董曉雷 韓晶晶 楊方浩 朱峰 劉國祥 李冰

(青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院遺傳學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)系，山東 青島 266071)

由于環(huán)境惡化、生活壓力大等因素的影響，人群中不孕不育發(fā)病率逐漸增高[1-2]，給患者家庭造成極大的困擾。男性不育主要表現(xiàn)在睪丸組織氧化損傷，其中精子數(shù)量降低、活動力下降等為主要影響因素。目前常用的改善生殖性能的藥物副作用大，從海洋中尋找改善生殖性能且毒副作用小的天然藥物成為關(guān)注的熱點(diǎn)。螺旋藻中藻藍(lán)蛋白(C-PC)含量豐富，具有抗氧化、抗腫瘤等功效[3-6]，但其在生殖免疫領(lǐng)域作用的研究較少?；钚匝?ROS)是由生物系統(tǒng)代謝產(chǎn)生的一類能夠引起機(jī)體發(fā)生氧化反應(yīng)的物質(zhì)[7-9]，其主要包括有超氧自由基、羥基自由基等。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)量增加時，會導(dǎo)致蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸損傷，對細(xì)胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生有害的作用[10]。研究表明，細(xì)胞中ROS累積可導(dǎo)致細(xì)胞骨架紊亂[11]、抗氧化系統(tǒng)功能障礙[12-13]和細(xì)胞凋亡[14]。生殖細(xì)胞在正常代謝過程中產(chǎn)生ROS并逐漸累積而導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生，從而導(dǎo)致生殖細(xì)胞的損傷，降低了生殖細(xì)胞的質(zhì)量和數(shù)量，影響胚胎發(fā)育[15]。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是潛在的細(xì)胞老化的主要機(jī)制之一[16-17]，其對人類生殖過程的負(fù)面影響不再是爭論的話題[18]。本研究擬觀察C-PC對H2O2誘導(dǎo)的小鼠精原細(xì)胞GC-1 spg氧化損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制，旨在為C-PC在生殖免疫領(lǐng)域的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

C-PC購自臺州賓美生物技術(shù)有限公司；小鼠精原細(xì)胞GC-1 spg購自武漢普諾賽生命科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清、胰蛋白酶消化液購自美國BI公司；青鏈霉素混合液購買于北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒購自中國biosharp公司；H2O2購自美國Sigma公司；Annexin V-PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、ROS檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RIP-1購自成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司；RIP-3購自美國Santa公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

GC-1 spg接種于含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清和體積分?jǐn)?shù)0.01青鏈霉素溶液的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)時將細(xì)胞分為對照組(A組)、模型組(B組)、C-PC低劑量組(C組)、C-PC中劑量組(D組)以及C-PC高劑量組(E組)。調(diào)整GC-1 spg密度為7×107個/L，然后將細(xì)胞接種于96孔(每孔100 μL)或6孔培養(yǎng)板(每孔2 mL)中，細(xì)胞過夜貼壁后，A組和B組加入培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，C、D、E組分別加入0.25、0.50、1.00 g/L C-PC預(yù)處理24 h，A組去除培養(yǎng)液換成新鮮培養(yǎng)液，B、C、D、E組去除培養(yǎng)液，加入含600 μmol/L H2O2的新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖率

各組細(xì)胞經(jīng)處理后，吸出培養(yǎng)基，加入110 μL含體積分?jǐn)?shù)0.10 CCK-8的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，應(yīng)用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處的吸光度(A)值。并計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A-空白組A)/(對照組A-空白組A)×100%。

1.4 DCFH-DA染色測定細(xì)胞內(nèi)ROS水平

按照1∶1 500用無血清培養(yǎng)液稀釋二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)熒光探針，并使終濃度為7.5 μmol/L。各組細(xì)胞經(jīng)處理后，棄掉培養(yǎng)基，6孔板中每孔加入1 mL已稀釋好的DCFH-DA，37 ℃下置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，加入無血清細(xì)胞培養(yǎng)液并在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光強(qiáng)度。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞壞死率

