孫瀟智，李 爽，金 穎，廖 兵

上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎與遺傳發(fā)育學(xué)系，上海200025

人胚胎干細胞（human embryonic stem cell，hESC）是胚胎著床前的多能細胞在體外培養(yǎng)中形成的多能干細胞系，其具有兩大特性——無限自我更新和多能性。無限自我更新是指在體外適宜培養(yǎng)條件下，hESC 能夠無限增殖并保持未分化狀態(tài)；多能性則是指hESC 能夠分化成為體內(nèi)所有類型細胞的發(fā)育潛能。以上兩大特性使得hESC 在藥物研發(fā)與再生醫(yī)學(xué)等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。為了滿足臨床應(yīng)用的要求，在體外培養(yǎng)中獲得狀態(tài)更好、更均質(zhì)的hESC 就成為亟需解決的關(guān)鍵性問題，而對維持hESC 自我更新的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究有助于該問題的解決。隨著相關(guān)研究的不斷深入，研究人員發(fā)現(xiàn)維持hESC 的自我更新不僅需要重要的細胞因子，例如堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1） 等［1-4］，還 需 要 維 持 細 胞 與 細 胞 外 基 質(zhì)（extracellular matrix，ECM） 之間（hESC-ECM），以及細胞與細胞之間（hESC-hESC）的相互作用。傳統(tǒng)觀點認為hESC 通過整合素（integrin）黏附于ECM，不同類型的整合素能夠與不同類型的ECM 組分結(jié)合［5］。而且，已有研究［6-9］表明ECM 的軟硬度影響hESC 的自我更新和向不同細胞譜系的分化。但是，對于ECM 與hESC 相互作用如何調(diào)控自我更新與多能性相關(guān)信號通路和轉(zhuǎn)錄因子的研究還相對匱乏。

目前，已有研究［10-11］證實，八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4（octamer-binding protein 4，OCT4）和性別決定區(qū)Y 框蛋白2（sex determining region Y-box 2，SOX2）在hESC 自我更新維持與分化過程中發(fā)揮決定性作用，其蛋白水平的高低直接影響hESC 細胞的命運。有研究［12］發(fā)現(xiàn)，在hESC 中過表達OCT4 可上調(diào)內(nèi)胚層分化的標志性基因表達，而減少OCT4的表達水平可促進中胚層和內(nèi)胚層分化的標志性基因表達；另有研究［13］表明，在hESC 中降低OCT4水平可促進滋養(yǎng)外胚層分化的標志性基因表達。此外，升高或降低SOX2 表達水平均可誘導(dǎo)hESC 向滋養(yǎng)外胚層分化［14］。但是，hESC 與ECM 相互作用對核心轉(zhuǎn)錄因子OCT4 與SOX2 蛋白水平的影響還不清楚。本研究報道了破壞hESC 與ECM 相互作用對OCT4 和SOX2 蛋白質(zhì)水平的負調(diào)控作用，并對相關(guān)機制進行了初步探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人囊胚內(nèi)細胞團來源的人胚胎干細胞系SHhES8，由本實驗室建立［15］。

