趙 明，黃 亞，杜 通，林嘉盈，祁秀娟，徐 利，陸文怡，匡延平

1.上海永遠幸婦科醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，上海200131；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院輔助生殖科，上海200011

隨著囊胚培養(yǎng)技術(shù)的成熟，囊胚移植的應(yīng)用愈加廣泛。囊胚移植比分裂期胚胎移植的臨床妊娠率更高［1］，這可能是因為由于囊胚的體外培養(yǎng)過程，能夠淘汰部分遺傳物質(zhì)異常的囊胚，并且內(nèi)膜和胚齡更為同步［2-5］。單胚胎移植策略可有效避免多胎妊娠及其引起的妊娠期高血壓、早產(chǎn)、不良出生結(jié)局等風(fēng)險，并且研究表明單胚胎移植策略不會降低累計妊娠率［6-7］。為獲得最佳的臨床結(jié)局，需要選擇一個具有足夠發(fā)育潛能的囊胚進行移植。研究［8-10］表明，囊胚質(zhì)量與妊娠結(jié)局密切相關(guān)，高質(zhì)量囊胚的妊娠結(jié)局最好。

由于低質(zhì)量囊胚的發(fā)育潛能不如高質(zhì)量囊胚，很多生殖中心不凍存CC 級別囊胚［11］。但對于難以獲得高質(zhì)量囊胚的患者，移植CC 級別囊胚會增加患者的受孕機會。然而，對于移植CC 級別囊胚的臨床結(jié)局情況，以及不同胚齡對于CC 級別囊胚的妊娠結(jié)局的影響等問題國內(nèi)外研究資料較少，結(jié)論尚不明確。本研究旨在探討移植CC 級別囊胚的妊娠結(jié)局情況以及不同胚齡對于CC 級別囊胚凍融移植周期妊娠結(jié)局的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究回顧性分析了從2017年4月—2019年12月于上海永遠幸婦科醫(yī)院進行單個凍融囊胚移植的565例患者資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①單囊胚移植周期。②冷凍復(fù)蘇移植周期。排除標(biāo)準(zhǔn)：①未經(jīng)處理的輸卵管積水。②先天或后天生殖道畸形。③夫妻任意一方染色體核型分析異常。若患者進行了多個移植周期，僅納入第一個移植周期。

本中心采用Gardner 評分系統(tǒng)［12］，從囊胚發(fā)育分期、內(nèi)細胞團和滋養(yǎng)層細胞3個方面對囊胚質(zhì)量進行評價。囊胚發(fā)育分期：1期，囊胚腔小于胚胎總體積的1/2；2期，囊胚腔大于胚胎總體積的1/2；3期，囊胚腔完全占據(jù)了胚胎的總體積；4期，囊胚腔完全充滿胚胎，胚胎總體積變大，透明帶變??；5期，囊胚的一部分從透明帶中逸出；6期，囊胚全部從透明帶中逸出。內(nèi)細胞團分級：A級，細胞數(shù)目多，排列緊密；B級，細胞數(shù)目少，排列松散；C級，細胞數(shù)目很少。滋養(yǎng)層細胞分級：A級，細胞較多，結(jié)構(gòu)致密；B級，細胞不多，結(jié)構(gòu)松散；C級，細胞稀少，結(jié)構(gòu)疏松。本研究中將4～6期AA、AB、BA級別囊胚定義為高質(zhì)量囊胚，4～6期BB、AC、CA級別囊胚定義為中質(zhì)量囊胚，4～6期CB、BC級別囊胚定義為低質(zhì)量囊胚，將4～6期CC級別囊胚定義為CC級別囊胚［8，11］。所有納入移植周期依據(jù)囊胚質(zhì)量分為：高質(zhì)量囊胚組（n=189）、中質(zhì)量囊胚組（n=114）、低質(zhì)量囊胚組（n=140）和CC級別囊胚組（n=122）。

