黃力,劉功良*,費永濤,高蘇娟,白衛(wèi)東*,劉銳

1(仲愷農業(yè)工程學院 輕工食品學院,廣東 廣州,510225)2(仲愷農業(yè)工程學院 現代農業(yè)工程創(chuàng)新研究院,廣東 廣州,510225)

隨著人類科技的不斷進步,對太空的探索也日益頻繁。自1960年蘇聯(lián) Korabl-Sputnik 號和美國 Discover 號衛(wèi)星發(fā)射以來,在外太空地球軌道上已進行多次微生物試驗[1]。微生物是研究環(huán)境條件變化響應的理想生命形式,因為它們易于處理,在有限的環(huán)境條件變化(如溫度、壓力等)內具有穩(wěn)定性和生命周期的快速性。太空中復雜的環(huán)境條件可為突變育種提供優(yōu)質的突變源,這可以提高微生物突變率并產生許多不同的表型。故可利用太空獨特的環(huán)境,對微生物進行航天誘變育種,以期獲得性狀優(yōu)良的菌株并應用于生產實際中。但目前的研究缺乏對微生物航天誘變機制及效應的系統(tǒng)性認識。

發(fā)酵食品微生物是發(fā)酵食品中最重要的組成部分,對發(fā)酵食品的風味和質量至關重要。微生物航天育種能為發(fā)酵食品微生物的選育提供新的思路與方法,但目前相關育種研究甚少。

本文綜述了國內外微生物太空誘變育種探索過程中,太空環(huán)境對微生物的誘變機制、對微生物生理生化特征的誘變效應,以及航天育種在發(fā)酵食品微生物中的應用及前景,為微生物航天育種與發(fā)酵食品在產學研的結合提供借鑒。

1 太空環(huán)境對微生物的誘變機制

1.1 太空環(huán)境的誘變源

太空環(huán)境具有高真空、溫度極端、微重力等特點,充斥著紫外線輻射、電離輻射、交變磁場、流星體、空間碎片、電離層、離子體等影響生命體的復雜條件,從而誘導微生物表現出各種形態(tài)和生理變化,以適應太空環(huán)境的變化[1]。

微重力是影響微生物在太空環(huán)境中生存的一個重要因素,其是一種重力水平幾乎為零但沒有被中和的狀態(tài)。在地球軌道上,微重力可能介于10-3～10-6g,具體的值取決于航天器的位置和振動頻率。微重力能改變作用在細胞及其環(huán)境上的物理力,例如對流質量與熱傳遞的損失、機械剪切力的降低以及液體在空氣或固體界面的行為改變,從而改變微生物與其周圍環(huán)境之間氣體、營養(yǎng)物、代謝副產物、代謝廢物和信號分子的交換速率[2]。

太空環(huán)境還使微生物暴露于多種類型的輻射中,包括光子以及質量、電荷和能量不同的粒子。輻射場主要由兩類組成：太陽宇宙輻射和銀河宇宙輻射。在地球上,每個人每年都受到大約2 mSv 的背景輻射,在國際空間站(International Space Station,ISS)上,輻射劑量大約是地球上的80～160倍[3]。各類射線可傳遞足量的能量(線性能量傳遞)使中性原子或分子電離,或者至少逐出1個電子。輻射可對DNA造成可修復或不可修復的損害,這取決于輻射的類型和能量。這種損傷有可能通過突變來修改遺傳密碼,改變DNA的功能并將突變傳遞給下一代。并且,輻射損傷亦與自由基物質的產生有關,這些物質可直接或間接地靶向生物大分子,影響其完整性和功能,從而嚴重損害微生物的生存力[4]。

1.2 太空環(huán)境誘變微生物的分子機制

1.2.1 影響微生物 DNA的損傷與修復

太空中存在的大量電離輻射會損壞細胞內 DNA。質子與 DNA 分子的直接相互作用,會損傷 DNA 的堿基,并且通過與核糖部分的相互作用導致 DNA 鏈的斷裂[5]。另外,微生物被暴露于外太空環(huán)境的紫外線時,DNA 酶與 RNA 酶的活性會被降低,當受到無法抵御的紫外線劑量時,則會喪失產生 DNA 酶的能力[6]。

