黃力,劉功良*,費永濤,高蘇娟,白衛(wèi)東*,劉銳

1(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 輕工食品學(xué)院,廣東 廣州,510225)2(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)工程創(chuàng)新研究院,廣東 廣州,510225)

隨著人類科技的不斷進步,對太空的探索也日益頻繁。自1960年蘇聯(lián) Korabl-Sputnik 號和美國 Discover 號衛(wèi)星發(fā)射以來,在外太空地球軌道上已進行多次微生物試驗[1]。微生物是研究環(huán)境條件變化響應(yīng)的理想生命形式,因為它們易于處理,在有限的環(huán)境條件變化(如溫度、壓力等)內(nèi)具有穩(wěn)定性和生命周期的快速性。太空中復(fù)雜的環(huán)境條件可為突變育種提供優(yōu)質(zhì)的突變源,這可以提高微生物突變率并產(chǎn)生許多不同的表型。故可利用太空獨特的環(huán)境,對微生物進行航天誘變育種,以期獲得性狀優(yōu)良的菌株并應(yīng)用于生產(chǎn)實際中。但目前的研究缺乏對微生物航天誘變機制及效應(yīng)的系統(tǒng)性認識。

發(fā)酵食品微生物是發(fā)酵食品中最重要的組成部分,對發(fā)酵食品的風(fēng)味和質(zhì)量至關(guān)重要。微生物航天育種能為發(fā)酵食品微生物的選育提供新的思路與方法,但目前相關(guān)育種研究甚少。

本文綜述了國內(nèi)外微生物太空誘變育種探索過程中,太空環(huán)境對微生物的誘變機制、對微生物生理生化特征的誘變效應(yīng),以及航天育種在發(fā)酵食品微生物中的應(yīng)用及前景,為微生物航天育種與發(fā)酵食品在產(chǎn)學(xué)研的結(jié)合提供借鑒。

1 太空環(huán)境對微生物的誘變機制

1.1 太空環(huán)境的誘變源

太空環(huán)境具有高真空、溫度極端、微重力等特點,充斥著紫外線輻射、電離輻射、交變磁場、流星體、空間碎片、電離層、離子體等影響生命體的復(fù)雜條件,從而誘導(dǎo)微生物表現(xiàn)出各種形態(tài)和生理變化,以適應(yīng)太空環(huán)境的變化[1]。

微重力是影響微生物在太空環(huán)境中生存的一個重要因素,其是一種重力水平幾乎為零但沒有被中和的狀態(tài)。在地球軌道上,微重力可能介于10-3～10-6g,具體的值取決于航天器的位置和振動頻率。微重力能改變作用在細胞及其環(huán)境上的物理力,例如對流質(zhì)量與熱傳遞的損失、機械剪切力的降低以及液體在空氣或固體界面的行為改變,從而改變微生物與其周圍環(huán)境之間氣體、營養(yǎng)物、代謝副產(chǎn)物、代謝廢物和信號分子的交換速率[2]。

太空環(huán)境還使微生物暴露于多種類型的輻射中,包括光子以及質(zhì)量、電荷和能量不同的粒子。輻射場主要由兩類組成：太陽宇宙輻射和銀河宇宙輻射。在地球上,每個人每年都受到大約2 mSv 的背景輻射,在國際空間站(International Space Station,ISS)上,輻射劑量大約是地球上的80～160倍[3]。各類射線可傳遞足量的能量(線性能量傳遞)使中性原子或分子電離,或者至少逐出1個電子。輻射可對DNA造成可修復(fù)或不可修復(fù)的損害,這取決于輻射的類型和能量。這種損傷有可能通過突變來修改遺傳密碼,改變DNA的功能并將突變傳遞給下一代。并且,輻射損傷亦與自由基物質(zhì)的產(chǎn)生有關(guān),這些物質(zhì)可直接或間接地靶向生物大分子,影響其完整性和功能,從而嚴重損害微生物的生存力[4]。

1.2 太空環(huán)境誘變微生物的分子機制

1.2.1 影響微生物 DNA的損傷與修復(fù)