1.2 研究方法

1.2.1 囊胚培養(yǎng) 自然周期、微刺激、激動劑、拮抗劑等常規(guī)促排卵方案參照《輔助生殖促排卵藥物治療專家共識》進行［13］。高孕激素狀態(tài)下促排卵方案（progestin primed ovarian stimulation，PPOS） 在我們先前發(fā)表論文［14］中有詳細描述，常規(guī)方法為自患者月經(jīng)第3 日起予以每日甲羥孕酮（浙江仙琚制藥股份有限公司）4 mg 口服和人類絕經(jīng)期促性腺激素（human menopausal gonadotropin，hMG）150～225 IU（麗珠醫(yī)藥集團股份有限公司）肌內(nèi)注射，直至誘發(fā)排卵。取卵后4～6 h 進行體外受精（in vitro fertilization，IVF）或者卵質(zhì)內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）。囊胚培養(yǎng)采用序貫培養(yǎng)液，在37 °C 條件下培養(yǎng)。受精后第5 日（D5）觀察胚胎并冷凍優(yōu)質(zhì)胚胎，其余胚胎則繼續(xù)培養(yǎng)至第6日（D6）或第7日（D7）進行冷凍。

1.2.2 囊胚冷凍與復(fù)蘇 采用Cryotop冷凍載桿（Kitazato Corporation，日本）進行胚胎冷凍。冷凍前利用激光對胚胎進行人工皺縮，并將胚胎放置培養(yǎng)液中5～15 min。隨后將胚胎轉(zhuǎn)入冷凍液中放置1 min，并在90 s 內(nèi)轉(zhuǎn)移至Cryotop 上，放入液氮中保存。復(fù)蘇時，將胚胎從液氮中移出并迅速轉(zhuǎn)移至37℃的解凍液1 min，然后依次將胚胎轉(zhuǎn)入稀釋液、初次洗滌液、二次洗滌液中分別室溫放置3 min、5 min 和1 min［15］。隨后將胚胎轉(zhuǎn)入囊胚培養(yǎng)液中37 ℃培養(yǎng)，2 h 后移植。采用Hamilton 激光打孔儀（Hamilton，美國；型號ZILOS-tk）對胚胎進行激光打孔輔助孵化。去除透明帶后，培養(yǎng)2～6 h后進行移植。

1.2.3 內(nèi)膜準(zhǔn)備 （1）自然周期：月經(jīng)規(guī)律者，自月經(jīng)周期第10～12日起陰道B超檢測排卵。排卵后即開始黃體支持，排卵后第5日進行胚胎移植。

（2）微刺激周期：月經(jīng)不規(guī)律及排卵障礙者，自月經(jīng)第3 日起每日服用來曲唑（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）2.5～5.0 mg，共計服用3～5 d；月經(jīng)第10日復(fù)查B超，若主卵泡直徑<14 mm，則隔日注射hMG 150 IU，直到誘發(fā)排卵。排卵后開始黃體支持，排卵后第5日進行胚胎移植。

（3）人工周期：月經(jīng)不規(guī)律及內(nèi)膜薄病史者，自月經(jīng)第3 日起服用口服雌二醇（Abbott Healthcare Products，荷蘭），當(dāng)內(nèi)膜厚度超過8 mm 后開始黃體支持，在黃體支持的第6日進行胚胎移植。

黃體支持為口服地屈孕酮（Abbott Healthcare Products，荷蘭）、口服雌二醇地屈孕酮片（Abbott Healthcare Products，荷蘭）和陰道塞入黃體酮軟膠囊（法國Laboratoires，法國），黃體支持持續(xù)到妊娠后8周。

