劉盼盼，鄭鵬程，龔自明,*，常澤睿,3，蘇方俊，黃 波，馮 琳，高士偉，鄭 琳

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學院果樹茶葉研究所，湖北省茶葉工程技術研究中心，湖北 武漢 430064；2.湖南農(nóng)業(yè)大學 茶學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128；3.華中農(nóng)業(yè)大學園藝林學學院，湖北 武漢 430070；4.湖北金果茶業(yè)股份有限公司，湖北 恩施 444333）

橘紅茶是由柑橘皮與紅茶經(jīng)過采摘、洗果、切帽、取肉、干燥、入茶、烘焙等一系列特殊工藝加工而成，成品呈圓形、橘黃鮮亮、香氣馥郁，融合了柑橘殼的果香味和紅茶甜香味，故其滋味獨特，茶性溫和甘醇，老少皆宜，具有疏肝潤肺、止咳降糖[1-2]、抑菌、抗氧化和抗腫瘤[3-4]、減肥降脂[5-6]等功效，深受消費者喜愛。

香氣是茶葉重要品質(zhì)因子，同時也是消費者追求茶葉消費的重要導向之一。目前，關于柑普茶特征及化學成分的研究已經(jīng)取得了重要進展，多種特征性風味物質(zhì)及功能成分被認知，如柑普茶揮發(fā)性成分以烯烴類成分為主，非揮發(fā)性成分主要有橙皮苷、兒茶素等[7-8]，這對客觀評價柑普茶的品質(zhì)、指導其加工過程調(diào)控有著積極意義。而對于柑橘與紅茶結合后形成的橘紅茶風味變化的研究較少，有待深入。不同柑橘原料制作的橘紅茶風味特征不同，只有明確橘紅茶產(chǎn)品的風味特征，才能更好地完善產(chǎn)品質(zhì)量，從而獲得消費者的認可和喜愛。據(jù)此，本研究擬選取宜紅茶、南豐蜜橘、砂糖橘為研究對象，采用定量描述分析，頂空固相微萃取技術并結合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）和氣相色譜-質(zhì)譜-嗅聞（gas chromatography-mass spectrometry-olfactometry，GCMS-O）等現(xiàn)代技術分析不同橘紅茶的香氣特征及揮發(fā)性風味成分，結合相關性分析、正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）等多元統(tǒng)計分析手段，明確其特征香氣成分，比較分析橘紅茶與其原料間的成分差異，旨在為橘紅茶的品質(zhì)判定及加工過程品質(zhì)調(diào)控提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品信息見表1，宜紅茶、南豐蜜橘殼、砂糖橘殼、橘紅茶A和橘紅茶B等一系列樣品均按照表1中的工藝方法加工而成，每個樣品重復3 次，原料由湖北金果茶業(yè)股份有限公司提供，供試樣于4 ℃冷藏保存。

癸酸乙酯、正構烷烴（C6～C30）等（均為色譜純，純度＞98.0%） Sigma-Aldrich（上海）公司。

表1 樣品信息Table 1 Information about tea samples tested in this study

1.2 儀器與設備

7890A氣相色譜儀、5975C質(zhì)譜儀 美國Agilent公司；ODP3聞香儀 德國Gerstel公司；手動固相微萃取進樣器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭美國Supeclo公司；HHS型恒溫水浴鍋 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

1.3 方法

1.3.1 感官評價方法

樣品按照1∶50茶水比沖泡，評價小組由5 位經(jīng)過感官培訓的專業(yè)人員組成，對橘紅茶及其原料的香氣屬性以及香氣強度進行評分（表2），采用10分制[9]（0～2 分微強，2～4 分較強，4～6 分強，6～8 分很強，8～10 分極強）。具體感官術語及標準品參照見表2。

表2 橘紅茶感官術語及其定義Table 2 Sensory terms of Juhong tea and their definitions

1.3.2 頂空固相微萃取法[10]