太空中存在的大量電離輻射會損壞細胞內(nèi) DNA。質(zhì)子與 DNA 分子的直接相互作用,會損傷 DNA 的堿基,并且通過與核糖部分的相互作用導(dǎo)致 DNA 鏈的斷裂[5]。另外,微生物被暴露于外太空環(huán)境的紫外線時,DNA 酶與 RNA 酶的活性會被降低,當(dāng)受到無法抵御的紫外線劑量時,則會喪失產(chǎn)生 DNA 酶的能力[6]。

暴露在太空環(huán)境中,微生物DNA 受到損傷的同時,相應(yīng)地 DNA 修復(fù)作用也會被激活[7]。如將枯草芽孢桿菌孢子暴露在ISS外559 d,檢測到與 DNA 損傷(SOS 反應(yīng),SPβ 噬菌體誘導(dǎo)),蛋白質(zhì)損傷(CtsR/Clp 系統(tǒng))有關(guān)的調(diào)節(jié)子的轉(zhuǎn)錄水平顯著升高。recA基因產(chǎn)物是枯草芽孢桿菌中經(jīng)典SOS調(diào)節(jié)中的主要調(diào)節(jié)子,該試驗recA基因的表達上升了7.5倍[8]。

但在太空中 DNA的修復(fù)作用與地面相比會出現(xiàn)差異。GUO 等[9]將金黃色葡萄球菌搭載于神舟10號中,發(fā)現(xiàn)與在地面上培養(yǎng)的菌株相比,經(jīng)歷過太空飛行的菌株表現(xiàn)出不同的突變位點定位模式。在太空菌株中,基因間隔區(qū)突變的數(shù)量遠高于基因內(nèi)突變的數(shù)量,而在地面菌株中則相反?；騼?nèi)的突變位點位于蛋白質(zhì)編碼區(qū)內(nèi),預(yù)測功能包括編碼轉(zhuǎn)座酶、DNA 甲基化酶和 Mur 連接酶。這表明這些突變位點可能負責(zé)識別和修復(fù)DNA復(fù)制錯配位點,并且修復(fù)更多地瞄準(zhǔn)與生存相關(guān)的基本功能基因突變,而不是發(fā)生在基因間區(qū)域的突變。

綜上,微生物在太空中,DNA受到損傷,并表現(xiàn)出與地面培養(yǎng)菌株不同的 DNA 修復(fù)機制,這可能是太空環(huán)境誘變微生物的重要分子機制[7-10]。

1.2.2 影響微生物代謝、抗氧化等基因的表達

微生物能夠調(diào)節(jié)自身新陳代謝,從而在環(huán)境變化期間提高生存率,突變菌株在碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂類這些能源的利用上會出現(xiàn)一定的調(diào)節(jié)[11]。例如,沃氏葡萄球菌在太空上飛行64 d后,磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的基因表達顯著上調(diào),該系統(tǒng)調(diào)節(jié)糖的代謝,包括葡萄糖、甘露糖、果糖和纖維二糖[12]。腸炎沙門氏菌經(jīng)太空飛行后,磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)的基因表達也出現(xiàn)差異。其中,1個上調(diào)基因 (fucA) 和9個下調(diào)基因 (manX、manY、manZ、gutD、srlA、srlB、srlE、rfbK和cpsB2) 與“果糖和甘露糖代謝”途徑相關(guān),2個上調(diào)基因 (STY2572 和treB) 和7個下調(diào)基因 (manX、manY、manZ、srlA、srlB、srlE、ptsG) 與“磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)”途徑相關(guān)[13]。另外,粘質(zhì)沙雷氏菌經(jīng)歷398 h太空飛行后,蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)顯示,與代謝功能相關(guān)的蛋白質(zhì)水平發(fā)生變化,如糖酵解/糖異生、丙酮酸、精氨酸和脯氨酸代謝以及纈氨酸,亮氨酸和異亮氨酸的降解[14]。大腸桿菌經(jīng)17 d太空飛行后,差異表達蛋白涉及磷脂生物合成、磷脂代謝、有機磷酸酯代謝、脂質(zhì)生物合成、對化學(xué)刺激的響應(yīng)、細胞脂質(zhì)代謝和脂質(zhì)代謝這些生物過程[15]。