1.2.4 妊娠結(jié)局判定 生化妊娠定義為移植后14 d 血β-人絨毛膜促性腺激素（β-human chorionic gonadotropin，β-HCG）>5 IU/L。生化妊娠率=生化妊娠周期數(shù)/移植囊胚周期數(shù)×100%。臨床妊娠定義為移植后35 d B超下見妊娠囊及原始心管搏動。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植囊胚周期數(shù)×100%。早期流產(chǎn)定義為妊娠12 周內(nèi)自然或人工流產(chǎn)。早期流產(chǎn)率=早期流產(chǎn)妊娠數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%。持續(xù)妊娠率的定義為妊娠20 周及以后周期數(shù)/移植囊胚周期數(shù)×100%。異位妊娠率的定義為異位妊娠數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用R 語言（3.6.1）進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。采用Shapiro-Wilktest 檢驗正態(tài)分布和Levene's test 檢驗方差齊性。正態(tài)分布且方差齊性資料以±s 表示，組間差異比較采用方差分析；非正態(tài)分布或方差不齊資料以M（Q1，Q3）表示，組間差異比較采用Kruskal-Wallis H 檢驗。定性資料以n（%）表示，組間差異比較采用χ2檢驗（樣本量>40 且最小理論頻數(shù)>5）或Fisher 精確檢驗（樣本量≤40 或最小理論頻數(shù)≤5）。采用多元回歸模型校正可能的混雜因子，并計算校正比值比（adjusted odds ratio，aOR） 和95% 置 信 區(qū) 間（95% confidence interval，95%CI）。多元回歸模型中“參考”是作為比較的參照，設(shè)定的aOR是1。P<0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同質(zhì)量胚胎移植組的比較

2.1.1 不同質(zhì)量胚胎移植組患者基礎(chǔ)情況比較 本研究共納入565個單囊胚凍融移植周期。4組間的女方年齡、基礎(chǔ)卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）水平、抗米勒管激素（anti-müllerian hormone，AMH）水平、授精方式和胚齡差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其他基線情況差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），詳見表1。

表1 不同質(zhì)量胚胎移植組患者基線資料比較Tab 1 Baseline characteristics grouped by blastocyst quality

2.1.2 不同質(zhì)量胚胎移植組患者臨床結(jié)局比較 如表2所示，不同質(zhì)量胚胎組間的生化妊娠率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P=0.000）。高質(zhì)量囊胚、臨床妊娠率和活產(chǎn)率最高，分別達58.7%和46.2%。隨胚胎質(zhì)量下降，臨床妊娠率和活產(chǎn)率隨之下降。中質(zhì)量囊胚的臨床妊娠率和活產(chǎn)率分別為54.4%和43.3%，低質(zhì)量囊胚的則分別為47.1%和36.2%。CC級別囊胚可獲得25.4%的臨床妊娠率和17.6%的活產(chǎn)率。4組間早期流產(chǎn)率和異位妊娠率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。不同質(zhì)量囊胚子代的分娩孕周（P=0.481）和出生體質(zhì)量（P=0.669）差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 不同質(zhì)量胚胎移植組患者妊娠結(jié)局比較Tab 2 Pregnancy outcomes grouped by blastocyst quality

多元回歸分析顯示（表3），胚胎質(zhì)量與臨床妊娠率顯著相關(guān)。與高質(zhì)量囊胚相比，CC 級別囊胚的臨床妊娠率較低（aOR=0.81，95%CI 0.71～0.93，P=0.003）。而中低質(zhì)量囊胚和高質(zhì)量囊胚的臨床妊娠率相似（P＞0.05）。除此之外，女方年齡、基礎(chǔ)FSH 水平、內(nèi)膜準(zhǔn)備方案和移植日內(nèi)膜厚度也顯著影響臨床妊娠率（P<0.05）。

表3 臨床妊娠率多元回歸分析結(jié)果Tab 3 Multivariable analysis of factors associated with clinical pregnancy rate

Continued Tab

2.2 不同胚齡CC級別胚胎妊娠結(jié)局比較

如表4 所示，D6 和D7 CC 級別囊胚的患者年齡顯著大于D5 CC 級別囊胚的患者。D5 CC 級別囊胚生化妊娠率（46.2% vs 37.0% vs 6.7%，P=0.021）、臨床妊娠率（42.3% vs 23.5% vs 6.7%，P=0.040）和活產(chǎn)率（31.6% vs 15.6% vs 0，P=0.133）均高于D6 和D7 的CC 級別囊胚。而早期流產(chǎn)率差異則無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.328）。

