徐正華，吳家麗，朱克衛(wèi)，梁玉燊，楊雪嬌，趙 勇，凌 菁，鄭思珩，周衡剛，張 昆，朱玉珍，曾茂茂,*

（1.黃埔海關(guān)技術(shù)中心，廣東 廣州 510770；2.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；3.廣州海關(guān)技術(shù)中心，廣東 廣州 510000）

晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）是由還原糖和蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多肽、氨基酸的末端游離氨基等通過(guò)美拉德反應(yīng)生成的一系列共價(jià)加成物總稱[1-2]。研究表明，AGEs可以通過(guò)食物攝入，其在人體內(nèi)的積累與糖尿病及其肝病、腎病、心臟病等并發(fā)癥以及動(dòng)脈粥樣硬化、阿爾茨海默癥、骨性關(guān)節(jié)炎、視網(wǎng)膜病變、白內(nèi)障、尿毒癥等有著密切關(guān)系[3-5]。因此，AGEs在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)上引起了廣泛的關(guān)注，但國(guó)內(nèi)外對(duì)食品中AGEs的研究相對(duì)較少，相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)與規(guī)范尚處于空白狀態(tài)，不同食品中的安全限量也尚未明確。目前有20多種AGEs被鑒定[6]，包括羧甲基賴氨酸（N-carboxymethyllysine，CML）、羧乙基賴氨酸（N-carboxyethyllysine，CEL）、戊糖苷素、吡咯素、丙酮醛-賴氨酸二聚體與乙二醛-賴氨酸二聚體等，其中，CML和CEL是最具代表性的AGEs，可以作為食品體系中美拉德反應(yīng)程度的指標(biāo)[7]。因此，食品領(lǐng)域相關(guān)研究主要圍繞這2 種AGEs開(kāi)展[8-9]。

三文魚(yú)被譽(yù)為“魚(yú)中至尊”，含有豐富的蛋白質(zhì)、8 種人類必需氨基酸、ω-3高不飽和脂肪酸、礦物質(zhì)及微量元素，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[10-11]。目前查到與三文魚(yú)中AGEs有關(guān)的文獻(xiàn)有4 篇，但這些研究都只集中在CML，并且得出的結(jié)果缺乏一致性。Charissou等[12]報(bào)道在三文魚(yú)中未檢出CML；Chao Peichun等[13]在鮮三文魚(yú)中檢出CML，含量為100 ng/g；Uribarri等[14]使用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)到冷凍三文魚(yú)中CML含量為517 kU/100 g，新鮮三文魚(yú)中CML含量為527 kU/100 g，但是酶聯(lián)免疫法得出的是樣品中CML相對(duì)值，不是絕對(duì)值，與儀器法得出的絕對(duì)含量無(wú)法進(jìn)行比較；Chen Gengjun等[15]檢測(cè)鮮三文魚(yú)中CML含量為1 920 ng/g樣品，烤三文魚(yú)中CML高達(dá)10 780 ng/g樣品，與之前報(bào)道的含量有顯著性差異，在其他食品中CML含量與變化規(guī)律方面與Chao Peichun等[13]研究也存在一定出入。

本實(shí)驗(yàn)以源自3 個(gè)國(guó)家的21 條三文魚(yú)為實(shí)驗(yàn)樣品，經(jīng)過(guò)脫脂、還原、蛋白質(zhì)水解、固相萃取凈化等步驟后，采用同位素內(nèi)標(biāo)稀釋超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法測(cè)定其CML和CEL含量。對(duì)所獲數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以期更加全面地反映三文魚(yú)中AGEs整體含量，為不同研究小組報(bào)道的三文魚(yú)中CML含量存在顯著性差異的原因提供可能的解釋。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定三文魚(yú)中CEL含量，并提出CEL有望成為鑒別挪威三文魚(yú)與智利、法羅群島三文魚(yú)的產(chǎn)地特征因子，研究成果為三文魚(yú)的產(chǎn)地溯源及真?zhèn)舞b別提供新思路，為后續(xù)更深入的研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