暴露在太空環(huán)境中,微生物DNA 受到損傷的同時,相應地 DNA 修復作用也會被激活[7]。如將枯草芽孢桿菌孢子暴露在ISS外559 d,檢測到與 DNA 損傷(SOS 反應,SPβ 噬菌體誘導),蛋白質損傷(CtsR/Clp 系統(tǒng))有關的調節(jié)子的轉錄水平顯著升高。recA基因產物是枯草芽孢桿菌中經典SOS調節(jié)中的主要調節(jié)子,該試驗recA基因的表達上升了7.5倍[8]。

但在太空中 DNA的修復作用與地面相比會出現差異。GUO 等[9]將金黃色葡萄球菌搭載于神舟10號中,發(fā)現與在地面上培養(yǎng)的菌株相比,經歷過太空飛行的菌株表現出不同的突變位點定位模式。在太空菌株中,基因間隔區(qū)突變的數量遠高于基因內突變的數量,而在地面菌株中則相反?；騼鹊耐蛔兾稽c位于蛋白質編碼區(qū)內,預測功能包括編碼轉座酶、DNA 甲基化酶和 Mur 連接酶。這表明這些突變位點可能負責識別和修復DNA復制錯配位點,并且修復更多地瞄準與生存相關的基本功能基因突變,而不是發(fā)生在基因間區(qū)域的突變。

綜上,微生物在太空中,DNA受到損傷,并表現出與地面培養(yǎng)菌株不同的 DNA 修復機制,這可能是太空環(huán)境誘變微生物的重要分子機制[7-10]。

1.2.2 影響微生物代謝、抗氧化等基因的表達

微生物能夠調節(jié)自身新陳代謝,從而在環(huán)境變化期間提高生存率,突變菌株在碳水化合物、蛋白質、脂類這些能源的利用上會出現一定的調節(jié)[11]。例如,沃氏葡萄球菌在太空上飛行64 d后,磷酸轉移酶系統(tǒng)的基因表達顯著上調,該系統(tǒng)調節(jié)糖的代謝,包括葡萄糖、甘露糖、果糖和纖維二糖[12]。腸炎沙門氏菌經太空飛行后,磷酸轉移酶系統(tǒng)的基因表達也出現差異。其中,1個上調基因 (fucA) 和9個下調基因 (manX、manY、manZ、gutD、srlA、srlB、srlE、rfbK和cpsB2) 與“果糖和甘露糖代謝”途徑相關,2個上調基因 (STY2572 和treB) 和7個下調基因 (manX、manY、manZ、srlA、srlB、srlE、ptsG) 與“磷酸轉移酶系統(tǒng)”途徑相關[13]。另外,粘質沙雷氏菌經歷398 h太空飛行后,蛋白質組學數據顯示,與代謝功能相關的蛋白質水平發(fā)生變化,如糖酵解/糖異生、丙酮酸、精氨酸和脯氨酸代謝以及纈氨酸,亮氨酸和異亮氨酸的降解[14]。大腸桿菌經17 d太空飛行后,差異表達蛋白涉及磷脂生物合成、磷脂代謝、有機磷酸酯代謝、脂質生物合成、對化學刺激的響應、細胞脂質代謝和脂質代謝這些生物過程[15]。

據報道,真菌會產生黑色素以增強對電離輻射的抵抗力。從ISS表面分離的3種霉菌：黑曲霉 JSC-093350089[16]和煙曲霉 ISSFT-021、IF1SW-F4[17],發(fā)現它們不僅在與代謝相關的蛋白質表達上與地面試驗菌株出現差異,而且參與 DHN-黑色素合成的關鍵酶豐度上升,分別是 AlbA 和 Arp1。

在太空飛行過程中,電離輻射可誘導微生物細胞內水解產生活性氧,從而可能對 DNA、蛋白質、脂質和其他細胞成分產生氧化損傷。CRABBé 等[18]發(fā)現白色念珠球菌 SC5314經太空飛行后,與抗氧化性有關的基因表達得到上調,包括氧化應激反應轉錄調節(jié)因子cap1基因、編碼谷胱甘肽過氧化物酶的gpx1、gpx2基因和編碼超氧化物歧化酶的sod3基因。另外,從ISS表面分離出的黑曲霉和煙曲霉中也發(fā)現了與抗氧化應激相關的蛋白豐度增加[16-17]。