表4 不同胚齡CC級別胚胎妊娠結(jié)局比較Tab 4 Pregnancy outcomes grouped by embryonic age

如表5 所示，對CC 級別囊胚的臨床妊娠率的影響因素進行多元回歸分析發(fā)現(xiàn)，胚齡對CC 級別囊胚移植臨床妊娠率有顯著影響。相較于D5 的CC 級別囊胚，D7 的CC 級別囊胚的臨床妊娠率更低（aOR=0.69，95%CI 0.49～0.96，P=0.032）。其他因素對CC 級別囊胚的臨床妊娠率無顯著影響。

表5 CC級別囊胚臨床妊娠多元回歸分析結(jié)果Tab 5 Multivariable analysis of factors associated with clinical pregnancy rate for CC grade blastocysts

3 討論

目前，涉及CC 級別囊胚妊娠結(jié)局的研究極少。van den Abbeel 等［16］的研究數(shù)據(jù)表明，內(nèi)細胞團或滋養(yǎng)外胚層評分為C 的囊胚的活產(chǎn)率均較低?；谄漕A(yù)測模型估計3 期CC 級別囊胚的活產(chǎn)率可達12%，4～5 期CC 級別囊胚可達到27%。我們的研究顯示，CC 級別囊胚的臨床妊娠率可達到25.4%，活產(chǎn)率可達到17.6%。在校正了年齡等混雜因子后，雖然CC 級囊胚獲得臨床妊娠的可能低于高質(zhì)量囊胚，但二者差距并不大（aOR=0.81，95%CI 0.71～0.93，P=0.003）。目前國內(nèi)外較多的生殖中心認為CC級別囊胚發(fā)育潛能極低，不適合凍存［11］。我中心的數(shù)據(jù)顯示，相較于其他級別囊胚組，CC 級別囊胚組的女方年齡和基礎(chǔ)FSH 水平偏高、AMH 水平偏低（表1），提示該組患者整體而言卵巢儲備較差。在臨床實踐中，高齡、卵巢儲備差的患者常常經(jīng)過多次取卵，仍難以獲得優(yōu)質(zhì)胚胎。對于此類患者，建議不要輕易丟棄CC 級別囊胚，移植CC 級別的囊胚可增加患者的受孕機會。同時，我們中心的數(shù)據(jù)顯示，相較于其他級別囊胚組而言，CC 級別囊胚組的早期流產(chǎn)率偏高，活產(chǎn)率偏低（表2），這一現(xiàn)象或與該組患者高齡、卵巢儲備差有關(guān)。

目前對于胚胎發(fā)育潛能的評估主要基于胚胎形態(tài)學(xué)評分［17］。然而相同評分的囊胚卻可能由發(fā)育速度不同的胚胎形成。一些研究［18-20］表明，在形態(tài)學(xué)評分相近的情況下，發(fā)育較快的囊胚相較于發(fā)育遲滯的囊胚有著更好的臨床結(jié)局。Du 等［20］研究發(fā)現(xiàn)D7 囊胚的種植率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率均顯著低于D5 或D6 的囊胚。其可能的原因是發(fā)育遲緩的胚胎中非整倍體率和紡錘體異常率更大，從而降低了其種植能力［21-22］。然而，關(guān)于不同胚齡對CC 級別囊胚妊娠結(jié)局的影響國內(nèi)外未見報道。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在凍融移植周期中，D5 CC 級別囊胚的臨床妊娠率（42.3%）和活產(chǎn)率（31.6%）較高，具有較高的臨床價值；而D6的CC級別囊胚臨床妊娠率為23.5%，活產(chǎn)率為15.6%，雖低于D5的CC級別囊胚，但仍具有一定的移植價值；不過D7 的CC 級別囊胚的臨床妊娠率僅為6.7%，遠低于D5 和D6 的CC 級別囊胚，且未獲得活產(chǎn)，臨床價值很小。