1.1.2 主要試劑及儀器 DMEM 培養(yǎng)基、α-微管蛋白（α-tubulin） 抗體（貨號T5168）、羅丹明-鬼筆環(huán)肽（rhodamine phalloidin）購自美國Sigma 公司，F(xiàn)12 培養(yǎng)基、胰蛋白酶和膠原酶Ⅳ（collagenase type Ⅳ，COL4）購自美國Gibco 公司，mTeSR1 培養(yǎng)基、細胞分離溶液Accutase 和分散酶Dispase 購自美國Stemcell Technologies公司，Matrigel 基質(zhì)膠購自美國Corning 公司，乙二醇雙（2-氨基乙醚）四乙酸（EGTA）購自上海碧云天公司，乙二胺四乙酸（EDTA）、熒光二抗（AlexaFluor-488/555/647）購自美國Thermo Fisher Scientific 公司，20S 蛋白酶體抑制劑bortezomib、Rac1 抑制劑EHT 1864 和EHop-016購自美國Selleck 公司，氯喹購自上海Topscience 公司，SOX2 抗體（貨號AF2018）購自美國R&D 公司，OCT4抗體（貨號sc-2079）購自美國Santa Cruz Biotechnology公司，絲切蛋白（cofilin）抗體（貨號5175）、p-cofilin Ser3 抗體（貨號3313）、LIM domain kinase 2（LIMK2）抗體（貨號3845）、p-LIMK1 Thr508/p-LIMK2 Thr505 抗體（貨號3841）、integrin-β1 抗體（貨號9699）、β-肌動蛋白（β-actin）抗體（貨號4967）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（貨號5174）、辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)二抗購自美國Cell Signaling Technology公司。

二氧化碳細胞培養(yǎng)箱（HERAcell 150i，美國Thermo Fisher Scientific 公司），倒置生物顯微鏡（ECLIPSETi-S，日本Nikon 公司），全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（5200S，上海Tanon 公司），激光共聚焦顯微鏡（TCS SP8，德國Leica 公司），軌道阱質(zhì)譜儀（LTQ Orbitrap Velos，美國Thermo Finnigan公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 hESC 的培養(yǎng)及不同傳代處理方式的比較 復(fù)蘇SHhES8 細胞株，接種于Matrigel 包被的細胞培養(yǎng)皿中，加入mTeSR1 細胞培養(yǎng)液，置于細胞培養(yǎng)箱中（37 ℃，5%CO2），每日更換新鮮mTeSR1 細胞培養(yǎng)液。待細胞克隆長到合適大小，采用不同細胞傳代方式進行處理。加入適量Dispase（1 mg/mL）或COL4（1 mg/mL）消化約8 min，使用DMEM/F12 基礎(chǔ)培養(yǎng)基反復(fù)吹打細胞集落成為懸浮的細胞團塊。利用Accutase（約7 min）或0.05%胰蛋白酶（約3 min） 在37 ℃分別消化hESC，使用DMEM/F12 基礎(chǔ)培養(yǎng)基反復(fù)吹打細胞集落成為懸浮的單細胞。同時以機械法（用細胞刮板刮取細胞，Scrape）和未做處理的細胞（Ctrl）作為對照。離心收集細胞（100×g，5 min），加入1×蛋白上樣緩沖液［protein loading buffer（PLB），含50 mmol/L Tris-Cl（pH 7.4）、2%SDS、5%β-巰基乙醇、10%甘油、0.01%溴酚藍］裂解細胞，于100 ℃條件下熱變性5 min，超聲處理30 s。收集的細胞蛋白樣品用于Western blotting分析OCT4和SOX2的蛋白水平。

1.2.2 細胞分組 為進一步探究hESC-ECM、hESChESC 的相互作用對細胞OCT4 和SOX2 蛋白表達的影響，將hESC 分 為COL4 組、EGTA 組、COL4+EGTA 組、Scrape 組、EDTA 組和對照組（Ctrl 組）。EGTA 是特異性鈣離子螯合劑，可用于破壞hESC-hESC 的相互作用。EGTA 組細胞加入1 mmol/L EGTA（37 ℃，4 min），使用DMEM/F12 基礎(chǔ)培養(yǎng)基反復(fù)吹打細胞集落成為懸浮的單細胞。COL4+EGTA 組細胞經(jīng)COL4 處理（同COL4 組）后，使用1×PBS 洗滌1 次，然后加入EGTA 處理（同EGTA 組）后，吹打為懸浮的單細胞。EDTA 作為金屬離子螯合劑，能夠同時破壞hESC-ECM 和hESC-hESC 的相互作用，將hESC 克隆消化為單細胞。EDTA 組細胞加入1 mmol/L EDTA（37 ℃，1 min），吹打細胞集落成為懸浮的單細胞。收集細胞蛋白樣品用于Western blotting分析。