根據(jù)GB/T 8303—2013《茶 磨碎試樣的制備及其干物質(zhì)含量測定》中的試樣制備法，取出茶樣混勻，磨碎，作為待測試樣。橘殼的磨碎方法參照茶樣，先混勻后，用磨碎機磨碎，作為待測試樣。稱取1 g樣品放入萃取瓶中，加入30 mL沸水，然后將裝有50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭（實驗前在250 ℃老化15 min）的固相微萃取手持器通過瓶蓋的橡皮墊插入到萃取瓶中，在60 ℃水浴中平衡10 min，推出纖維頭，吸附50 min后，取出并立即插入氣相色譜儀的進樣口中，解吸附3 min，同時啟動儀器收集數(shù)據(jù)。

1.3.3 橘紅茶及其原料揮發(fā)性成分的GC-MS分析

GC條件：安捷倫HB-5MS（30 m×0.32 mm，0.25 μm）彈性石英毛細管柱。進樣口溫度240 ℃，電子捕獲檢測器溫度250 ℃；載氣為高純氦氣；流速1.8 mL/min。柱溫程序：50 ℃保持5 min，以3 ℃/min升至180 ℃保持2 min，然后以10 ℃/min升至250 ℃保持3 min；實驗中盡量將峰分開，保證峰形的對稱完整，然后通過質(zhì)譜進行定性分析。

MS條件：電子電離能量為70 eV；質(zhì)量掃描范圍為50～600 u；離子源溫度為230 ℃；四極桿溫度為150 ℃；質(zhì)譜傳輸線溫度為280 ℃。

物質(zhì)鑒定：利用NIST11.L譜庫對得到的質(zhì)譜圖進行檢索和人工解析。査對有關質(zhì)譜資料，對基峰、質(zhì)荷比和相對峰度等方面進行分析，結合保留時間和質(zhì)譜分別對各峰加以確認。采用內(nèi)標癸酸乙酯定量香氣成分，計算如式（1）所示：

1.3.4 橘紅茶及其原料揮發(fā)性成分的GC-MS-O分析

氣相色譜-質(zhì)譜條件同1.3.3節(jié)。

嗅聞條件：嗅聞系統(tǒng)傳輸線溫度220 ℃，嗅聞口溫度200 ℃，加濕器流速12 mL/min。流出成分在毛細管末端以1∶1的分流比流入聞香器。載氣為氮氣，流速為1 mL/min。

挑選3 名經(jīng)過專業(yè)聞香培訓的品評人員進行聞香分析。應用時間強度法，記錄香氣出現(xiàn)時間、香氣特征和香氣強度（aroma intensity，AI），AI以0～5六個級別表述，“0”表示未聞到，“3”表示AI中等，“5”表示AI非常強。每人對每個組分聞香2 次，每個化合物的AI為6 次聞香結果的平均值。

1.3.5 橘紅茶揮發(fā)性成分的OAV計算

OAV為某化合物質(zhì)量濃度與該物質(zhì)嗅覺閾值的比值，按式（2）計算：

式中：Ci為某個化合物的質(zhì)量濃度/（μg/L）；Ti為該物質(zhì)的氣味閾值/（μg/L）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0軟件、Simca-P 13.0進行方差分析、相關性分析及OPLS-DA。

2 結果與分析

2.1 紅茶及其原料香氣風味輪廓分析

由圖1可以看出，宜紅茶、南豐蜜橘殼、砂糖橘殼和兩個橘紅茶樣品在各個感官屬性上的強度值及其風味存在差異。宜紅茶的甜香顯著高于南豐蜜橘殼和砂糖橘殼，而果香與青香則顯著低于2 個柑橘殼。橘紅茶的果香最突出，強度接近其柑橘殼，其次為甜香，而青香強度最弱。宜紅茶與柑橘殼經(jīng)過加工后的橘紅茶風味強度介于兩者之間，融合了柑橘殼的果香味和紅茶甜香味，香氣更加馥郁。

圖1 橘紅茶香氣感官雷達圖Fig. 1 Aroma profiles of of Juhong tea

2.2 橘紅茶及其原料主要揮發(fā)性風味成分分析

圖2 宜紅茶（a）、南豐蜜橘殼（b）、砂糖橘殼（c）、橘紅茶A（d）與橘紅茶B（e）揮發(fā)性成分GC-MS總離子流圖Fig. 2 Total ion current chromatograms of volatile components in Yihong black tea (a), Nanfeng mandarin peel (b), Shatangju mandarin peel (c), Juhong tea A (d) and Juhong tea B (e)

