳感器的步驟進行檢測。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)使用Origin 8.0和Excel進行數(shù)據(jù)處理和繪制相關(guān)圖表,利用 SPSS 19.0 軟件通過單因素方差分析法對數(shù)據(jù)進行分析,每個樣品做3個獨立平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于FRET的DNA生物傳感器的研究策略

本研究開發(fā)了一種基于FRET的DNA傳感器,用于ASFV特異性基因序列檢測(靶DNA,30 nt,表1)原理如圖1所示。靶DNA缺失的情況下,ss-DNA-QDs(探針 1)將根據(jù)堿基互補配對原則與ss′-DNA-AuNPs(探針2)雜交,使供體QDs與受體AuNPs接近。在單鏈DNA構(gòu)象中,長度約為0.15 nm/nt,而在雙鏈DNA構(gòu)象中長度約為0.31 nm/nt[27]。當(dāng)探針2與探針1的15個堿基互補結(jié)合時,QDs和AuNPs之間只有15個堿基對和15個堿基,距離約為6.59 nm,小于FRET發(fā)生的最大距離10 nm[18],因此觸發(fā)了FRET效應(yīng),AuNPs 淬滅了QDs的熒光。然而,靶DNA存在的情況下,根據(jù)DNA鏈位移動力學(xué)[28-29],靶DNA與探針2競爭結(jié)合探針1,導(dǎo)致FRET被破壞,QDs的熒光發(fā)生恢復(fù)。

圖1 基于FRET的DNA生物傳感器檢測ASFV靶DNA的原理圖Fig.1 Schematic illustration of FRET DNA biosensor for ASFV target DNA detection

2.2 探針的表征

2.2.1 探針1的表征

探針1根據(jù)鏈霉親和素與生物素的特異性親和力進行合成。由圖2可知,QDs與ss-DNA結(jié)合后電泳速度更快,可能與ss-DNA帶有大量負電荷有關(guān)。在電泳力的作用下,帶更多負電荷的探針1向正極方向游動速度更快。因此QDs與ss-DNA成功結(jié)合。

1-Marker;2-QDs;3-ss-DNA;4-探針1圖2 瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis digital map

2.2.2 探針2的表征

通過檸檬酸還原法合成AuNPs，由圖3-a可知，AuNPs的粒徑約為13 nm。由圖3-b可知，AuNPs的zeta電位約為-26.5 mV?？疾炝艘恢軆?nèi)AuNPs的特征吸收峰波長和吸收峰波長處的吸光度來證明AuNPs的穩(wěn)定性，由圖3-c可知，吸收峰波長在一周內(nèi)基本沒有變化，較為穩(wěn)定。由圖3-d可知，吸收峰波長處的吸光度在一周內(nèi)基本保持在0.8 左右，比較穩(wěn)定。ss′-DNA通過巰基與金的化學(xué)作用與AuNPs結(jié)合，如圖3-e所示，探針2的紫外可見吸收光譜相對于AuNPs略向右移。如圖3-f所示，在裸的AuNPs中加入100 g/L NaCl后，由于鹽濃度的影響屏蔽了納米粒子間的靜電排斥作用[30]，探針2保持分散狀態(tài)。根據(jù)以上數(shù)據(jù)可知，成功合成了探針2。

2.3 基于FRET的DNA傳感器檢測ASFV的可行性

圖4顯示了所提策略的可行性。當(dāng)引入靶DNA時，靶DNA與探針2競爭結(jié)合探針1，導(dǎo)致FRET被破壞。因此，熒光強度增加。而加入隨機序列時，隨機序列不與探針1結(jié)合，F(xiàn)RET沒有被破壞，因此熒光沒有變化。表明該方案能夠特異性地檢測靶DNA，證實了所提策略的可行性。

2.4 基于FRET的DNA傳感器檢測性能的優(yōu)化

為了獲得最佳的檢測性能,以熒光強度的變化值作為評價指標(biāo),優(yōu)化序列長度、反應(yīng)緩沖液、探針1和探針2的用量和孵育時間。首先,當(dāng)ss′-DNA的長度為15個堿基時,熒光恢復(fù)程度最高,說明此時檢測性能最好。如圖5-a所示,當(dāng)長度>15堿基時,靶DNA不會競爭性地與探針1雜交,這可能是由于堿基之間增加的Watson-Crick結(jié)合力,這使得競爭變得困難[28]。圖5-b顯示了當(dāng)反應(yīng)緩沖液為Tris-HCl(10 mmol/L Tris,1 mmol/L EDTA,50 mmol/L NaCl,pH 7.4)時具有最大熒光恢復(fù)值ΔF(ΔF=F-F0,其中F和F0分別為靶DNA存在和缺失時的熒光強度)。因此,選擇Tris-HCl(10 mmol/L Tris,1 mmol/L EDTA,50 mmol/L NaCl,pH 7.4)作為反應(yīng)的最適緩沖液。

a-AuNPs的粒徑分布;b-AuNPs的zeta電位;c-一周內(nèi)AuNPs的吸收峰波長變化;d-一周內(nèi)AuNPs吸收峰波長處的吸光度;e-AuNPs與ss′-DNA-AuNPs的吸收峰波長;f-AuNPs與ss′-DNA-AuNPs的聚集分散狀態(tài)(添加100 g/L NaCl)圖3 探針2的表征Fig.3 Characterization of DNA-AuNPs