1.2.3 Western blotting 分析 取適量蛋白樣品進行SDSPAGE電泳，然后采用濕式電轉(zhuǎn)方法將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，加入3%牛血清白蛋白封閉（室溫，1 h），一抗（1∶1 000～1∶500 稀釋）4 ℃下孵育過夜，1×TBS-T 洗滌3 次，加入HRP 偶聯(lián)二抗，室溫孵育2 h，1×TBS-T 洗滌3 次，通過電化學(xué)發(fā)光試劑（electrochemiluminescence，ECL）進行目的條帶顯色，使用全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)采集圖像。利用軟件Image J［16］的plot lane 和wand tool功能測量蛋白信號條帶的灰度值。

1.2.4 蛋白質(zhì)譜分析 收集Ctrl 組、COL4 組和COL4+EGTA 組的蛋白樣品（hESC 裂解于1×PLB），交由杭州景杰生物科技有限公司進行質(zhì)譜分析。簡要檢測步驟如下：蛋白樣品經(jīng)過定量、質(zhì)檢與淬煉等處理后，使用LTQ Orbitrap Velos 質(zhì)譜儀檢測磷酸化修飾蛋白與總蛋白，并用軟件MaxQuant （version 1.2.2.5）進行分析定量。然后利用網(wǎng)絡(luò)在線分析軟件Metascope（http：//metascape.org/）對各組間差異表達的磷酸化蛋白和總蛋白（蛋白表達差異倍數(shù)>1.2）進行功能富集分析。

1.2.5 免疫熒光染色 使用4%多聚甲醛固定細胞，1%Triton X-100透膜2 min，加入含6%驢血清的封閉液與細胞樣品室溫孵育1 h，按照1∶500～1∶250 比例稀釋一抗，并與細胞樣品4 ℃孵育過夜。1×PBS 洗滌3次，按照1∶500 比例稀釋熒光二抗，將細胞樣品與二抗在暗盒中室溫孵育2 h，然后用熒光染料DAPI 復(fù)染來標記細胞核（室溫、暗盒，孵育15 min），1×PBS 洗滌3 次，封片后，使用激光共聚焦顯微鏡成像系統(tǒng)采集圖像。利用軟件Image J［16］的threshold 和measurement 功能測量免疫熒光信號強度的平均灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用GraphPad Prism 8.0進行統(tǒng)計分析。定量資料均符合正態(tài)分布和方差齊性，用±s表示，利用單因素方差分析（one-way ANOVA）進行組間比較，利用Turkey多重比較法進行兩兩比較。本研究的實驗結(jié)果均經(jīng)過3次以上獨立重復(fù)實驗驗證。若P<0.05，則認為組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同細胞傳代方法對OCT4和SOX2蛋白量的影響

在hESC傳代過程中，酶消化法和機械法是比較常用的實驗手段。常用的酶包括COL4、Dispase、Accutase和胰酶等，其中COL4和Dispase能破壞hESC-ECM的相互作用，但不影響hESC-hESC的相互作用，可以將hESC集落消化為細胞團塊；而Accutase和胰酶能同時破壞hESC-ECM和hESChESC的相互作用，將hESC集落消化成單細胞。與未處理細胞（Ctrl）相比，使用COL4或Dispase處理導(dǎo)致hESC中OCT4與SOX2蛋白水平在短時間內(nèi)發(fā)生顯著下降，而使用Accutase或胰酶以及機械法（Scrape）均對OCT4與SOX2的蛋白水平?jīng)]有顯著影響（圖1）。