GC-MS分析橘紅茶及其原料樣品揮發(fā)性成分的總離子色譜圖見圖2，宜紅茶、柑橘殼及橘紅茶的揮發(fā)性組分見表3。5 個樣品中共檢測到92 個揮發(fā)性化合物，香氣總量為343.48～10 175.40 μg/L，其中質(zhì)量濃度較高的成分有檸檬烯（30.45～4 248.52 μg/L）、芳樟醇（14.30～1 409.96 μg/L）、百里香酚（0～782.22 μg/L）和α-法尼烯（4.11～339.68 μg/L）。這些化合物主要是萜烯類物質(zhì)，研究表明，萜烯類化合物是由前體物質(zhì)異戊二烯基焦磷酸和3,3-二甲基烯丙基焦磷酸在相關酶的作用下合成的[11]，且大都帶有濃郁的甜香、花香和木香，是各類茶的主要揮發(fā)性成分[12]，也是構成橘紅茶甜香與果香重要的物質(zhì)基礎。紅茶與柑橘皮共有成分有8 個，包括檸檬烯、α-法尼烯、芳樟醇等，可見香氣物質(zhì)基礎的差異形成了不同的風味特征。

表3 橘紅茶及其原料揮發(fā)性風味成分的GC-MS-O分析Table 3 Analysis of volatile components of Juhong tea and its raw materials by GC-MS-O

續(xù)表3

圖3 橘紅茶及其原料揮發(fā)性物質(zhì)種類及相對含量Fig. 3 Types and contents of volatile components in Juhong tea samples

橘紅茶樣品揮發(fā)性化合物包括醛類23 種，醇類23 種，烯類20 種，酮類9 種，酯類9 種和其他類8 種（圖3）。其中烯類物質(zhì)含量最高，平均含量為70.67%，烯類化合物中含量較多檸檬烯、γ-萜品烯、α-法尼烯、月桂烯和β-蒎烯等，與很多研究結果相似，柑橘屬的橙子、檸檬、柚子等的揮發(fā)性成分也以萜烯類為主[13-14]，另外檸檬烯組分占砂糖橘殼香氣總量的87.60%，遠高于在南豐蜜橘殼中的比例（53.05%），這是砂糖橘殼果香風味高于南豐蜜橘殼的重要因素；其次為醇類化合物，平均含量為16.39%，醇類化合物中含量較多有芳樟醇、α-萜品醇、香葉醇和萜烯醇等，與其他研究相近，醇類是紅茶香氣中的主要物質(zhì)[15-16]；再次為醛類物質(zhì)，平均含量為4.72%，醛類化合物中含量較多有辛醛、癸醛和(E,E)-2,4-癸二烯醛等；接著為酯類物質(zhì)，平均含量為3.58%，酯類化合物中含量較多有水楊酸甲酯、乙酸香葉醇酯和乙酸橙花醇酯等；而酮類及其他類物質(zhì)含量較低。

由表3可知，橘紅茶及其原料樣品經(jīng)過GC-MS-O分析，共檢測到20 種香氣活性物質(zhì)，其中4 種香氣成分（AI≥2.0）對橘紅茶的風味有較大貢獻，分別為檸檬烯（柑橘香）、β-紫羅酮（花香）、月桂烯（檸檬、木香、花香）和芳樟醇（花香）。檸檬烯具有檸檬、柑橘的味道，賦予橘紅茶清新的果香和誘人的柑橘香[17]；β-紫羅酮具有紫羅蘭香氣，花香濃郁，對橘紅茶香氣影響較大[18]；月桂烯具有檸檬、木香等風味；芳樟醇具有溫和、甜的花香。這些香氣活性成分為橘紅茶果香和花香悠長的重要物質(zhì)基礎。

2.3 橘紅茶及其原料主要揮發(fā)性物質(zhì)的OAV分析

OAV能確切地評價單一香氣組分對整體香氣的貢獻度。一般認為OAV≥1的化合物為呈香的關鍵化合物[23]。本研究參照相關文獻中部分化合物在水中的閾值計算出各化合物的OAV，從表4可以看出，以OAV≥1為標準從橘紅茶及其原料中篩選出了11 種關鍵香氣物質(zhì)，其中β-紫羅酮、檸檬烯、β-大馬烯酮、(E,E)-2,4-癸二烯醛、辛醛、芳樟醇和癸醛在橘紅茶及其原料中的OAV均值達到10以上，對花香、果香及甜香等風味特征的構成有重要貢獻。