各組細(xì)胞經(jīng)處理后，棄掉培養(yǎng)基，用不含EDTA的胰酶消化，離心收集細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌2次，離心收集細(xì)胞。加入100 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI Staining Solution，混勻，室溫避光孵育15 min，再加入400 μL結(jié)合緩沖液。混勻置于冰上，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.6 Western blot方法檢測細(xì)胞中RIP-1、RIP-3的表達(dá)

各組細(xì)胞經(jīng)處理后，棄掉培養(yǎng)基，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞3次，每組加入200 μL蛋白裂解液(按照RIPA∶PMSF∶IP按100∶1∶1的比例配制)，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測蛋白濃度。在SDS-PAGE上分離蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用TBST配制的50 g/L脫脂奶粉封閉2 h。將該膜在4 ℃下與一抗(1∶1 000)孵育12 h，以GAPDH(1∶2 000)作為內(nèi)參照。將膜用TBST清洗3次，每次10 min。二抗(1∶1 000)在室溫下孵育2 h以后，TBST清洗3次，每次10 min。ECL發(fā)光顯影。使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，目的蛋白相對表達(dá)量以目的蛋白灰度值/內(nèi)參照蛋白灰度值計(jì)算。

2 結(jié) 果

2.1 各組GC-1 spg增殖活性測定

CCK-8法檢測結(jié)果顯示，A、B、C、D、E組細(xì)胞的增殖活性分別為(100.00±5.09)%、(64.91±4.75)%、(76.25±4.94)%、(78.69±8.54)%和(84.20±6.36)%。B組細(xì)胞活性低于A組(F=76.86，q=23.01，P<0.05)，C、D、E組細(xì)胞活性均高于B組，差異均有顯著意義(q=4.45～10.83，P<0.05)。

2.2 C-PC對GC-1 spg內(nèi)ROS水平的影響

熒光顯微鏡下觀察可見，與A組相比，B組細(xì)胞內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度明顯升高；與B組相比，C、D、E組細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光強(qiáng)度明顯降低(圖1)。

2.3 C-PC對H2O2誘導(dǎo)的GC-1 spg壞死的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，A～E組細(xì)胞壞死率分別為0.004±0.001、0.195±0.004、0.166±0.002、0.153±0.003、0.092±0.003。與A組比較，B組壞死細(xì)胞明顯增加(F=206.90，q=60.07，P<0.05)；C、D、E組壞死細(xì)胞均較B組明顯減少，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=9.09～32.41，P<0.05)。見圖2。

①：A組，②：B組，③：C組，④：D組，⑤：E組圖1 各組GC-1 spg內(nèi)ROS水平比較

①：A組，②：B組，③：C組，④：D組，⑤：E組圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組GC-1 spg的壞死率

2.4 C-PC對H2O2誘導(dǎo)的GC-1 spg壞死相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，A～E組細(xì)胞內(nèi)RIP-1蛋白的相對表達(dá)量分別為1.013±0.014、1.947±0.038、1.140±0.021、0.877±0.017、0.517±0.012。RIP-3蛋白相對表達(dá)量分別為0.930±0.012、1.623±0.052、0.883±0.015、0.603±0.015、0.430±0.015。與A組相比，B組細(xì)胞中RIP-1、RIP-3蛋白相對表達(dá)量明顯升高，差異均有顯著性(F=541.2、297.5，q=41.11、26.21，P<0.05)；與B組相比，C、D、E組細(xì)胞中RIP-1、RIP-3蛋白相對表達(dá)量明顯降低，差異均具有顯著性(q=27.97～62.98，P<0.05)。見圖3。

3 討 論

眾所周知，氧化應(yīng)激對人體健康有害，從而導(dǎo)致一些疾病的發(fā)生，如心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腎臟疾病、性成熟的延遲等[19-21]。ROS過量累積使細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，該機(jī)制已被認(rèn)為是導(dǎo)致女性子宮內(nèi)膜異位癥、卵巢癌、多囊卵巢等其他各種常見疾病的潛在影響因素，也是誘導(dǎo)男性精子DNA損傷和精子凋亡的潛在誘因[22]。由于氧化應(yīng)激被認(rèn)為是潛在老化的主要機(jī)制之一[16-17]，降低生殖細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)可有效增強(qiáng)生殖細(xì)胞的活力。研究表明，C-PC是一種有效的過氧自由基清除劑[23]。本研究中，GC-1 spg經(jīng)H2O2處理后，細(xì)胞存活率顯著降低，壞死率升高，C-PC各劑量組處理可以提高細(xì)胞活力和降低壞死率，將損傷逆轉(zhuǎn)到正常狀態(tài)。表明C-PC預(yù)處理可以保護(hù)GC-1 spg免受H2O2的氧化損傷。

