羅湘藍(lán)，劉 平，張 望，蘇雯靚，王蘇亞，閻乃寬，陳建國(guó)，蘇華龍

0 引言

癲癇與抑郁是神經(jīng)精神科學(xué)領(lǐng)域的常見疾病，兩者關(guān)系密切。癲癇作為最常見的精神系統(tǒng)疾病，是誘發(fā)抑郁癥的危險(xiǎn)因素之一，癲癇患者并發(fā)抑郁癥的發(fā)病率是健康人群的2～3倍[1]。近期一項(xiàng)基于3 227例癲癇患者的Meta分析研究顯示，癲癇患者伴有抑郁的發(fā)病率高達(dá)22.9%[2]。另一項(xiàng)通過(guò)回顧性分析12 720例14歲以上癲癇患者的研究顯示，癲癇患者并發(fā)抑郁癥的發(fā)病率約為16.3%[3]。由于抑郁癥狀不典型，癲癇伴發(fā)抑郁容易被臨床忽視，嚴(yán)重影響了患者及其家庭的生活質(zhì)量。柴胡疏肝湯、補(bǔ)中益氣湯等是治療癲癇發(fā)作或者情志低落的有效方劑[4-5]，其中黃芪則作為這些方劑中的主要組成部分，發(fā)揮著重要作用。Song等[6]的研究顯示，黃芪甲苷IV(Astragaloside Ⅳ,ASG IV)介導(dǎo)PPARγ/NF-κB/NLRP3炎性反應(yīng)通路，改善長(zhǎng)束縛造成的小鼠抑郁樣行為。而Sun等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ在匹羅卡品點(diǎn)燃的癲癇癥狀小鼠腦中激活，并造成腦中產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)與認(rèn)知功能損傷。因此，癲癇與抑郁是共生關(guān)系，在生理病理方面共享某些相同機(jī)制，如神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激等，而這些機(jī)制的最終導(dǎo)向都是神經(jīng)元死亡。Zhu等[8]發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷IV通過(guò)抑制MAPK信號(hào)通路的激活改善神經(jīng)元凋亡以緩解青霉素誘導(dǎo)的癲癇癥狀。因此，黃芪甲苷IV能夠通過(guò)改善神經(jīng)元凋亡有效改善癲癇合并抑郁樣癥狀，但其機(jī)制尚待進(jìn)一步探索。因此，本研究擬采用匹羅卡品點(diǎn)燃小鼠癲癇反應(yīng)，探究其造成抑郁樣行為的機(jī)制，討論黃芪甲苷IV對(duì)癲癇合并抑郁的治療機(jī)制，為臨床使用提供理論支持。

1 方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 60只7周齡C57/BL6小鼠(第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，體重(20±2)g。小鼠在飼養(yǎng)室適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為對(duì)照組(Control group)、癲癇組(Epilesy group)、ASG IV低劑量組(ASG IV-L group,20 mg/kg)、ASG IV高劑量組(ASG IV-H group,40 mg/kg)、ASG IV(40 mg/kg)+ LY2109761(1 μg/只)組(ASG IV+ LY2109761 group)。小鼠飼養(yǎng)條件：室溫(22±2)℃，正常日夜節(jié)律，自由飲水與攝食。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 匹羅卡品，氯化鋰(武漢博士德公司)；辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)山羊抗兔和山羊抗鼠二抗、RIPA蛋白裂解液、BCA試劑盒，Nissl染色試劑盒(上海碧云天公司)；LY2109761試劑(美國(guó)西格瑪公司)；TGF-β1、p-Smad2、Smad2、β-actin蛋白抗體(美國(guó)CST公司)；Cleaved-caspase-3、Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白抗體(武漢三鷹生物公司)。

1.3 動(dòng)物給藥與造模 造模前7 d，對(duì)照組與癲癇組連續(xù)灌胃10 ml/kg生理鹽水，ASG IV-L組小鼠連續(xù)灌胃20 mg/kg ASG IV，ASG IV-H組與ASG IV+LY2109761組小鼠連續(xù)給藥ASG 40 mg/kg；造模前3 d，ASG IV+ LY2109761組連續(xù)鼻滴TGF-β1抑制劑LY2109761，1 μg/只。造模時(shí)，參考文獻(xiàn)癲癇造模方法[9]，除對(duì)照組外，其余各組首先腹腔注射180 mg/kg新鮮配置的氯化鋰溶液，12 h后先行阿托品皮下注射，30 min后腹腔注射50 mg/kg匹羅卡品溶液。對(duì)照組于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)給予等量生理鹽水。