表4 橘紅茶主要揮發(fā)性成分的閾值及OAV分析Table 4 Odor thresholds and OAV of important volatile compounds in Juhong tea samples

由表4可知，香氣活性成分以醛類物質(zhì)最為主要，占其中55%?，F(xiàn)有研究表明，脂肪族醛類（(E,E)-2,4-癸二烯醛、辛醛、癸醛、月桂醛、(E)-2-癸烯醛和(E)-2-壬烯醛）的沸點低、閾值較小，具有脂肪味、果香、皂香等風味，對橘紅茶果香的貢獻較大。β-紫羅蘭酮閾值極低，可能是橘紅茶中花香馥郁的特征物質(zhì)。β-大馬烯酮僅存在于紅茶原料中，在柑橘皮中未檢出，其閾值與β-紫羅蘭酮相近[24]，呈現(xiàn)甜香，可能是橘紅茶中甜香的特征物質(zhì)。這些酮類化合物可能來源于類胡蘿卜素的氧化和縮合反應及β-胡蘿卜素的氧化分解反應[25]。檸檬烯在柑橘皮中含量非常高，閾值相對較低，是橘紅茶果香風味的重要組成物質(zhì)。芳樟醇在南豐蜜橘皮中含量遠高于砂糖橘和宜紅茶，可能是橘紅茶A與橘紅茶B花香強度的主要差異物質(zhì)。

2.4 影響橘紅茶及其原料香氣品質(zhì)的關鍵揮發(fā)性成分分析

基于橘紅茶香氣分屬性的感官評分（圖1）與揮發(fā)性成分含量水平（表3），采用SPSS軟件進行了相關性分析，進一步得到了影響橘紅茶香氣品質(zhì)的關鍵香氣成分（表5）。其中月桂烯和香茅醛與果香呈極顯著正相關（P＜0.01），苯乙醛和苯乙醇與甜香呈極顯著正相關（P＜0.01），芳樟醇、百里香酚、乙酸香葉醇酯、β-欖香烯、β-紫羅酮和α-法尼烯與花香呈極顯著正相關（P＜0.01），香茅醛與青香呈極顯著正相關（P＜0.01），月桂烯、香茅醛和月桂醛與木香呈極顯著正相關（P＜0.01）。月桂烯、香茅醛和月桂醛都與果香、木香相關性較高，研究發(fā)現(xiàn)這些成分均呈現(xiàn)出果香（檸檬）、松木香等風味。苯乙醛和苯乙醇屬于芳香族物質(zhì)，均具有明顯甜香、花香特征[26]。百里香酚呈現(xiàn)百里香味[27]，乙酸香葉醇酯具有玫瑰花香[28]，β-欖香烯具藥草香[29]，β-紫羅酮具有紫羅蘭花香[20]，這些成分所呈現(xiàn)的特殊花香共同形成了橘紅茶濃郁的花香風味。

表5 橘紅茶及其原料香氣得分與關鍵成分含量相關性分析Table 5 Analysis of correlation between aroma score and concentrations of key components