圖4 靶DNA(t-DNA)和隨機序列(R-DNA)加入探針1和探針2體系中的的熒光強度Fig.4 The fluorescence intensity of the system after adding target DNA (t-DNA) and random sequence (R-DNA)

圖5-c中,探針2的濃度為2 nmol/L時,ΔF是最大的。當(dāng)濃度<2 nmol/L,ΔF較小,這是因為探針1和探針2結(jié)合數(shù)量少,當(dāng)濃度>2 nmol/L時,AuNPs濃度升高導(dǎo)致熒光淬滅效率大大提高,但熒光強度恢復(fù)不明顯。如圖5-d所示,當(dāng)探針1的濃度為4 nmol/L,ΔF最大,濃度<4 nmol/L,QDs數(shù)量較少,體系整體熒光強度較低。當(dāng)濃度>4 nmol/L時,QDs濃度升高導(dǎo)致背景熒光較強,熒光恢復(fù)程度較低。最后對孵育時間進行優(yōu)化,將時間優(yōu)化分為2個階段,首先優(yōu)化探針識別階段的孵育時間,然后優(yōu)化加入靶DNA后的競爭時間。如圖5-e所示,由于探針1和探針2結(jié)合完全,1.25 h后熒光降低值達到最大后保持不變。圖5-f中,在1.25 h 后熒光恢復(fù)值不再增加,因為靶DNA與探針1達到了最大程度的結(jié)合。

a-ss′-DNA長度優(yōu)化圖;b-緩沖液優(yōu)化圖;c-探針2濃度優(yōu)化圖;d-探針1濃度優(yōu)化圖;e-識別時間優(yōu)化;f-競爭時間優(yōu)化圖5 靶DNA檢測的優(yōu)化Fig.5 Optimization for target DNA detection

2.5 基于FRET的DNA傳感器的標(biāo)準(zhǔn)曲線

優(yōu)化檢測條件后,利用基于FRET的DNA傳感器檢測一系列不同濃度的靶DNA(1.0、1.25、1.5、1.75、2.0 μmol/L),記錄熒光變化值。如圖6所示,在1～2 μmol/L的范圍內(nèi),ΔF與靶DNA的濃度之間有良好的線性關(guān)系,回歸方程為ΔF=180.00Ct-DNA+120.91,回歸系數(shù)為0.997 9。靶DNA的檢出限(LOD)為0.72 μmol/L,由LOD=3S/K計算得出,其中S為空白樣品的標(biāo)準(zhǔn)差 (n=10),K為校準(zhǔn)曲線的斜率。

圖6 基于FRET的DNA傳感器的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curves of ASFV target DNA measured by FRET DNA sensor

2.6 實際樣品分析

為了驗證基于FRET的DNA傳感器檢測食品中ASFV的適用性和準(zhǔn)確性,選擇具有代表性的豬肉及其制品,如新鮮豬肉、火腿腸和豬肉餃子等日常食品作為真實樣本,在這些常見的食品中實現(xiàn)對非洲豬瘟病毒的檢測,有利于追蹤病毒來源,更廣泛地監(jiān)測病毒,進一步減少經(jīng)濟損失。在豬肉、火腿腸和豬肉餃子中添加了不同濃度靶DNA(1.0、1.5、2.0 μmol/L),回收率為82.00%～108.00%,變異系數(shù)為0.02%～0.15% (表2),說明本文提出的基于FRET的DNA傳感器可用于實際食品樣品中ASFV的檢測。另外,非洲豬瘟病毒是一種較大的雙鏈DNA病毒,通常以穩(wěn)定的DNA雙鏈形式存在。在樣品預(yù)處理的過程中,可以通過熱處理使雙鏈DNA解旋,然后進行下一步實驗。

表2 利用基于FRET的DNA傳感器對真實食品樣品中ASFV靶DNA的回收率和準(zhǔn)確性研究Table 2 Recovery and accuracy of ASFV target DNA in real food samples based on FRET DNA sensor

3 結(jié)論

目前,非洲豬瘟傳播形式嚴(yán)峻,且尚無有效的預(yù)防疫苗。因此,對非洲豬瘟病毒的檢測及防控是非常有必要的。利用QDs和AuNPs構(gòu)建了一種基于FRET的DNA傳感器,用于檢測食品樣品中的ASFV特異性基因。通過觸發(fā)和破壞FRET快速檢測和定量ASFV靶DNA,可在1.25 h內(nèi)快速檢測ASFV靶DNA,檢出限為0.72 μmol/L。在復(fù)雜的食品樣品(豬肉、火腿腸和豬肉餃子)中驗證了基于FRET的DNA傳感器的適用性,在豬肉、火腿腸和豬肉餃子中的回收率為82.00%～108.00%,變異系數(shù)為0.02%～0.15%。本研究提出一種簡單、快速的檢測食品中ASFV基因片段的方法,可以有效地用于食品中非洲豬瘟病毒的檢測以及監(jiān)控。在未來的研究當(dāng)中,可以通過優(yōu)化條件來提高靈敏度。此外,此策略可以根據(jù)不同的靶標(biāo)物設(shè)計不同的探針,可擴展到其他DNA、病毒或蛋白質(zhì)的傳感應(yīng)用,為食品安全檢測方向的進一步研究提供科學(xué)依據(jù)。