周娜 丁偉 宋金蓮 王軍 鄭文祥 侯琳

(1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，山東 青島 266021； 2 青島市婦女兒童醫(yī)院)

神經(jīng)母細(xì)胞瘤(NB)又稱交感神經(jīng)母細(xì)胞瘤[1]，是兒童臨床最常見的顱外惡性實(shí)體瘤[2]。目前，臨床上針對惡性程度高、發(fā)生轉(zhuǎn)移早的高危NB患者常采用超大劑量聯(lián)合化療的治療手段，但是臨床常用的化學(xué)合成藥物具有毒副作用大、效果不佳、易復(fù)發(fā)及伴有明顯的骨髓抑制和較高的感染發(fā)生率等缺點(diǎn)[3]，一定程度上限制了其臨床應(yīng)用。天然化合物可靶向殺傷腫瘤細(xì)胞，毒副作用較小，一直以來被作為新藥開發(fā)的先導(dǎo)化合物的優(yōu)質(zhì)來源[4-7]，為腫瘤的臨床治療提供了新的治療思路。

組蛋白去甲基化酶1(LSD1)是首個被發(fā)現(xiàn)的組蛋白特異性去甲基酶，為黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依賴性的單胺氧化酶家族成員之一[8]，能夠特異性地去除組蛋白第三亞基四號賴氨酸(H3K4)以及組蛋白第三亞基9號賴氨酸(H3K9)的單雙甲基化[9]。LSD1在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[10]、細(xì)胞分化[11]及增殖[12]等過程中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用。KRAAL等[13]研究證明，在許多腫瘤組織中LSD1高表達(dá)。目前，臨床上針對實(shí)體瘤的LSD1抑制劑的需求在很大程度上尚未得到滿足。

近年來隨著對吲哚類化合物的深入研究，發(fā)現(xiàn)含氮雜環(huán)衍生物生物堿在生物體內(nèi)發(fā)揮著愈加重要的作用。吲哚-3-甲醇(I3C)是在花莖甘藍(lán)以及抱子甘藍(lán)等十字花科蔬菜中廣泛存在的抗腫瘤天然成分[14]。張麗[15]研究證明，吲哚醌類化合物對NB細(xì)胞的增殖與遷移具有抑制作用，在臨床NB患者中LSD1高表達(dá)。另外，吲哚醌類化合物為內(nèi)源性的單胺氧化酶(MAO)抑制劑[16]，LSD1為單胺氧化酶，I3C為吲哚類化合物，且I3C在NB細(xì)胞增殖與遷移方面的作用未見報道。因此，本研究以不同濃度的I3C處理SH-SY5Y細(xì)胞，探討I3C對NB細(xì)胞增殖與遷移能力的影響及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料來源

NB細(xì)胞系SH-SY5Y由本課題組提供；CCK8試劑盒以及DMSO購自北京索萊寶科技有限公司；I3C購自美國MedChemExpress(MCE)公司；胎牛血清購自北京全式金生物技術(shù)(TransGen Biotech)有限公司；DMEM/F-12(1∶1)培養(yǎng)基購自福州南江生物科技有限公司；Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒Ⅱ購買于湖南艾科瑞生物工程有限公司；熒光定量PCR Mix購買于北京全式金生物技術(shù)(TransGen Biotech)有限公司；GAPDH、LSD1、H3K4me1/2單克隆抗體購自英國Abcam公司。

1.2 研究方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)0.15的胎牛血清及體積分?jǐn)?shù)0.01青鏈霉素混合溶液的DMEM/F-12(1∶1)培養(yǎng)基中，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)至匯合度達(dá)40%～60%時進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2CCK8實(shí)驗(yàn)檢測SH-SY5Y細(xì)胞活力及半數(shù)致死濃度(IC50值) 將處于對數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞，胰酶消化后接種于96孔板中，每孔約2 000個細(xì)胞，待細(xì)胞完全貼壁并進(jìn)入對數(shù)生長期后，分別加入I3C使其終濃度為0、50、100、150、200、300、500 μmol/L，每種濃度設(shè)5個復(fù)孔，邊緣空孔加入無菌PBS以減少水分蒸發(fā)。藥物處理48 h后，每孔加入CCK8溶液10 μL，再次放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h。置于酶標(biāo)儀上測定波長450 nm處各孔的吸光度(A)值，并計算細(xì)胞活力及IC50值。