2.5 橘紅茶與柑橘殼及宜紅茶原料揮發(fā)性成分的差異分析

為比較橘紅茶與柑橘殼及宜紅茶原料揮發(fā)性成分的差異，對所有樣品的揮發(fā)性成分進行多元統(tǒng)計分析，基于各樣品間揮發(fā)性成分的檢測結果建立了OPLS-DA模型，對于潛在的差異揮發(fā)性成分，使用變量投影重要性因子（variable importance in projection，VIP）值大于1的進行不同樣品差異揮發(fā)性成分篩選。由圖4可知，宜紅茶與柑橘殼、橘紅茶與宜紅茶、橘紅茶與柑橘殼的差異分析表明VIP高于1且標準誤差低于0.5的化合物分別有18、20 種和9 種。宜紅茶與柑橘殼的標志差異性揮發(fā)性成分為橙花醇、(E)-氧化芳樟醇、3,7-二甲基-2,6-二辛烯醛、苯乙醇等，其中橙花醇、(E)-氧化芳樟醇等10 種成分為宜紅茶特有，香茅醛、β-香茅醇等5 個成分為柑橘殼特有，而月桂烯、檸檬烯和(E)-β-羅勒烯為共有成分；橘紅茶與宜紅茶的標志差異性揮發(fā)性成分為(E)-氧化芳樟醇、3,7-二甲基-2,6-二辛烯醛、香芹酮、水楊酸甲酯等，其中(E)-氧化芳樟醇、3,7-二甲基-2,6-二辛烯醛、苯乙醛和(Z)-氧化芳樟醇僅存在于宜紅茶中，可能是在加工過程中損失而在橘紅茶中未檢出，香芹酮、乙酸香茅酯等10 個成分為橘紅茶特有，水楊酸甲酯、香葉醇等6 個為共性成分；橘紅茶與柑橘殼的標志差異性揮發(fā)性成分為壬醇、α-古巴烯、β-蒎烯等，其中α-古巴烯、β-蒎烯和α-摩勒烯是柑橘殼中特有，可能是在加工過程中損失而在橘紅茶中未檢出，其他6 個均為共性成分。從差異成分可以看出，柑橘殼中特有的成分主要是萜烯類，包括萜烯醛和萜烯酯類，研究表明萜烯醛類是相應的醇在乙醇脫氫酶作用下產(chǎn)生，而萜烯酯類在乙酰輔酶A、乙醇乙酰轉(zhuǎn)移酶的作用下產(chǎn)生[30-31]。

圖4 橘紅茶與宜紅茶及柑橘殼的香氣差異成分的VIP值Fig. 4 VIP values of volatile components differed between Juhong tea,Yihong black tea and citrus peel samples

3 結 論

橘紅茶與宜紅茶及柑橘殼樣品共定性出92 種揮發(fā)性風味化合物，其中萜烯類物質(zhì)的含量較高。烯類和醇類是橘紅茶中主要的揮發(fā)性化合物，可能對橘紅茶的香氣品質(zhì)形成起著關鍵的作用。通過GC-MS-O共嗅聞出氣味活性化合物20 種，其中4 種揮發(fā)性成分（AI≥2.0）對橘紅茶的風味有較大貢獻，分別為檸檬烯（柑橘香）、β-紫羅酮（花香）、月桂烯（檸檬、木香、花香）和芳樟醇（花香）。從OAV結果看，橘紅茶系列樣品中有11 種化合物OAV不低于1，其中β-紫羅酮、檸檬烯、β-大馬烯酮、(E,E)-2,4-癸二烯醛、辛醛、芳樟醇和癸醛在橘紅茶及其原料中的OAV均值達到10以上，對花香、果香及甜香等風味特征的構成有重要貢獻。綜合OAV及AI值，檸檬烯、β-紫羅酮、芳樟醇、癸醛、β-大馬烯酮、(E,E)-2,4-癸二烯醛和辛醛可能是橘紅茶中重要的揮發(fā)性化合物。相關性分析結果表明，月桂烯、苯乙醛、芳樟醇等11 個揮發(fā)性成分對果香、花香、甜香、青香和木香風味屬性的表征有較大貢獻。OPLS分析表明，宜紅茶與柑橘殼的標志差異性揮發(fā)性成分為橙花醇、(E)-氧化芳樟醇、3,7-二甲基-2,6-二辛烯醛、苯乙醇等18 種，橘紅茶與宜紅茶的標志差異性揮發(fā)性成分為(E)-氧化芳樟醇、3,7-二甲基-2,6-二辛烯醛、香芹酮、水楊酸甲酯等20 種，橘紅茶與柑橘殼的標志差異性揮發(fā)性成分為壬醇、α-古巴烯、β-蒎烯等9 種。本研究對湖北省橘紅茶及其原料的香氣特征及關鍵呈香成分進行分析，后續(xù)研究中針對鑒定出的關鍵呈香成分，需進行系統(tǒng)的香氣重組、缺失實驗進一步驗證關鍵呈香成分的致香效果。同時橘紅茶關鍵呈香成分在加工過程中的變化也尚不明晰，有必要進一步明確橘紅茶特征香氣的形成機制，為提高橘紅茶產(chǎn)品質(zhì)量提供依據(jù)。