我中心CC 級別囊胚妊娠率較高可能的原因如下：第一，在本研究中，一半以上的患者于促排卵周期采用了PPOS 方案。PPOS 方案由Kuang 等［14］于2015 年首次提出，其創(chuàng)造性地采用外源性孕激素抑制黃體生成素（luteinizing hormone，LH）峰。PPOS 方案能夠獲得與傳統(tǒng)短方案一樣的妊娠結(jié)局且能有效降低卵巢過度刺激的風(fēng)險［13］。2017 年的一項隨機臨床試驗［23］表明，PPOS 可以改善卵巢低儲備的患者的胚胎質(zhì)量。相比于采用自然周期的患者，采用PPOS 方案的患者的獲卵數(shù)和有效胚胎數(shù)量更多［23］。第二，本中心實驗室采用了輔助孵化技術(shù)［24］。在顯微鏡下人工移除透明帶可減少胚胎孵出的阻力，進而提高胚胎的種植率［24］。第三，我中心采用經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下胚胎移植策略。因經(jīng)陰道超聲對于子宮的顯影質(zhì)量優(yōu)于經(jīng)腹部超聲，移植醫(yī)師可以更精準(zhǔn)地選擇宮腔內(nèi)合適的位置進行胚胎移植。有文獻［25］報道，經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下移植相較于腹部超聲引導(dǎo)可顯著增加胚胎種植率和臨床妊娠率，并能降低異位妊娠率。

本研究主要的不足在于其回顧性研究設(shè)計，可能存在潛在的混雜因子未能校正。此外，本研究樣本量較為有限，結(jié)論尚需前瞻性大樣本研究進一步驗證。

綜上所述，本研究表明，對于難以獲得優(yōu)質(zhì)胚胎的患者，移植CC 級別囊胚仍有臨床意義。其中，D5 的CC級別囊胚具有很好的妊娠結(jié)局；D6 的CC 級別囊胚雖然妊娠率較低，但仍具有一定的移植價值；而D7 的CC 級別囊胚臨床價值較小。

參·考·文·獻

[1] Glujovsky D,Farquhar C,Quinteiro Retamar AM,et al. Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted reproductive technology[J].Cochrane Database Syst Rev,2016(6):CD002118.

[2] Shoukir Y, Chardonnens D, Campana A, et al. The rate of development and time of transfer play different roles in influencing the viability of human blastocysts[J]. Hum Reprod,1998,13(3):676-681.

[3] Adler A,Lee HL,McCulloh DH,et al. Blastocyst culture selects for euploid embryos: comparison of blastomere and trophectoderm biopsies[J]. Reprod Biomed Online,2014,28(4):485-491.

[4] Fanchin R, Ayoubi JM, Righini C, et al. Uterine contractility decreases at the time of blastocyst transfers[J]. Hum Reprod,2001,16(6):1115-1119.

[5] Magli MC, Jones GM, Gras L, et al. Chromosome mosaicism in day 3 aneuploid embryos that develop to morphologically normal blastocysts in vitro[J]. Hum Reprod,2000,15(8):1781-1786.

[6] Mancuso AC, Boulet SL, Duran E, et al. Elective single embryo transfer in women less than age 38 years reduces multiple birth rates, but not live birth rates,in United States fertility clinics[J]. Fertil Steril,2016,106(5):1107-1114.

[7] Rodríguez Barredo DB, Tur Padro R, Mancini F, et al. Elective single embryo transfer and cumulative pregnancy rate: five-year experience in a Southern European Country[J]. Gynecol Endocrinol,2012,28(6):425-428.

[8] 夏蘭,吳嫻,徐慧慧,等. 胚胎質(zhì)量對凍融周期中生化妊娠和胚胎早期停止發(fā)育的影響[J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2017,37(3):344-347.