21 份冰鮮三文魚(yú)（品種均為大西洋鮭）樣品分別來(lái)自3 個(gè)主要進(jìn)口國(guó)挪威（n=7）、智利（n=7）和丹麥法羅群島（n=7），均在廣州白云機(jī)場(chǎng)口岸空運(yùn)進(jìn)境，由原出入境檢驗(yàn)檢疫局監(jiān)管科抽樣送入實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)，冰鮮三文魚(yú)去皮后將魚(yú)身肉（包含魚(yú)頭肉）取下混勻待測(cè)。

CML標(biāo)準(zhǔn)品、CEL標(biāo)準(zhǔn)品、D4-CML同位素內(nèi)標(biāo)、D4-CEL同位素內(nèi)標(biāo)（純度均大于98%） 美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司；甲醇、乙腈和正己烷（均為色譜級(jí)） 美國(guó)Fisher Scientific公司；硼酸、硼氫化鈉、濃鹽酸、濃硫酸、氫氧化鈉、正辛醇（均為分析純）上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Oasis MCX固相萃取柱（60 mg，3 mL，60 μm）、ACQUITY UPLC TQD UPLC-MS/MS聯(lián)用儀 美國(guó)Waters公司；AX205型十萬(wàn)分之一電子天平 瑞士梅特勒-托利多公司；QGC-12T型氮?dú)獯蹈蓛x 上海泉島科貿(mào)公司；Fotector-04HT型固相萃取儀 美國(guó)?？乒?。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

脫脂：稱取約2 g三文魚(yú)樣品，加入3 mL正己烷，劇烈振蕩混勻后10 000 r/min離心15 min，移去上清液，重復(fù)該步驟3 次以徹底脫脂。將脫脂后的樣品放置于通風(fēng)櫥中自然揮干正己烷殘留[16]。

樣品還原：向揮干后的樣品中加入0.2 mol/L硼酸鹽緩沖液（pH 9.2）1.5 mL，硼氫化鈉（1 mol/L，溶于0.01 mol/L氫氧化鈉溶液）溶液[17]1 mL，加入3 滴左右的正辛醇消泡[18]，于4 ℃過(guò)夜充分還原。

酸水解：向還原后的樣品液加入濃鹽酸2.5 mL，真空密封后置于烘箱中110 ℃水解24 h[19]。水解完過(guò)濾，并定容至10 mL。準(zhǔn)確吸取水解液600 μL，于60 ℃氮?dú)獯蹈桑偌尤?50 μL內(nèi)標(biāo)溶液[20]（1.0 μg/mL的D4-CML與D4-CEL混標(biāo)）。

凈化：將吹干后的樣品用2 mL超純水復(fù)溶后過(guò)固相萃取柱凈化[21]。將該柱先使用3 mL甲醇、3 mL 0.1 mol/L的HCl溶液進(jìn)行活化平衡，再將所有復(fù)溶后的樣液上樣，而后使用3 mL 0.1 mol/L的HCl溶液和3 mL甲醇依次進(jìn)行淋洗，再用6 mL甲醇氨混合溶液（甲醇-氨水，95∶5，V/V）洗脫，活化和淋洗流速小于2 mL/min，上樣和洗脫流速小于0.5 mL/min。最后洗脫液用氮?dú)獯蹈?，并使?00 μL水復(fù)溶、0.22 μm針式過(guò)濾器過(guò)濾后得到CML和CEL待測(cè)液，取5 μL進(jìn)樣分析。

1.3.2 儀器條件

UPLC條件：色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3柱（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）；柱溫45 ℃；流動(dòng)相A為100%乙腈，B為0.1%甲酸[22]；梯度洗脫程序：0～0.1 min，1% A，99% B；0.1～5 min，1%～8% A，99%～92% B；5～5.5 min，8%～100% A，92%～0% B；5.5～6.5 min，100% A，0% B；6.5～7 min，100%～1% A，0%～99% B；流速0.2 mL/min。