據(jù)報道,真菌會產(chǎn)生黑色素以增強對電離輻射的抵抗力。從ISS表面分離的3種霉菌：黑曲霉 JSC-093350089[16]和煙曲霉 ISSFT-021、IF1SW-F4[17],發(fā)現(xiàn)它們不僅在與代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)表達上與地面試驗菌株出現(xiàn)差異,而且參與 DHN-黑色素合成的關(guān)鍵酶豐度上升,分別是 AlbA 和 Arp1。

在太空飛行過程中,電離輻射可誘導(dǎo)微生物細胞內(nèi)水解產(chǎn)生活性氧,從而可能對 DNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和其他細胞成分產(chǎn)生氧化損傷。CRABBé 等[18]發(fā)現(xiàn)白色念珠球菌 SC5314經(jīng)太空飛行后,與抗氧化性有關(guān)的基因表達得到上調(diào),包括氧化應(yīng)激反應(yīng)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子cap1基因、編碼谷胱甘肽過氧化物酶的gpx1、gpx2基因和編碼超氧化物歧化酶的sod3基因。另外,從ISS表面分離出的黑曲霉和煙曲霉中也發(fā)現(xiàn)了與抗氧化應(yīng)激相關(guān)的蛋白豐度增加[16-17]。

微生物在太空中受到誘變或者是對于環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng),會對基因的表達作出調(diào)整,這可能是太空環(huán)境誘變微生物的另一個重要分子機制[11]。在返回地球后,這種基因的表達差異我們可以通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)分析獲知。

2 太空環(huán)境對微生物生理生化特征的誘變效應(yīng)

表1是收集的近年發(fā)表的關(guān)于微生物太空試驗報道,并將其試驗菌種、航天器發(fā)射年份、搭載飛船或發(fā)射任務(wù)名稱,菌株的太空飛行試驗方式,以及誘變菌株的生理生化變化結(jié)果進行歸納總結(jié)。微生物的太空試驗,多為航天器搭載菌株經(jīng)太空飛行后,返回地面對菌株進行分離,然后再測試其性狀變化[7,12,14-15,19-21]。有少部分試驗為在太空飛行期間對微生物的生長狀態(tài)進行觀察[22]。

表1 太空環(huán)境對微生物生理生化特征的誘變Table 1 Mutagenesis of physiological and biochemical characteristics of microorganisms induced by space environment

2.1 太空環(huán)境對微生物生長動力學(xué)的誘變

經(jīng)歷太空飛行后,微生物的生長速率呈不定向變化[7,12,14-15,19]。例如,2016年神舟11號航天器將1株腸炎沙門氏菌帶入太空,返回地球后分離菌株,并同時在類似溫度條件下進行了地面試驗作為對照,發(fā)現(xiàn)飛行菌株加速生長[13]。2011年神舟8號攜帶粘質(zhì)沙雷氏菌在太空中飛行398 h,返回地面后篩選出2個突變體(LCT-SM166和LCT-SM262),與地面模擬菌株(LCT-SM213)對比,生長曲線沒有變化[14]。神舟11號亦搭載有鮑曼不動桿菌,經(jīng)歷太空飛行返回地面后分離的菌株生長速率顯著下降[19]。另外,對生長的促進作用亦可表現(xiàn)為細胞密度的上升[20]。這種對生長不定向的促進或抑制作用,有助于微生物航天育種篩選出高生長速率的優(yōu)良菌株