2.2 EGTA對COL4處理引起的OCT4和SOX2蛋白水平下降的抑制作用

用COL4 或Dispase 將hESC 消化成細胞團塊導(dǎo)致OCT4 和SOX2 蛋白水平下降，而消化成單細胞不影響其蛋白水平，提示這2 種蛋白水平下降可能與單獨破壞hESC-ECM 的相互作用有關(guān)。為了驗證該假設(shè)，我們采用分別破壞hESC-ECM 和hESC-hESC 細胞間相互作用的實驗策略，即利用COL4 破壞hESC-ECM 相互作用［17］，利用EGTA 破壞hESC-hESC 細胞間相互作用［18］，研究這2 種相互作用對OCT4 與SOX2 蛋白量的影響。Western blotting 結(jié)果（圖2）顯示，與EDTA 組以及Scrape 組相似，EGTA 對OCT4 和SOX2 蛋白水平?jīng)]有明顯影響，但是EGTA 聯(lián)合處理可以阻止COL4 導(dǎo)致的OCT4 和SOX2蛋白水平下降。

圖1 Western blotting 分析不同細胞傳代方法對hESC 中OCT4 和SOX2 蛋白水平的影響Fig 1 Effects of different cell passage methods on protein levels of OCT4 and SOX2 in hESCs detected by Western blotting

2.3 蛋白質(zhì)譜分析篩選差異表達蛋白

由于破壞hESC-ECM的相互作用在短時間內(nèi)即導(dǎo)致OCT4與SOX2蛋白水平的下降，推測蛋白磷酸化信號通路可能參與該過程的調(diào)控。我們采用定量蛋白質(zhì)譜分析，鑒定Ctrl組、COL4組和COL4+EGTA組中差異表達的磷酸化修飾蛋白和總蛋白，并進行功能富集分析。分析結(jié)果顯示，COL4組與Ctrl組的差異表達磷酸化蛋白功能注釋分析富集到多個對干細胞非常重要的基礎(chǔ)生命過程，如mRNA加工與細胞周期等，也富集到與肌動蛋白微絲（actin filament，F(xiàn)-actin）、微管相關(guān)的功能條目（圖3A）。

圖2 同時或分別破壞hESC-ECM和hESC-hESC的相互作用對OCT4和SOX2蛋白水平的影響Fig 2 Effect of disruption of hESC-hESC and hESC-ECM interactions simultaneously or respectively on the protein levels of OCT4 and SOX2 in hESCs

在總蛋白水平，與Ctrl 組相比，COL4 組的自噬相關(guān)蛋白水平上調(diào)（圖3B），COL4+EGTA 組的溶酶體相關(guān)蛋白的水平下調(diào)（圖3C）。以Ctrl 組為基準，在COL4 組中表達上調(diào)的蛋白質(zhì)有34 個，在COL4+EGTA 組表達下調(diào)的蛋白質(zhì)有1 165 個，兩者交集發(fā)現(xiàn)7 個共有蛋白質(zhì)，其中GNAI3 （G protein subunit alpha I3） 和ATP6V0C（ATPase H+transporting V0 subunit C）均與溶酶體活性相關(guān)（圖3D）。該結(jié)果提示破壞hESC-ECM 相互作用下調(diào)OCT4與SOX2蛋白水平可能有溶酶體的參與。

2.4 抑制溶酶體活性對COL4 引起的OCT4 和SOX2 蛋白水平下降的影響

為了判斷破壞hESC-ECM的相互作用是否通過溶酶體下調(diào)OCT4與SOX2蛋白水平，我們使用溶酶體抑制劑氯喹（100 μmol/L）預(yù)處理2 h觀察對這2個蛋白水平的影響，同時使用20S蛋白酶體抑制劑bortezomib（100 μmol/L，預(yù)處理2 h）作為對照。Western blotting結(jié)果顯示，bortezomib不能阻斷COL4處理引起的OCT4和SOX2蛋白水平的下降（圖4A），但是氯喹有效地抑制了OCT4和SOX2的蛋白水平下調(diào)（圖4B）。另外，免疫熒光染色實驗也顯示氯喹能夠挽救COL4處理導(dǎo)致的SOX2蛋白水平下降（圖4C）。