MS條件：電噴霧離子源正離子采集方式；離子源溫度110 ℃；脫溶劑氣溫度400 ℃，流速600 L/h，毛細(xì)管電壓3.55 kV，氬氣碰撞器流量0.15 mL/min，氦氣錐孔氣流量50 L/h，錐孔電壓20 V。

目標(biāo)物CML母離子m/z205，子離子m/z84和m/z130，錐孔電壓20 V，碰撞能量14 eV，駐留時(shí)間20 ms。目標(biāo)物CEL母離子m/z219，子離子m/z88和m/z130，錐孔電壓20 V，碰撞能量16 eV，駐留時(shí)間20 ms；內(nèi)標(biāo)D4-CML母離子為m/z209，子離子為m/z88和m/z134，錐孔電壓20 V，碰撞能量15 eV，駐留時(shí)間20 ms；內(nèi)標(biāo)D4-CEL母離子為m/z223，子離子為m/z88和m/z134，錐孔電壓20 V，碰撞能量13 eV，駐留時(shí)間為20 ms。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2007軟件進(jìn)行樣品中CML含量和CEL含量統(tǒng)計(jì)及差異比較分析，采用IBM SPSS Statistics 19.0分析軟件對(duì)樣品中CML含量和CEL含量進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 三文魚(yú)樣品中CML和CEL的UPLC-MS/MS分析

m/z205/84和m/z209/88離子對(duì)分別用于CML和D4-CML定量，m/z219/84和m/z223/84離子對(duì)分別用于CEL和D4-CEL的定性[23]，標(biāo)準(zhǔn)品及同位素內(nèi)標(biāo)在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下都能得到良好的鑒定，見(jiàn)圖1。

圖1 CML、D4-CML、CEL和D4-CEL的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式色譜圖Fig. 1 Chromatograms of CML, D4-CML, CEL and D4-CEL in MRM mode

2.2 方法學(xué)考察結(jié)果

2.2.1 線性范圍、檢出限及定量限結(jié)果

將CML、D4-CML、CEL及D4-CEL分別配成20 mg/mL儲(chǔ)備液，再稀釋配制成標(biāo)準(zhǔn)工作液。以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），以目標(biāo)物峰面積與對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)物的峰面積的比值為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。不斷稀釋CML與CEL的質(zhì)量濃度，當(dāng)目標(biāo)峰信噪比為3時(shí)得到目標(biāo)物檢出限，當(dāng)目標(biāo)峰信噪比為10時(shí)得到目標(biāo)物定量限。如表1所示，該法完全能滿足三文魚(yú)中CML和CEL的定量分析需求。

表1 UPLC-MS/MS方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 1 Standard curves, linear ranges, correlation coefficients (r2),LOQs and LODs of the UPLC-MS/MS method

2.2.2 回收率及精密度結(jié)果

根據(jù)不加標(biāo)三文魚(yú)樣品中CML和CEL含量分布，CML選取200、400、1 500 ng/g，CEL選取50、200、1 200 ng/g作為加標(biāo)量進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)添加水平重復(fù)測(cè)定6 次，見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，3 個(gè)添加水平下的三文魚(yú)中CML和CEL平均回收率在90%～95%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%，說(shuō)明本法檢測(cè)三文魚(yú)中CML和CEL的準(zhǔn)確度和精密度良好。

表2 三文魚(yú)中回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Recoveries and RSDs of CML and CEL in spiked salmon

2.2.3 三文魚(yú)樣品含量測(cè)定結(jié)果

從表3得知，在產(chǎn)自3 個(gè)不同國(guó)家的21 份三文魚(yú)樣品中均檢出CML和CEL，只是在含量上有所差異。這與Charissou等[12]在三文魚(yú)中未檢出CML的報(bào)道矛盾，這可能與其使用的衍生前處理步驟及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀器有關(guān)。而與Chao Peichun等[13]檢出CML含量為100 ng/g，Chen Gengjun等[15]檢出CML含量為1 920 ng/g，在檢出含量上有比較大的差異，這可能與研究重點(diǎn)、樣本數(shù)量、三文魚(yú)產(chǎn)地及品種等有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)樣品數(shù)量大，產(chǎn)地及品種明確，樣品處理過(guò)程可控，可真實(shí)反映三文魚(yú)中CML含量分布。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定三文魚(yú)中CEL含量高達(dá)1 002.02 ng/g，低至37.92 ng/g，含量相差顯著，這說(shuō)明對(duì)CEL進(jìn)行定量很有必要，一是可以更加全面了解AGEs整體在三文魚(yú)中的含量，二是可以為后續(xù)更深入的研究提供理論依據(jù)。