2.2 太空環(huán)境對微生物細胞膜的誘變

微生物的生物膜形成能力是一種重要的生理特性,它與微生物的抗生素抗性、宿主免疫反應(yīng)還有對壓力環(huán)境的適應(yīng)和耐受能力息息相關(guān)[23]。也有研究認為生物膜形成能力的變化可能與生長速率的變化有關(guān)[24]。太空微生物試驗中關(guān)于細胞膜的研究并不多,從收集到的文章中能看出,經(jīng)歷長時間的太空飛行后(12/14/15/64 d),菌株返回地面后能發(fā)現(xiàn)其生物膜的形成能力增強[7,12,20],但經(jīng)歷短時間太空飛行(1 d)的菌株返回地面后其生物膜的形成能力會減弱[19],此推論需要未來有更多的文獻進行支撐。另外,經(jīng)歷太空飛行返回地面的銅綠假單胞菌的細胞膜,首次出現(xiàn)了一種由覆蓋有冠層的圓柱組成的結(jié)構(gòu),在地面上培養(yǎng)時生物膜僅顯示出平坦的結(jié)構(gòu)[20]。微生物能夠在太空航行后出現(xiàn)在地球上無法獲得的性狀,這對微生物航天育種有重要的意義。

2.3 太空環(huán)境對微生物耐藥性的誘變

若將航天育種的微生物作為益生菌使用在發(fā)酵食品上,有必要對其抗生素抗性基因以及它的轉(zhuǎn)移性進行安全性評價,這些抗性基因會通過水平轉(zhuǎn)移的方式轉(zhuǎn)入到腸道菌群的病原菌中,一旦病原菌具有耐藥性并引發(fā)疾病時,則無法利用抗生素進行治療[25]。目前并無益生菌經(jīng)太空誘變后進行的耐藥性方面的報道,耐藥性的報道均聚焦于經(jīng)太空誘變后的致病菌[26]。經(jīng)太空飛行后,返回地面進行試驗的微生物中,鮑曼不動桿菌、沃氏葡萄桿菌、粘質(zhì)沙雷氏菌和大腸桿菌對所測試的抗生素并沒有產(chǎn)生變化的耐藥性[12,14-15,22]。MORRISON 等[21]將枯草芽孢桿菌送往國際空間站,得到飛行 (FL) 菌株與地面培養(yǎng) (GC) 菌株。使用 Omnilog 表型微陣列 (PM) 系統(tǒng)將 FL 和 GC 樣品對72種抗生素和生長抑制化合物的敏感性進行了比較。通過 PM 篩查僅鑒定出9種化合物在 FL 和 GC 樣品中存在差異。其中,FL 菌株對3種抗生素比 GC 菌株更具抗性,分別為依諾沙星,6-巰基嘌呤和三氟拉嗪。但只有對依諾沙星的耐藥性出現(xiàn) >50倍的差異,對其余8種抗生素耐藥性差異非常小(50%以下)?？傮w上,微生物經(jīng)太空飛行返回地面后,對抗生素的耐藥性無大規(guī)模的變化,但仍有可能出現(xiàn)變化。因此若想將航天育種的菌株用于發(fā)酵食品,需要對微生物的耐藥性進行檢測。

3 航天育種在發(fā)酵食品微生物的應(yīng)用及前景

3.1 發(fā)酵食品微生物的航天育種

表2收集了我國航天育種報道中,關(guān)于發(fā)酵食品微生物的報道,并將其搭載菌種/菌群,航天器發(fā)射年份、搭載的飛船/任務(wù)名稱,以及航天誘變效果進行歸納總結(jié)。

表2 發(fā)酵食品微生物的航天育種效果Table 2 Effects of space-flight breeding of fermented microorganisms