1.2.3劃痕實(shí)驗(yàn)檢測SH-SY5Y細(xì)胞的遷移能力 取對數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞，消化并接種于6孔板中，每孔約50 000個細(xì)胞，待細(xì)胞的匯合度達(dá)80%～90%時，用200 μL槍頭垂直于6孔板刮擦細(xì)胞以產(chǎn)生劃痕區(qū)域，用PBS輕輕沖洗掉刮下細(xì)胞及細(xì)胞碎片，然后加入2 mL無血清培養(yǎng)基，以CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出的IC50值為依據(jù)，將細(xì)胞分別加入終濃度為0、30、60、90 μmol/L的I3C(分別為A、B、C、D組)作用48 h，分別于0、48 h時顯微鏡下拍照，記錄劃痕愈合情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.4實(shí)時熒光定量PCR(RT-qPCR)技術(shù)檢測SH-SY5Y細(xì)胞中LSD1 mRNA的相對表達(dá)量 采用Trizol法分別提取I3C作用48 h后A～D組中SH-SY5Y細(xì)胞的總RNA，測定各組RNA濃度與純度，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行RT-qPCR。以GAPDH為內(nèi)參基因，根據(jù)試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，每組樣品設(shè)置3個復(fù)孔，采用2-△△CT法計算各組LSD1 mRNA的相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.5Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測SH-SY5Y細(xì)胞中LSD1、H3K4me1及H3K4me2蛋白的相對表達(dá)量采用RIPA法(加PMSF和蛋白酶磷酸酶抑制劑)提取I3C作用48 h后A～D組SH-SY5Y細(xì)胞的蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量，加入5×loading buf-fer于水中煮沸10 min變性；配制聚丙烯酰胺凝膠，加入25 μg的蛋白樣品至凝膠孔內(nèi)，邊緣空加入1×蛋白上樣緩沖液；進(jìn)行SDS蛋白電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，以50 g/L脫脂奶粉封閉2 h，然后分別以LSD1、H3K4me1以及H3K4me2蛋白(其中H3K4me1、H3K4me2蛋白為LSD1的酶底物)單克隆抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，并以GAPDH作為內(nèi)參照，TBST洗膜后二抗孵育1 h，TBST洗膜，顯影拍照，使用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白的相對表達(dá)量，目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用Graphpad Prism 6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組SH-SY5Y細(xì)胞增殖活力比較

CCK-8試劑盒檢測結(jié)果顯示，當(dāng)I3C濃度為0、50、100、150、200、300、500 μmol/L時，SH-SY5Y細(xì)胞的增殖活力分別為(99.83±0.09)%、(53.11±1.10)%、(35.59±0.75)%、(33.85±0.87)%、(26.40±0.71)%、(24.43±0.30)%、(13.01±0.20)%。隨著I3C濃度的遞增，SH-SY5Y細(xì)胞的增殖活力明顯下降(F=1 823.19，P<0.05)。計算得出I3C作用于SH-SY5Y細(xì)胞48 h的IC50值為121.00 μmol/L，即100 μmol/L濃度以內(nèi)的I3C對細(xì)胞沒有明顯毒性，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)設(shè)定的I3C至終濃度為0、30、60、90 μmol/L。

2.2 各組SH-SY5Y細(xì)胞遷移能力比較

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，I3C作用SH-SY5Y細(xì)胞48 h后，A～D組的細(xì)胞遷移率分別為0.28±0.01、0.19±0.01、0.11±0.01、0.07±0.01，隨著I3C濃度的增高，SH-SY5Y細(xì)胞的遷移能力逐漸降低(F=388.47,P<0.05)，各組間比較差異均具有顯著性(t=8.86～33.43,P<0.05)。

2.3 各組細(xì)胞中LSD1 mRNA的相對表達(dá)量比較

不同濃度I3C處理SH-SY5Y細(xì)胞48 h以后，RT-qPCR結(jié)果顯示，A～D組細(xì)胞中LSD1 mRNA相對表達(dá)量分別為1.03±0.04、0.71±0.16、0.35±0.04、0.02±0.01，隨著I3C濃度的增高，SH-SY5Y細(xì)胞中LSD1 mRNA的相對表達(dá)量逐漸下降(F=27.67,P<0.05)，各組間比較差異均有顯著性(t=1.95～27.93,P<0.05)。