2.5 Rac1/cofilin/F-actin 信號通路在COL4 引起的OCT4和SOX2蛋白水平下降中的作用

蛋白質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，COL4處理后，差異磷酸化蛋白富集到F-actin 和微管蛋白相關(guān)的功能條目，提示細胞骨架系統(tǒng)可能介導(dǎo)hESC-ECM 相互作用對OCT4 與SOX2 蛋白穩(wěn)態(tài)的維持。激光共聚焦顯微鏡分層掃描結(jié)果（圖5A）顯示，羅丹明-鬼筆環(huán)肽標記的F-actin 在貼壁生長的hESC 中呈現(xiàn)極性分布，主要位于基底側(cè)（basal side）和細胞-細胞連接區(qū)域（lateral side），而在細胞頂端（apical side）分布很少，提示F-actin與hESC-ECM 相互作用的相關(guān)性。作為對照，α-tubulin 在hESC 中無明顯極性分布。而SOX2蛋白主要定位在細胞核中。

圖3 蛋白質(zhì)譜分析鑒定的差異表達磷酸化蛋白和總蛋白的功能富集Fig 3 Functional enrichment on differentially expressed phosphorylated proteins and total proteins identified by proteomics analysis

圖4 氯喹對COL4引起的OCT4和SOX2蛋白水平下降的影響Fig 4 Effect of chloroquine on the decrease of OCT4 and SOX2 protein levels induced by COL4

有研究表明Rac1/cofilin信號通路可調(diào)控F-actin的形態(tài)結(jié)構(gòu)［19］。因此，我們檢測了該信號通路中關(guān)鍵因子cofilin的表達。在COL4組中，p-cofilin與cofilin蛋白水平下降顯著，而integrin-β1的表達水平?jīng)]有明顯變化（圖5B）。而且，應(yīng)用Rac1小分子抑制劑EHT1864或EHop016處理hESC均可導(dǎo)致p-cofilin、cofilin、p-LIMK1/2、LIMK2與SOX2蛋白水平下降（圖5C）。

圖5 Rac1/cofilin/F-actin信號通路在COL4引起的OCT4和SOX2蛋白水平下降中的作用Fig 5 Role of Rac1/cofilin/F-actin signaling pathway in the COL4-induced decrease of OCT4 and SOX2 protein levels

3 討論

有研究報道hESC-ECM［20］和hESC-hESC［18］連接參與調(diào)控hESC 自我更新的維持，但是兩者與hESC 中核心轉(zhuǎn)錄因子OCT4 和SOX2 的聯(lián)系還未見報道。在本研究中，我們首先發(fā)現(xiàn)使用COL4或Dispase消化hESC集落成為細胞團塊時，OCT4 與SOX2 蛋白水平迅速下降，然而使用Accutase 或胰酶消化hESC 集落成為單細胞時，不影響OCT4 與SOX2 的蛋白水平。該發(fā)現(xiàn)提示打斷hESChESC 連接能夠阻止破壞hESC-ECM 相互作用所導(dǎo)致的OCT4 與SOX2 蛋白水平的下降。因為EGTA 是特異的鈣離子螯合劑，常被用于破壞細胞間相互作用［18］，所以我們使用其破壞hESC-hESC 連接。與上述假設(shè)相一致，EGTA 能 夠 阻 止COL4 消 化hESC-ECM 引 起 的OCT4 與SOX2蛋白水平的下降，但是其中的確切分子機制尚不明確。進一步研究顯示，當(dāng)使用COL4 消化法破壞hESCECM 相互作用時，可能有溶酶體和Rac1/cofilin/F-actin 信號通路的參與。