微生物在太空中受到誘變或者是對于環(huán)境的應激反應,會對基因的表達作出調整,這可能是太空環(huán)境誘變微生物的另一個重要分子機制[11]。在返回地球后,這種基因的表達差異我們可以通過轉錄組學和蛋白組學分析獲知。

2 太空環(huán)境對微生物生理生化特征的誘變效應

表1是收集的近年發(fā)表的關于微生物太空試驗報道,并將其試驗菌種、航天器發(fā)射年份、搭載飛船或發(fā)射任務名稱,菌株的太空飛行試驗方式,以及誘變菌株的生理生化變化結果進行歸納總結。微生物的太空試驗,多為航天器搭載菌株經太空飛行后,返回地面對菌株進行分離,然后再測試其性狀變化[7,12,14-15,19-21]。有少部分試驗為在太空飛行期間對微生物的生長狀態(tài)進行觀察[22]。

表1 太空環(huán)境對微生物生理生化特征的誘變Table 1 Mutagenesis of physiological and biochemical characteristics of microorganisms induced by space environment

2.1 太空環(huán)境對微生物生長動力學的誘變

經歷太空飛行后,微生物的生長速率呈不定向變化[7,12,14-15,19]。例如,2016年神舟11號航天器將1株腸炎沙門氏菌帶入太空,返回地球后分離菌株,并同時在類似溫度條件下進行了地面試驗作為對照,發(fā)現飛行菌株加速生長[13]。2011年神舟8號攜帶粘質沙雷氏菌在太空中飛行398 h,返回地面后篩選出2個突變體(LCT-SM166和LCT-SM262),與地面模擬菌株(LCT-SM213)對比,生長曲線沒有變化[14]。神舟11號亦搭載有鮑曼不動桿菌,經歷太空飛行返回地面后分離的菌株生長速率顯著下降[19]。另外,對生長的促進作用亦可表現為細胞密度的上升[20]。這種對生長不定向的促進或抑制作用,有助于微生物航天育種篩選出高生長速率的優(yōu)良菌株

2.2 太空環(huán)境對微生物細胞膜的誘變

微生物的生物膜形成能力是一種重要的生理特性,它與微生物的抗生素抗性、宿主免疫反應還有對壓力環(huán)境的適應和耐受能力息息相關[23]。也有研究認為生物膜形成能力的變化可能與生長速率的變化有關[24]。太空微生物試驗中關于細胞膜的研究并不多,從收集到的文章中能看出,經歷長時間的太空飛行后(12/14/15/64 d),菌株返回地面后能發(fā)現其生物膜的形成能力增強[7,12,20],但經歷短時間太空飛行(1 d)的菌株返回地面后其生物膜的形成能力會減弱[19],此推論需要未來有更多的文獻進行支撐。另外,經歷太空飛行返回地面的銅綠假單胞菌的細胞膜,首次出現了一種由覆蓋有冠層的圓柱組成的結構,在地面上培養(yǎng)時生物膜僅顯示出平坦的結構[20]。微生物能夠在太空航行后出現在地球上無法獲得的性狀,這對微生物航天育種有重要的意義。

2.3 太空環(huán)境對微生物耐藥性的誘變

若將航天育種的微生物作為益生菌使用在發(fā)酵食品上,有必要對其抗生素抗性基因以及它的轉移性進行安全性評價,這些抗性基因會通過水平轉移的方式轉入到腸道菌群的病原菌中,一旦病原菌具有耐藥性并引發(fā)疾病時,則無法利用抗生素進行治療[25]。目前并無益生菌經太空誘變后進行的耐藥性方面的報道,耐藥性的報道均聚焦于經太空誘變后的致病菌[26]。經太空飛行后,返回地面進行試驗的微生物中,鮑曼不動桿菌、沃氏葡萄桿菌、粘質沙雷氏菌和大腸桿菌對所測試的抗生素并沒有產生變化的耐藥性[12,14-15,22]。MORRISON 等[21]將枯草芽孢桿菌送往國際空間站,得到飛行 (FL) 菌株與地面培養(yǎng) (GC) 菌株。使用 Omnilog 表型微陣列 (PM) 系統(tǒng)將 FL 和 GC 樣品對72種抗生素和生長抑制化合物的敏感性進行了比較。通過 PM 篩查僅鑒定出9種化合物在 FL 和 GC 樣品中存在差異。其中,FL 菌株對3種抗生素比 GC 菌株更具抗性,分別為依諾沙星,6-巰基嘌呤和三氟拉嗪。但只有對依諾沙星的耐藥性出現 >50倍的差異,對其余8種抗生素耐藥性差異非常小(50%以下)。總體上,微生物經太空飛行返回地面后,對抗生素的耐藥性無大規(guī)模的變化,但仍有可能出現變化。因此若想將航天育種的菌株用于發(fā)酵食品,需要對微生物的耐藥性進行檢測。