[9] Irani M, Reichman D, Robles A, et al. Morphologic grading of euploid blastocysts influences implantation and ongoing pregnancy rates[J]. Fertil Steril,2017,107(3):664-670.

[10] Oron G,Son WY,Buckett W,et al. The association between embryo quality and perinatal outcome of singletons born after single embryo transfers: a pilot study[J]. Hum Reprod,2014,29(7):1444-1451.

[11] 倪曉蓓,王珊珊,張寧媛,等. 單囊胚冷凍復(fù)蘇周期中囊胚時期及質(zhì)量與臨床結(jié)局相關(guān)分析[J]. 生殖醫(yī)學(xué)雜志,2016,25(10):926-931.

[12] Gardner DK, Lane M. Embryo culture systems[M]//Trounson AO, Gardner DK. Handbook of in vitro fertilization. 2nd ed. Boca Raton, FL: CRC Press,2000:205-264.

[13] 喬杰,馬彩虹,劉嘉茵,等. 輔助生殖促排卵藥物治療專家共識[J]. 生殖與避孕,2015,35(4):211-223.

[14] Kuang Y, Chen Q, Fu Y, et al. Medroxyprogesterone acetate is an effective oral alternative for preventing premature luteinizing hormone surges in women undergoing controlled ovarian hyperstimulation for in vitro fertilization[J]. Fertil Steril,2015,104(1):62-70.e3.

[15] 黃亞,徐利,葛鳳菊,等. 激光輔助孵化完全去除透明帶對冷凍單囊胚移植結(jié)局的影響[J]. 診斷學(xué)理論與實踐,2019,18(3):334-339.

[16] van den Abbeel E,Balaban B,Ziebe S,et al. Association between blastocyst morphology and outcome of single-blastocyst transfer[J]. Reprod Biomed Online,2013,27(4):353-361.

[17] 韓偉,熊順,黃國寧. 體外受精胚胎發(fā)育潛能的形態(tài)學(xué)評估[J]. 生殖醫(yī)學(xué)雜志,2012,21(2):128-132.

[18] Utsunomiya T,Ito H,Nagaki M,et al. A prospective,randomized study:day 3 versus hatching blastocyst stage[J]. Hum Reprod, 2004, 19(7): 1598-1603.

[19] Kovalevsky G, Carney SM, Morrison LS, et al. Should embryos developing to blastocysts on day 7 be cryopreserved and transferred: an analysis of pregnancy and implantation rates[J]. Fertil Steril,2013,100(4):1008-1012.

[20] Du T, Wang Y, Fan Y, et al. Fertility and neonatal outcomes of embryos achieving blastulation on day 7: are they of clinical value?[J]. Hum Reprod,2018,33(6):1038-1051.

[21] Su Y, Li JJ, Wang C, et al. Aneuploidy analysis in day 7 human blastocysts produced by in vitro fertilization[J]. Reprod Biol Endocrinol,2016,14:20.

[22] Hashimoto S,Amo, Hama S, et al. Growth retardation in human blastocysts increases the incidence of abnormal spindles and decreases implantation potential after vitrification[J]. Hum Reprod,2013,28(6):1528-1535.

[23] Chen QJ, Wang Y, Sun LH, et al. Controlled ovulation of the dominant follicle using progestin in minimal stimulation in poor responders[J].Reprod Biol Endocrinol,2017,15(1):71.

[24] Carney SK, Das S, Blake D, et al. Assisted hatching on assisted conception in vitro fertilisation (IVF) and intracytoplasmic sperm injection (ICSI)[J].Cochrane Database Syst Rev,2012,12:CD001894.

[25] 洋歌德(Jagat Prasad Deep). 經(jīng)陰道與經(jīng)腹部超聲引導(dǎo)下胚胎移植對IVF臨床妊娠的影響[D]. 長沙:中南大學(xué),2012.