1.4 動(dòng)物行為學(xué)觀察

1.4.1 癲癇發(fā)作次數(shù)和等級(jí) 腹腔注射氯化鋰和匹羅卡品結(jié)束后30～90 min內(nèi)，觀察小鼠癲癇發(fā)作次數(shù)，對(duì)癲癇的發(fā)作級(jí)別進(jìn)行評(píng)價(jià)。根據(jù)Racine標(biāo)準(zhǔn)[10]判定癲癇發(fā)作級(jí)別。0級(jí)：正常行動(dòng)，無(wú)抽搐發(fā)作；1級(jí)：面部肌肉痙攣，表現(xiàn)為咀嚼運(yùn)動(dòng)、眨眼、動(dòng)須等，濕狗樣顫動(dòng)；2級(jí)：頸部肌肉陣攣表現(xiàn)為點(diǎn)頭運(yùn)動(dòng)，但無(wú)直立位，濕狗樣顫動(dòng)不停止；3級(jí)：一側(cè)前肢陣攣，伴直立位；4級(jí)：雙前肢陣攣，伴直立位；5級(jí)：在IV級(jí)基礎(chǔ)上身體向后倒下失去平衡，四肢抽動(dòng)。癲癇發(fā)作III級(jí)以上，連續(xù)癲癇性發(fā)作超過(guò)30 min以上者為癲癇持續(xù)狀態(tài)。

1.4.2 糖水偏好實(shí)驗(yàn) 氯化鋰合并匹羅卡品腹腔注射造模結(jié)束后24 h，所有小鼠禁食禁水12 h，各給予1 ml 1%蔗糖水和普通涼開水適應(yīng)12 h。隨后所有小鼠單籠飼養(yǎng)，每籠小鼠各給予1 ml 1%蔗糖水和普通涼開水。記錄小鼠攝水12 h后糖水和白開水?dāng)z取量。糖水偏好率(%)=蔗糖水消耗量/(蔗糖水消耗量+純水消耗量)×100%

1.4.3 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 糖水偏好測(cè)試結(jié)束后6 h，將小鼠置于直徑30 cm、高50 cm的不透明圓形強(qiáng)迫游泳容器中，適應(yīng)2 min，小鼠之間用隔板隔開。攝像記錄分析隨后4 min內(nèi)小鼠靜止不動(dòng)時(shí)間。

1.4.4 懸尾實(shí)驗(yàn) 強(qiáng)迫游泳測(cè)試結(jié)束后6 h，將小鼠尾尖懸掛于懸尾裝置上，適應(yīng)2 min，各小鼠之間用隔板隔開。攝像記錄分析隨后4 min內(nèi)小鼠靜止不動(dòng)時(shí)間。

1.5 動(dòng)物取材 行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，取3只小鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，迅速打開胸腔暴露心臟，剪開左心室和右心耳。使用灌注針，自心臟左心室注入PBS溶液，從右心耳流出。待右心耳流出澄清液體時(shí)，再使用100 ml 4%多聚甲醛磷酸緩沖液緩慢灌注。斷頭取腦組織固定于4%多聚甲醛中，用于Nissl染色檢測(cè)。剩余小鼠測(cè)完行為學(xué)后，迅速斷頭處死，取腦組織中海馬組織與皮層組織，用于Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.6 Nissl染色 取出多聚甲醛中大腦組織，流水沖洗標(biāo)本后使用乙醇進(jìn)行梯度脫水，再透明、浸蠟、包埋，切片機(jī)上切成4 μm厚石蠟切片。石蠟切片常規(guī)脫蠟脫水，采用SP法，高壓修復(fù)抗原，依次加入3%過(guò)氧化氫、10%山羊封閉血清，之后按說(shuō)明書使用尼氏染色試劑盒進(jìn)行染色，烘干后使用中性樹膠封片，置生物顯微鏡拍片。本研究統(tǒng)計(jì)方法是對(duì)圖片中海馬區(qū)神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值后以對(duì)照組為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行歸一化分析處理。