在收集到的文獻中,發(fā)酵食品微生物的航天育種方法均為搭載發(fā)酵微生物進行太空飛行,返回地面后通過傳統(tǒng)平板篩菌技術(shù)初篩出具有潛力的誘變菌株,然后針對對應(yīng)的發(fā)酵食品特性,對誘變菌株進行一系列的生理生化指標(biāo)測定,從中篩選具有穩(wěn)定優(yōu)良性狀的菌株。例如,劉雪等[31]從航天誘變得到的芝麻香細菌曲中初篩出34株生長快、菌落大的菌株,然后分別對它們的中性和堿性蛋白酶活力進行測定,最終篩選出16株細菌菌株,蛋白酶活力均有提高,最高可提升31.7倍。針對應(yīng)用于不同發(fā)酵食品的微生物,篩選的性能指標(biāo)也不相同。例如,應(yīng)用于白酒釀造中的微生物,會以菌株的產(chǎn)酸能力、產(chǎn)酯能力、糖化酶活力、蛋白酶活力等為篩選指標(biāo),旨在提高白酒中的有機酸、酯類物質(zhì)等功能物質(zhì)以及對原料的利用率[28,29,31]。針對發(fā)酵乳產(chǎn)品的微生物,會以胞外多糖、產(chǎn)酸能力、耐酸能力、半乳糖苷酶活力等為篩選指標(biāo),旨在提高產(chǎn)品的黏度、風(fēng)味以及益生功能[32-34]。

另外,表3收集了航天優(yōu)良菌株應(yīng)用于實際生產(chǎn)之中的相關(guān)報道,并將航天菌株/菌群,應(yīng)用于的發(fā)酵食品種類,以及應(yīng)用效果進行歸納總結(jié)。

表3 航天育種后的發(fā)酵微生物在發(fā)酵食品中的應(yīng)用效果Table 3 Application effects of fermented microorganisms after space-flight breeding in fermented food

目前在發(fā)酵食品領(lǐng)域上,航天微生物已在白酒、醬油、食用醋以及啤酒上的具有實際應(yīng)用。例如,利用誘變后的優(yōu)良己酸菌(己酸產(chǎn)量提高45%),與普通窖泥按一定比例混合制成的航天窖泥,用于發(fā)酵濃香型白酒。所得白酒中,各種有機酸(己酸、乙酸、丁酸等)含量和酯類化合物(乙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯等)含量均有提高。其中,總酸含量和總酯含量各提升了300和1 000 mg/L,達到1 371和6 205 mg/L,提升最多的為乙酸乙酯,提高了500 mg/L[28]。利用經(jīng)航天誘變的根酶、黑曲霉和毛酶,與原來使用的米曲霉混合制曲,制得生抽色、香、味、體俱佳,達到高品質(zhì)生抽的要求,并且產(chǎn)量提高[36]。3株航天啤酒酵母HT-1、HT-2、HT-3釀造的啤酒,高級醇和酯類物質(zhì)的含量均高于市售啤酒,雙乙酰的含量控制在0.08 mg/L 左右。經(jīng)專家品審,航天酵母釀造的啤酒具有典型的啤酒風(fēng)味與特點,并且HT-2能給啤酒帶來明顯的香蕉風(fēng)味[30]。

但目前航天誘變微生物在發(fā)酵食品上的應(yīng)用甚少,并且許多誘變菌株成果也僅停留在實驗室試驗階段,還沒有將其應(yīng)用于實際生產(chǎn)中[32-34]。例如,嗜熱鏈球菌G2航天誘變菌株能為發(fā)酵乳帶來更高的酸度、黏度和胞外多糖含量,從而提高產(chǎn)品的品質(zhì),但僅停留于實驗室階段的試驗,并未進一步應(yīng)用到發(fā)酵乳產(chǎn)品中[33]。

目前,國內(nèi)外對于微生物航天誘變育種的研究也主要集中于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[3,26],在發(fā)酵食品微生物領(lǐng)域涉及不多。除我國外,其他發(fā)展中國家尚不具備對微生物航天誘變的基礎(chǔ)和條件。開展發(fā)酵微生物航天育種的相關(guān)研究,能夠填補此方面的空白。

3.2 航天育種在發(fā)酵食品的應(yīng)用前景

航天育種能夠提高發(fā)酵食品微生物的各項性能,對發(fā)酵食品具有優(yōu)良的生產(chǎn)應(yīng)用前景。但目前對于食品發(fā)酵微生物航天育種的研究甚少,在已報道的文獻中,國外暫時還沒有這方面的研究,國內(nèi)至今也僅有本文收集的報道,發(fā)酵食品微生物的航天育種研究仍處于起步階段。微生物航天誘變技術(shù)目前多用于醫(yī)學(xué)研究中,在食品發(fā)酵和釀造中的應(yīng)用較少。研究主要集中于誘變菌株的DNA、基因表達、生理生化特性的變化,選取的菌株亦多為醫(yī)用菌株。