①：A組、②：B組、③：C組、④：D組、⑤：E組圖3 Western blot方法檢測各組GC-1 spg中RIP-1、RIP-3蛋白的表達(dá)水平

ROS在調(diào)控細(xì)胞各種功能中扮演著重要角色，正常情況下細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)通過內(nèi)源性自由基或抗氧化防御系統(tǒng)來平衡[24-25]。然而，ROS過量最終會導(dǎo)致抗氧化機(jī)制失衡，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化損傷。其中細(xì)胞經(jīng)H2O2處理后，細(xì)胞內(nèi)會產(chǎn)生過量的ROS，導(dǎo)致細(xì)胞抗氧化能力降低[26]。為了闡明C-PC可以逆轉(zhuǎn)GC-1 spg氧化損傷，本研究對H2O2處理的GC-1 spg內(nèi)ROS水平進(jìn)行檢測。本研究結(jié)果表明，H2O2誘導(dǎo)GC-1 spg損傷后細(xì)胞內(nèi)ROS水平較對照組顯著升高；與模型組相比，C-PC低、中、高劑量組可有效降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平。這些結(jié)果表明，C-PC通過降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平來降低氧化應(yīng)激。

程序性壞死是近年來發(fā)現(xiàn)的一類受死亡信號的調(diào)控、非依賴Caspase的新型細(xì)胞死亡方式[27]，受體相互作用蛋白RIP是其中的關(guān)鍵組分，是反映程序性壞死的重要指標(biāo)。程序性壞死抑制劑Nec-1作用于RIP-1和RIP-3的激酶部分發(fā)揮作用。HANUS等[28]證實(shí)，細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激后，核膜和質(zhì)膜會遭到破壞，細(xì)胞內(nèi)ATP耗竭等，這是程序性壞死的主要特征。RIP-3敲除或使用RIP的抑制劑Nec-1可挽救氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞死亡，表明RIP對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生程序性壞死至關(guān)重要。最近的研究表明，程序性壞死也是視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞在氧化應(yīng)激下死亡的主要機(jī)制[28-29]。

本研究利用H2O2建立GC-1 spg氧化損傷模型，結(jié)果表明H2O2誘導(dǎo)了GC-1 spg發(fā)生程序性壞死，RIP-1、RIP-3是H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞程序性壞死的關(guān)鍵分子，說明RIP-1、RIP-3介導(dǎo)的程序性壞死參與了H2O2誘導(dǎo)的GC-1 spg氧化損傷。

細(xì)胞水平證實(shí)，H2O2在引起GC-1 spg損傷的同時，可上調(diào)RIP-1、RIP-3蛋白的表達(dá)水平。說明C-PC預(yù)處理GC-1 spg能抑制H2O2誘導(dǎo)的RIP-1、RIP-3蛋白表達(dá)上調(diào)，同時能顯著抑制H2O2引起的細(xì)胞損傷，使細(xì)胞存活率升高，降低細(xì)胞內(nèi)ROS生成。因此，抑制程序性壞死可能是C-PC保護(hù)GC-1 spg的另一個重要機(jī)制。

綜上所述，本研究初步認(rèn)為H2O2誘導(dǎo)了GC-1 spg氧化損傷和RIP-1、RIP-3介導(dǎo)的細(xì)胞程序性壞死。這項(xiàng)研究表明，C-PC對H2O2誘導(dǎo)的GC-1 spg氧化損傷具有明顯的保護(hù)作用，其作用可能與C-PC顯著降低GC-1 spg內(nèi)ROS水平，下調(diào)壞死通路蛋白RIP-1、RIP-3的表達(dá)水平，降低細(xì)胞壞死率，從而具有抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的程序性壞死的能力有關(guān)。該研究為C-PC在生殖領(lǐng)域的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)，具有較好的臨床應(yīng)用前景。