1.7 Western blot實(shí)驗(yàn) 按蛋白提取試劑盒說(shuō)明書提取小鼠海馬組織總蛋白，以BCA試劑盒測(cè)定總蛋白濃度，以蛋白量10 μg進(jìn)行上樣，采用SDS-PAGE凝膠電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯影后使用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1 黃芪甲苷IV對(duì)小鼠癲癇樣行為的影響 研究結(jié)果如表1所示，與對(duì)照組相比，癲癇組造模成功后表現(xiàn)出不同等級(jí)的痙攣、癲癇發(fā)作，1 h內(nèi)達(dá)到6.91次，平均等級(jí)達(dá)到4.16級(jí)。提示氯化鋰合并匹羅卡品成功造成小鼠出現(xiàn)癲癇癥狀。與癲癇組相比，黃芪甲苷IV高劑量組發(fā)作頻率與發(fā)作等級(jí)顯著降低(P<0.05)，而黃芪甲苷IV低劑量組與癲癇組相比并沒(méi)有顯著性改變，提示黃芪甲苷IV改善小鼠癲癇行為具有劑量依賴性。此外，TGF-β1受體抑制劑LY2109761的預(yù)給藥阻斷了黃芪甲苷IV改善小鼠癲癇發(fā)作的作用，提示黃芪甲苷IV改善小鼠癲癇發(fā)作可能與TGF-β1相關(guān)。

表1 氯化鋰合并匹羅卡品誘導(dǎo)小鼠癲癇自發(fā)性再發(fā)作的頻率與程度

2.2 黃芪甲苷IV對(duì)小鼠抑郁樣行為的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，與對(duì)照組相比，癲癇組小鼠糖水?dāng)z取率降低(P<0.05)，且強(qiáng)迫游泳與懸尾不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)(P<0.05)。提示癲癇造成這些小鼠出現(xiàn)一定程度的抑郁樣癥狀。此外，與模型組相比，黃芪甲苷IV預(yù)給藥能夠改善小鼠抑郁樣行為，其中，黃芪甲苷高劑量組小鼠糖水?dāng)z取率升高(P<0.05)，而強(qiáng)迫游泳和懸尾不動(dòng)時(shí)間縮短(P<0.05)。此外，TGF-β1抑制劑顯著逆轉(zhuǎn)了黃芪甲苷IV改善小鼠抑郁樣行為的效果(P<0.05)。提示黃芪甲苷IV通過(guò)TGF-β1信號(hào)通路途徑，改善小鼠抑郁樣行為。

2.3 黃芪甲苷IV對(duì)小鼠海馬組織中TGF-β1/Smad2路蛋白的影響 與對(duì)照組相比，癲癇組小鼠海馬中TGF-β1蛋白表達(dá)水平、Smad2磷酸化水平顯著降低(P<0.05)。黃芪甲苷IV預(yù)給藥能夠升高TGF-β1蛋白、p-Smad2蛋白水平，且高劑量黃芪甲苷IV預(yù)給藥能夠顯著升高上述蛋白表達(dá)(P<0.05)。此外，TGF-β1干預(yù)降低了黃芪甲苷IV的療效。見圖2。

2.4 黃芪甲苷IV對(duì)小鼠海馬組織中凋亡相關(guān)蛋白的影響 與對(duì)照組相比，癲癇組小鼠大腦中Caspase-3剪切升高(P<0.05)，且Bcl-2表達(dá)降低，Bax表達(dá)升高，Bcl-2/Bax表達(dá)比例降低(P<0.05)；與癲癇組相比，高劑量黃芪甲苷顯著抑制了小鼠海馬中Caspase-3蛋白剪切，升高Bcl-2與Bax表達(dá)比例。此外，與對(duì)照組相比，ASG IV+LY2109761組海馬中Caspase-3表達(dá)比例升高(P<0.05)，Bcl-2/Bax表達(dá)比例降低(P<0.05)，提示黃芪甲苷IV能夠改善小鼠海馬中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，其機(jī)制與TGF-β1受體激活有關(guān)。見圖3。

圖1 氯化鋰合并匹羅卡品誘導(dǎo)小鼠抑郁樣行為學(xué)檢測(cè)

圖2 Western blot檢測(cè)各組大鼠海馬組織中TGF-β1、p-Smad2 蛋白的表達(dá)

圖3 Western blot檢測(cè)各組大鼠海馬組織中Cleaved-caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)