釀造微生物是發(fā)酵食品中最重要的組成部分,對發(fā)酵食品的風(fēng)味、品質(zhì)和安全至關(guān)重要。廣式傳統(tǒng)發(fā)酵食品包括廣式發(fā)酵肉制品、廣式調(diào)味品(醬油、腐乳、豆豉、豆醬等)、廣東米酒、廣東客家黃酒、嶺南特色果酒、廣式米糕等。品種繁多,量大面廣,深蘊文化傳承。但部分廣式傳統(tǒng)發(fā)酵食品受制于自身品質(zhì)問題,未能在全國范圍內(nèi)推廣。例如,廣東黃酒中的殘?zhí)呛窟^高,會導(dǎo)致口感過于甜膩、并且易產(chǎn)生酸敗,但釀造過程中的高糖環(huán)境致使酵母處于低活性狀態(tài),無法充分利用殘?zhí)荹38]。廣東米香型白酒的釀造工藝簡單、發(fā)酵周期短、采用半固態(tài)發(fā)酵的方式導(dǎo)致其酯類物質(zhì)與有機酸物質(zhì)含量較少、香氣不足,并且雜醇油含量普遍較高[39]。廣式豆制品如腐乳、豆豉、豆醬在制作過程中必須經(jīng)歷浸豆過程,該過程中脂肪氧化酶被活化,催化油脂產(chǎn)生氫過氧化物,再降解生成小分子醇、醛、酮、酸和胺等豆腥味成分,至其市場接受度不高[40]。

微生物航天育種技術(shù)可為廣式傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物的篩選及應(yīng)用開辟新的途徑,以期用太空獨特的環(huán)境為廣式傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物帶來性能的優(yōu)化。例如,提高酒曲中微生物的產(chǎn)酸、產(chǎn)酯、耐高糖能力,使發(fā)酵更加充分,酒風(fēng)味及功能成分得到提高,降低雜醇油的含量。培養(yǎng)能夠利用豆腥味成分的發(fā)酵菌株,降低豆制品中不愉悅的豆腥味。微生物航天育種技術(shù)可解決廣式傳統(tǒng)發(fā)酵食品在發(fā)酵過程中的存在的問題,提升其品質(zhì)與價值,該技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景。

4 討論與展望

在太空中,微生物會出現(xiàn)一系列的應(yīng)激反應(yīng)。多年來,國內(nèi)外許多科研組對微生物進行了多項太空試驗。證實了太空環(huán)境會影響微生物的生長情況、生物膜形成能力、對抗生素的耐藥性、毒性、基因的表達、DNA 的損傷與修復(fù)等。此外,太空中的微重力和太空輻射等環(huán)境條件可為微生物誘變育種提供優(yōu)秀的誘變源,篩選得到的優(yōu)良菌株可應(yīng)用于實際生產(chǎn)中,也可為日后在太空中進行的微生物試驗提供合適的菌株。

微生物航天誘變育種技術(shù)目前多用于醫(yī)學(xué)研究中[3,26],如表1中提到的銅綠假單胞菌和大腸桿菌是條件性致病菌,在太空中宇航員會有幾率被感染[15,20],腸炎沙門氏菌會引起人和動物的腸胃和系統(tǒng)性疾病[13]。而其在食品發(fā)酵和釀造中的研究甚少。廣式傳統(tǒng)發(fā)酵食品品種繁多,量大面廣,深蘊文化傳承,而釀造微生物對發(fā)酵食品的風(fēng)味和質(zhì)量至關(guān)重要,微生物航天育種技術(shù)可為廣式傳統(tǒng)發(fā)酵食品釀造微生物的篩選及應(yīng)用開辟新的途徑,具有廣闊的應(yīng)用前景。