3 航天育種在發(fā)酵食品微生物的應用及前景

3.1 發(fā)酵食品微生物的航天育種

表2收集了我國航天育種報道中,關于發(fā)酵食品微生物的報道,并將其搭載菌種/菌群,航天器發(fā)射年份、搭載的飛船/任務名稱,以及航天誘變效果進行歸納總結。

表2 發(fā)酵食品微生物的航天育種效果Table 2 Effects of space-flight breeding of fermented microorganisms

在收集到的文獻中,發(fā)酵食品微生物的航天育種方法均為搭載發(fā)酵微生物進行太空飛行,返回地面后通過傳統(tǒng)平板篩菌技術初篩出具有潛力的誘變菌株,然后針對對應的發(fā)酵食品特性,對誘變菌株進行一系列的生理生化指標測定,從中篩選具有穩(wěn)定優(yōu)良性狀的菌株。例如,劉雪等[31]從航天誘變得到的芝麻香細菌曲中初篩出34株生長快、菌落大的菌株,然后分別對它們的中性和堿性蛋白酶活力進行測定,最終篩選出16株細菌菌株,蛋白酶活力均有提高,最高可提升31.7倍。針對應用于不同發(fā)酵食品的微生物,篩選的性能指標也不相同。例如,應用于白酒釀造中的微生物,會以菌株的產酸能力、產酯能力、糖化酶活力、蛋白酶活力等為篩選指標,旨在提高白酒中的有機酸、酯類物質等功能物質以及對原料的利用率[28,29,31]。針對發(fā)酵乳產品的微生物,會以胞外多糖、產酸能力、耐酸能力、半乳糖苷酶活力等為篩選指標,旨在提高產品的黏度、風味以及益生功能[32-34]。

另外,表3收集了航天優(yōu)良菌株應用于實際生產之中的相關報道,并將航天菌株/菌群,應用于的發(fā)酵食品種類,以及應用效果進行歸納總結。

表3 航天育種后的發(fā)酵微生物在發(fā)酵食品中的應用效果Table 3 Application effects of fermented microorganisms after space-flight breeding in fermented food

目前在發(fā)酵食品領域上,航天微生物已在白酒、醬油、食用醋以及啤酒上的具有實際應用。例如,利用誘變后的優(yōu)良己酸菌(己酸產量提高45%),與普通窖泥按一定比例混合制成的航天窖泥,用于發(fā)酵濃香型白酒。所得白酒中,各種有機酸(己酸、乙酸、丁酸等)含量和酯類化合物(乙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯等)含量均有提高。其中,總酸含量和總酯含量各提升了300和1 000 mg/L,達到1 371和6 205 mg/L,提升最多的為乙酸乙酯,提高了500 mg/L[28]。利用經航天誘變的根酶、黑曲霉和毛酶,與原來使用的米曲霉混合制曲,制得生抽色、香、味、體俱佳,達到高品質生抽的要求,并且產量提高[36]。3株航天啤酒酵母HT-1、HT-2、HT-3釀造的啤酒,高級醇和酯類物質的含量均高于市售啤酒,雙乙酰的含量控制在0.08 mg/L 左右。經專家品審,航天酵母釀造的啤酒具有典型的啤酒風味與特點,并且HT-2能給啤酒帶來明顯的香蕉風味[30]。

但目前航天誘變微生物在發(fā)酵食品上的應用甚少,并且許多誘變菌株成果也僅停留在實驗室試驗階段,還沒有將其應用于實際生產中[32-34]。例如,嗜熱鏈球菌G2航天誘變菌株能為發(fā)酵乳帶來更高的酸度、黏度和胞外多糖含量,從而提高產品的品質,但僅停留于實驗室階段的試驗,并未進一步應用到發(fā)酵乳產品中[33]。