2.5 黃芪甲苷IV對(duì)小鼠海馬神經(jīng)元的影響 如圖4所示，Nissl染色結(jié)果顯示對(duì)照組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)正常，細(xì)胞核呈藍(lán)色分布，Nissl體陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)表達(dá)豐富，各層細(xì)胞結(jié)構(gòu)整齊，無(wú)神經(jīng)元細(xì)胞損傷；與對(duì)照組相比，癲癇組小鼠海馬區(qū)域CA1區(qū)神經(jīng)元呈層狀排列，結(jié)構(gòu)紊亂，大量細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)改變，細(xì)胞核固縮，細(xì)胞膜破裂，Nissl體表達(dá)顯著降低(P<0.05)，造成小鼠腦部異常放電并表現(xiàn)出癲癇行為。與癲癇組類似，與對(duì)照組相比，ASG IV+TGF-β1組Nissl體表達(dá)顯著降低(P<0.05)。然而，與癲癇組相比，高劑量ASG IV預(yù)給藥能夠顯著改善小鼠海馬中神經(jīng)元損傷(P<0.05)，提高Nissl體陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，提示黃芪甲苷能夠改善小鼠海馬神經(jīng)元損傷。

圖4 Nissl染色檢測(cè)黃芪甲苷IV對(duì)氯化鋰合并匹羅卡品誘導(dǎo)小鼠海馬神經(jīng)元的影響及量化統(tǒng)計(jì)圖

3 討論

癲癇是一種由多原因引起的局部腦區(qū)神經(jīng)元異常放電，大腦功能短暫障礙的一種慢性疾病。表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、意識(shí)、精神等方面異常，伴有全身抽搐痙攣的現(xiàn)象[11]。本次點(diǎn)燃小鼠癲癇化學(xué)藥物為氯化鋰合并乙酰膽堿受體激動(dòng)劑匹羅卡品，其所致的癲癇模型屬于比較典型的顳葉癲癇模型，臨床上顳葉癲癇最常見，而抑郁也與顳葉或額葉癲癇發(fā)作有關(guān)[12]。研究顯示，氯化鋰合并匹羅卡品可引起小鼠出現(xiàn)與臨床類似的不同程度的全身痙攣，伴有濕狗樣顫動(dòng)的現(xiàn)象。本次實(shí)驗(yàn)中氯化鋰合并匹羅卡品成功點(diǎn)燃小鼠癲癇模型。黃芪甲苷IV提前干預(yù)能夠在一定程度上緩解小鼠癲癇發(fā)作的頻率與等級(jí)。此外，抑郁與癲癇一樣，屬于神經(jīng)退行性疾病，兩者在病理生理上共享某些機(jī)制。癲癇伴發(fā)抑郁的致殘率、致死率高于非抑郁組，并且伴發(fā)抑郁對(duì)于癲癇個(gè)體而言，治療預(yù)后較差[13-14]。本次實(shí)驗(yàn)中，癲癇造模成功的同時(shí)造成小鼠出現(xiàn)抑郁樣癥狀，表現(xiàn)出糖水偏好攝取率降低的無(wú)喜感偏好行為，強(qiáng)迫游泳及懸尾不動(dòng)時(shí)間增加的求生欲降低現(xiàn)象。而黃芪甲苷IV顯著改善了小鼠抑郁樣行為，TGF-β1抑制劑則逆轉(zhuǎn)了黃芪甲苷IV的抗抑郁效果，提示本次實(shí)驗(yàn)成功造成了小鼠出現(xiàn)癲癇合并抑郁樣癥狀。黃芪甲苷IV能夠顯著改善小鼠癲癇合并抑郁的癥狀，且存在劑量依賴性，其機(jī)制可能與提高TGF-β1蛋白表達(dá)相關(guān)。