表3 不同產(chǎn)地三文魚(yú)中CML和CEL含量（n=3）Table 3 Contents of CML and CEL in salmon samples from different geographical origin (n= 3)

2.2.4 數(shù)據(jù)分析

圖2 21 份三文魚(yú)樣品CML與CEL含量分布（A）和PCA（B）圖Fig. 2 Distribution of CML and CEL contents (A) and PCA (B) plot for 21 salmon samples

為更直觀分析不同國(guó)家三文魚(yú)中AGEs含量特點(diǎn)及規(guī)律，分別以CML含量和CEL含量為x軸和y軸繪制坐標(biāo)圖，同時(shí)利用SPSS軟件對(duì)來(lái)自3 個(gè)國(guó)家的21 份樣品進(jìn)行PCA[24-25]，如圖2所示。以CML含量為PC1（66.6%），CEL含量為PC2（33.4%），無(wú)論是坐標(biāo)圖還是PCA法得分投影圖，趨勢(shì)大體一致。

全球三文魚(yú)以挪威產(chǎn)量大，知名度高[26-27]，因此國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上常出現(xiàn)以其他三文魚(yú)冒充挪威三文魚(yú)的現(xiàn)象[28-30]。本實(shí)驗(yàn)表明，挪威三文魚(yú)CEL含量最低，且其在PC2（CEL）上能與其他2 個(gè)國(guó)家明顯分開(kāi)，這說(shuō)明PC2（CEL）可以顯示挪威三文魚(yú)的區(qū)域特征，有望作為產(chǎn)地特征因子用于鑒別挪威三文魚(yú)和智利、法羅群島三文魚(yú)。而智利和法羅群島三文魚(yú)樣本在PC1和PC2上都有不同程度的重疊，分類效果不理想，但是法羅群島的三文魚(yú)在PC1和PC2的得分分布成簇聚集，表明該國(guó)三文魚(yú)樣品間存在較好的相似性，即穩(wěn)定性較好。而智利三文魚(yú)在PC1和PC2的得分分布較分散，表明智利三文魚(yú)個(gè)體間存在較大的相異性，即差異顯著。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立穩(wěn)定可靠的UPLC-MS/MS同時(shí)檢測(cè)三文魚(yú)中CML和CEL方法，并利用該法對(duì)源自3 個(gè)不同國(guó)家的21 份三文魚(yú)樣品進(jìn)行CML和CEL含量測(cè)定。通過(guò)對(duì)所獲數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后，指出即使是相同品種的三文魚(yú)在不同國(guó)家和不同個(gè)體之間CML和CEL含量存在很大的生物差異性，為不同研究小組對(duì)三文魚(yú)中CML含量報(bào)道的結(jié)果不一致性提供了最大可能的解釋。與大多數(shù)研究食源性AGEs的報(bào)道都集中于CML不同的是，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定挪威、智利和法羅群島3 個(gè)國(guó)家三文魚(yú)（大西洋鮭）中CEL含量，并提出CEL有望作為產(chǎn)地特征因子用于挪威三文魚(yú)區(qū)別其他2 個(gè)國(guó)家三文魚(yú)的產(chǎn)地鑒別，肯定CEL的重要性，為后續(xù)研究提供理論依據(jù)。后期本研究團(tuán)隊(duì)也會(huì)考慮進(jìn)一步豐富樣品批次和產(chǎn)地?cái)?shù)量加以確證和擴(kuò)展該實(shí)驗(yàn)成果。