3.1 hESC-ECM 相互作用可能通過Rac1/cofilin/F-actin信號通路維持hESC中OCT4與SOX2的蛋白水平

通過蛋白質(zhì)譜分析，我們注意到F-actin 和溶酶體可能與OCT4、SOX2 蛋白水平下降有關(guān)。而且，F(xiàn)-actin 在hESC 的基底側(cè)呈極性分布，提示hESC-ECM 相互作用可能與F-actin 細胞骨架系統(tǒng)有聯(lián)系。此外，破壞hESCECM 相互作用導(dǎo)致Rac1/cofilin/F-actin 信號通路中的關(guān)鍵因子cofilin 的蛋白水平下降，而且抑制Rac1 活性也能導(dǎo)致SOX2 蛋白水平顯著下降，所以Rac1/cofilin/F-actin信號通路可能參與了hESC-ECM 相互作用對OCT4 和SOX2蛋白水平的正向調(diào)控。有趣的是，溶酶體抑制劑氯喹能夠補救hESC-ECM 解離導(dǎo)致的OCT4 和SOX2 蛋白水平下降，我們猜測Rac1/cofilin/F-actin 信號通路可能通過抑制溶酶體途徑提升OCT4 和SOX2 的蛋白水平。由此可見，hESC 與ECM 相互作用可在一定程度上調(diào)控核心轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，該調(diào)控過程可能與Rac1/cofilin/F-actin 信號通路及溶酶體有關(guān)；但是兩者在該路徑中的確切作用以及具體的分子機制還需要更加深入的研究工作。

3.2 從蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)維持角度優(yōu)化hESC 酶消化細胞團塊傳代方法

在進行單層貼壁培養(yǎng)hESC 的細胞傳代時，細胞團塊法和單細胞法是最常用的2 種方法。與單細胞法相比較，團塊法傳代具有諸多優(yōu)點：不破壞細胞間連接，不易引起hESC 細胞凋亡，而且細胞貼壁性更好，自發(fā)分化細胞更少等。但是，本研究發(fā)現(xiàn)，使用COL4 或Dispase 進行酶消化細胞團塊法傳代時，OCT4 與SOX2 的蛋白水平快速降低，而單細胞消化方法不影響OCT4 與SOX2 的蛋白水平。所以，細胞團塊法傳代具有影響OCT4 和SOX2 蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的缺點。我們發(fā)現(xiàn)EGTA 聯(lián)合COL4 處理能夠阻止OCT4、SOX2 以及F-actin 細胞骨架調(diào)控系統(tǒng)中關(guān)鍵蛋白cofilin 的蛋白水平下調(diào)。從維持hESC 傳代過程的蛋白穩(wěn)態(tài)的角度，我們的發(fā)現(xiàn)可能為優(yōu)化hESC 酶消化細胞團塊傳代方法提供線索。但是，EGTA 聯(lián)合COL4 處理對hESC干性維持與分化的影響還有待進一步的研究探索。

綜上所述，我們的研究發(fā)現(xiàn)酶消化細胞團塊法會干擾hESC 的蛋白穩(wěn)態(tài)，特別是核心轉(zhuǎn)錄因子OCT4 和SOX2 蛋白水平的下降，這可能損害hESC 的自我更新能力與多能性；引起該現(xiàn)象的原因可能是hESC-ECM 解離導(dǎo)致Rac1/cofilin/F-actin 信號通路活性下降以及溶酶體活性上升。而采用COL4 聯(lián)合EGTA 消化hESC 或利用溶酶體抑制劑均成功避免了團塊消化法導(dǎo)致的OCT4 和SOX2蛋白水平下降，EGTA 的阻斷作用可能不僅與其對hESChESC 的解離作用有關(guān)，可能還與其能夠激活hESC 的Rac1/cofilin/F-actin 信號通路［18］有關(guān)。但是，hESC-ECM相互作用、Rac1/cofilin/F-actin 信號通路、溶酶體與OCT4、SOX2 蛋白穩(wěn)態(tài)的關(guān)系還未闡明，利用針對相關(guān)節(jié)點關(guān)鍵基因的基因編輯和化學(xué)小分子處理方法將有助于該問題的回答。

參·考·文·獻

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