TGF-β1是一種多功能的細(xì)胞因子，能夠調(diào)節(jié)多種生理和病理過(guò)程。TGF-β1可由中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，從而參與調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和凋亡，在多種生理病理發(fā)展過(guò)程中起重要作用。外源性TGF-β1能夠顯著改善小鼠癲癇發(fā)病，減少小鼠海馬中神經(jīng)細(xì)胞凋亡[15-16]。TGFβ1作用于下游受體型的Smad2，使Smad2蛋白C端絲氨酸參加磷酸化，Smad2轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄因子聚合物L(fēng)EF/TCF，調(diào)控相應(yīng)基因表達(dá)，以此產(chǎn)生廣泛的生物學(xué)效應(yīng)[17]。有報(bào)道，中藥能夠改善慢性病變的臨床癥狀和防治靶器官受損[18]。黃芪甲苷IV是黃芪的主要有效成分，在神經(jīng)退行性疾病中表現(xiàn)出顯著的抗凋亡作用。在本研究中，癲癇組小鼠海馬中TGF-β1蛋白表達(dá)顯著降低，且其下游Smad2磷酸化水平顯著降低。黃芪甲苷IV有效增加TGF-β1蛋白表達(dá)，增加Smad2磷酸化水平。然而，TGF-β1抑制劑顯著逆轉(zhuǎn)了黃芪甲苷的促進(jìn)表達(dá)作用，提示黃芪甲苷可調(diào)控TGF-β1蛋白的表達(dá)。

神經(jīng)元凋亡是癲癇與抑郁在病理生理方面共同的病理機(jī)制之一[19]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，神經(jīng)細(xì)胞癲癇樣放電可促進(jìn)海馬神經(jīng)元凋亡，這與癲癇發(fā)作導(dǎo)致多種凋亡分子表達(dá)，進(jìn)一步誘導(dǎo)多種信號(hào)通路傳導(dǎo)紊亂有關(guān)[20]。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最重要的終末剪切酶，是細(xì)胞殺傷機(jī)制的主要組成部分。在局灶性缺血大鼠中，脂質(zhì)體介導(dǎo)的TGF-β1可以通過(guò)激活絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(MARK/Erk)通路減少腦組織中凋亡的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目及Caspase-3 mRNA的表達(dá)，并可以改善缺血大鼠的神經(jīng)功能障礙[21]。此外，Smad2磷酸化抑制劑SIS3干預(yù)能夠顯著減少其下游Cleaved-Caspase-3表達(dá)[22]。在Bcl-2家族中，bcl-2具有抗凋亡作用，而Bax則是重要的凋亡執(zhí)行分子，具有促凋亡作用，與癲癇小鼠腦中海馬神經(jīng)凋亡密切相關(guān)。本研究中，癲癇組小鼠海馬中Caspase-3剪切顯著升高，而Bcl-2/Bax表達(dá)比例顯著降低，造成小鼠海馬中Nissl體表達(dá)顯著降低。黃芪甲苷IV預(yù)給藥顯著降低了海馬中Caspase-3剪切，Bcl-2/Bax表達(dá)比例顯著升高，而TGF-β1抑制劑有效逆轉(zhuǎn)了黃芪甲苷IV預(yù)給藥對(duì)Cleaved-Caspase-3表達(dá)及Bcl-2/Bax表達(dá)比例的影響，造成神經(jīng)元凋亡增加，提示黃芪甲苷通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β1蛋白改善小鼠海馬中Caspase-3的剪切，而TGF-β1的抑制最終造成了小鼠Caspase-3剪切增加，導(dǎo)致小鼠海馬神經(jīng)元凋亡。

癲癇相關(guān)性抑郁的病因復(fù)雜，目前其發(fā)病機(jī)制尚未明確。癲癇相關(guān)性抑郁動(dòng)物模型能夠部分反映其發(fā)病機(jī)制，神經(jīng)凋亡則是兩種疾病已確認(rèn)的共同通路[23]。本研究顯示，氯化鋰合并匹羅卡品成功造成小鼠出現(xiàn)癲癇樣行為，并且造成小鼠海馬神經(jīng)元凋亡，其可能機(jī)制是抑制TGF-β1蛋白表達(dá)，降低其下游蛋白Smad2磷酸化水平，使Caspase-3蛋白剪切增加，最終導(dǎo)致小鼠海馬神經(jīng)元凋亡，大腦中出現(xiàn)異常放電，造成小鼠出現(xiàn)癲癇合并抑郁樣癥狀。而黃芪甲苷IV能夠有效地增加TGF-β1蛋白表達(dá)，減少Caspase-3蛋白剪切，減少海馬神經(jīng)元凋亡，進(jìn)而減少海馬中異常放電現(xiàn)象，緩解小鼠癲癇合并抑郁樣癥狀。