目前,國內外對于微生物航天誘變育種的研究也主要集中于醫(yī)學領域[3,26],在發(fā)酵食品微生物領域涉及不多。除我國外,其他發(fā)展中國家尚不具備對微生物航天誘變的基礎和條件。開展發(fā)酵微生物航天育種的相關研究,能夠填補此方面的空白。

3.2 航天育種在發(fā)酵食品的應用前景

航天育種能夠提高發(fā)酵食品微生物的各項性能,對發(fā)酵食品具有優(yōu)良的生產應用前景。但目前對于食品發(fā)酵微生物航天育種的研究甚少,在已報道的文獻中,國外暫時還沒有這方面的研究,國內至今也僅有本文收集的報道,發(fā)酵食品微生物的航天育種研究仍處于起步階段。微生物航天誘變技術目前多用于醫(yī)學研究中,在食品發(fā)酵和釀造中的應用較少。研究主要集中于誘變菌株的DNA、基因表達、生理生化特性的變化,選取的菌株亦多為醫(yī)用菌株。

釀造微生物是發(fā)酵食品中最重要的組成部分,對發(fā)酵食品的風味、品質和安全至關重要。廣式傳統(tǒng)發(fā)酵食品包括廣式發(fā)酵肉制品、廣式調味品(醬油、腐乳、豆豉、豆醬等)、廣東米酒、廣東客家黃酒、嶺南特色果酒、廣式米糕等。品種繁多,量大面廣,深蘊文化傳承。但部分廣式傳統(tǒng)發(fā)酵食品受制于自身品質問題,未能在全國范圍內推廣。例如,廣東黃酒中的殘?zhí)呛窟^高,會導致口感過于甜膩、并且易產生酸敗,但釀造過程中的高糖環(huán)境致使酵母處于低活性狀態(tài),無法充分利用殘?zhí)荹38]。廣東米香型白酒的釀造工藝簡單、發(fā)酵周期短、采用半固態(tài)發(fā)酵的方式導致其酯類物質與有機酸物質含量較少、香氣不足,并且雜醇油含量普遍較高[39]。廣式豆制品如腐乳、豆豉、豆醬在制作過程中必須經歷浸豆過程,該過程中脂肪氧化酶被活化,催化油脂產生氫過氧化物,再降解生成小分子醇、醛、酮、酸和胺等豆腥味成分,至其市場接受度不高[40]。

微生物航天育種技術可為廣式傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物的篩選及應用開辟新的途徑,以期用太空獨特的環(huán)境為廣式傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物帶來性能的優(yōu)化。例如,提高酒曲中微生物的產酸、產酯、耐高糖能力,使發(fā)酵更加充分,酒風味及功能成分得到提高,降低雜醇油的含量。培養(yǎng)能夠利用豆腥味成分的發(fā)酵菌株,降低豆制品中不愉悅的豆腥味。微生物航天育種技術可解決廣式傳統(tǒng)發(fā)酵食品在發(fā)酵過程中的存在的問題,提升其品質與價值,該技術具有廣闊的應用前景。

4 討論與展望

在太空中,微生物會出現一系列的應激反應。多年來,國內外許多科研組對微生物進行了多項太空試驗。證實了太空環(huán)境會影響微生物的生長情況、生物膜形成能力、對抗生素的耐藥性、毒性、基因的表達、DNA 的損傷與修復等。此外,太空中的微重力和太空輻射等環(huán)境條件可為微生物誘變育種提供優(yōu)秀的誘變源,篩選得到的優(yōu)良菌株可應用于實際生產中,也可為日后在太空中進行的微生物試驗提供合適的菌株。

微生物航天誘變育種技術目前多用于醫(yī)學研究中[3,26],如表1中提到的銅綠假單胞菌和大腸桿菌是條件性致病菌,在太空中宇航員會有幾率被感染[15,20],腸炎沙門氏菌會引起人和動物的腸胃和系統(tǒng)性疾病[13]。而其在食品發(fā)酵和釀造中的研究甚少。廣式傳統(tǒng)發(fā)酵食品品種繁多,量大面廣,深蘊文化傳承,而釀造微生物對發(fā)酵食品的風味和質量至關重要,微生物航天育種技術可為廣式傳統(tǒng)發(fā)酵食品釀造微生物的篩選及應用開辟新的途徑,具有廣闊的應用前景。