2.4 各組細(xì)胞中LSD1及H3K4me1、H3K4me2蛋白相對表達(dá)量的影響

Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，A～D組LSD1蛋白相對表達(dá)量隨著I3C濃度的增高明顯下降(F=522.41,P<0.05)，各組間比較差異均有顯著性(t=4.16～56.28,P<0.05)。H3K4me1以及H3K4me2蛋白的相對表達(dá)量則隨著I3C濃度的增高明顯升高(F=36.53、54.60，P<0.05)。見表2。

表2 各組細(xì)胞中LSD1、H3K4me1、H3K4me2蛋白的相對表達(dá)量比較

3 討 論

目前，隨著腫瘤病理學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、腫瘤基因?qū)W等研究的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)作用于特定靶點(diǎn)的高效、低毒、特異性強(qiáng)的新型抗腫瘤藥物己成為當(dāng)今抗腫瘤藥物研究的重要方向。近年來，靶向作用腫瘤細(xì)胞而對正常細(xì)胞損傷較輕的天然小分子化合物類藥物成為研究熱點(diǎn)，尤其如長春堿、長春新堿等毒副作用較低的天然吲哚化合物在抗腫瘤中的應(yīng)用，日漸引起關(guān)注，已成為了抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)[17]。I3C作為天然吲哚類化合物之一，是近年來研究較多的天然抗腫瘤活性小分子化合物。I3C可以通過多種直接或間接的方式與雌激素受體(ER)、芳烴羥化酶受體(AhR)、轉(zhuǎn)錄因子Sp1結(jié)合，調(diào)節(jié)與DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡及周期調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)[18]。目前臨床上I3C對于復(fù)發(fā)性呼吸器多發(fā)乳頭瘤的治療尚未發(fā)現(xiàn)即時或遠(yuǎn)期的毒副作用，證明其安全性是較高的。

NB一般體積較大、惡性程度高、生長迅速、轉(zhuǎn)移性高，常在發(fā)病較短時間內(nèi)沖破包膜，侵及周圍組織，或經(jīng)血液及淋巴轉(zhuǎn)移[19]。因此，針對NB增殖能力強(qiáng)、易轉(zhuǎn)移的特質(zhì)，本研究將梯度濃度的I3C作用于NB細(xì)胞系SH-SY5Y，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示I3C作用于SH-SY5Y細(xì)胞48 h后，細(xì)胞的活力及遷移能力明顯下降。大量研究證實(shí)，LSD1功能障礙能抑制急性淋巴白血病[20]、肺腺癌[21]、乳腺癌[22]等細(xì)胞的增殖。因此LSD1可作為較理想的篩選抗腫瘤藥物的關(guān)鍵靶點(diǎn)[23]。為探討I3C是否通過調(diào)節(jié)LSD1對NB細(xì)胞增殖與遷移發(fā)揮作用，本研究RT-qPCR技術(shù)以及Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，I3C能夠顯著地降低NB細(xì)胞中LSD1 mRNA和蛋白的相對表達(dá)量。另外，H3K4me1、H3K4me2作為基因轉(zhuǎn)錄激活的標(biāo)志物是LSD1的主要底物。LSD1可與CoREST復(fù)合物結(jié)合后，進(jìn)而脫去靶基因啟動子處H3K4me1、H3K4me2甲基化修飾，從而將染色質(zhì)改變?yōu)橐种菩誀顟B(tài)，最終抑制該基因的表達(dá)[24]。本研究通過Western Blot實(shí)驗(yàn)得出I3C作用于SH-SY5Y細(xì)胞后H3K4me1、H3K4me2蛋白的相對表達(dá)量增高，提示I3C對NB增殖與遷移的作用可能是通過調(diào)節(jié)LSD1實(shí)現(xiàn)的，為LSD1抑制劑的研究拓展了思路。

總之，本研究結(jié)果顯示，I3C可能具有抑制SH-SY5Y細(xì)胞增殖與遷移的能力，I3C可能通過調(diào)節(jié)LSD1的表達(dá)對NB細(xì)胞的增殖與遷移產(chǎn)生影響。