王素利，郭振福，庚麗麗

（河北北方學(xué)院 河北省農(nóng)產(chǎn)品食品質(zhì)量安全分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 張家口 075000）

新煙堿類殺蟲劑是一類使用廣泛的高效殺蟲劑，目前有120多個(gè)國(guó)家登記[1]。其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)在于高效、選擇性、植物內(nèi)吸性，而且成功克服許多害蟲對(duì)長(zhǎng)期使用氨基甲酸酯、有機(jī)磷、擬除蟲菊酯等殺蟲劑產(chǎn)生的抗性，因此被廣泛使用于糧食、蔬菜和水果作物以及種子處理劑。據(jù)報(bào)道，煙堿類殺蟲劑對(duì)脊椎動(dòng)物有較低急性毒性[2]。在哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，暴露于這些化合物可以誘導(dǎo)生物效應(yīng)[3]，減少蜂群[4]，吡蟲啉可延緩小鼠胚胎[5]、雞胚[6]的發(fā)育，其代謝產(chǎn)物對(duì)脊椎動(dòng)物有毒性[7]，啶蟲脒使鳥類精子密度明顯降低[8]，噻蟲啉對(duì)雞胚有致畸作用[9]，可能影響人類健康[10-12]。因此，不同國(guó)家制定了不同農(nóng)產(chǎn)品，包括蔬菜和谷物中新煙堿類殺蟲劑的最大殘留限量。

食用油營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，在日常生活中起著不可或缺的作用[13]。它能提供人體必需的脂肪酸，是脂溶性維生素的載體，能夠?yàn)槿梭w提供需要的能量，維持正常體溫等作用[14-15]。大豆、油菜、向日葵、亞麻等產(chǎn)油作物使用大量殺蟲劑，植物油通過(guò)提取加工和浸著得到，農(nóng)藥殘留仍可能發(fā)生在最終的食用油中，給人們健康帶來(lái)安全隱患。因此加強(qiáng)食用油的質(zhì)量安全控制具有重要的意義[16]。歐盟、食品法典委員會(huì)、世界衛(wèi)生組織制定了用于產(chǎn)油作物油籽中一些煙堿類的最大殘留限量為0.02～0.05 mg/kg[17]，GB 2763—2019《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中也制定了一些煙堿類在油籽中的最大殘留限量為0.02～0.5 mg/kg。

由于食用油基質(zhì)比較復(fù)雜，共提雜質(zhì)多，必須經(jīng)過(guò)凈化才能通過(guò)儀器檢測(cè)。液液萃取后經(jīng)過(guò)EMR-lipid柱凈化[18]、基質(zhì)固相分散[19]、QuEChERS[20]、分散固相萃取凈化[21]、冷凍法和分散固相凈化聯(lián)用[22]，這些方法費(fèi)時(shí)，不能一步完成。目前，前處理方法正向著簡(jiǎn)單、省時(shí)、小型化、減少有機(jī)溶劑的方向發(fā)展。分散液液微萃取是一種簡(jiǎn)單快速的液相萃取方法[23-24]。傳統(tǒng)分散液液使用的提取溶劑密度較大、難溶于水，而且大部分是一些含氯溶劑，毒性較高、容易揮發(fā)，急需綠色溶劑替代[25]。低共熔溶劑（deep eutectic solvent，DES）具有獨(dú)特優(yōu)良的性質(zhì)，同時(shí)生產(chǎn)成本低廉、合成路線簡(jiǎn)單、可生物降解、無(wú)毒環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是一種環(huán)境友好的綠色溶劑，可以作為溶劑替代分散液液微萃取技術(shù)中的傳統(tǒng)有機(jī)溶劑，在分散液相微萃取技術(shù)中具有潛在應(yīng)用前景[26-28]。DES作為萃取溶劑在分散液液微萃取技術(shù)中用于食用油中的羥丙基苯丙類、酚類、三嗪類除草劑、雙酚A、木脂素的測(cè)定[29-33]，用于煙堿類農(nóng)藥檢測(cè)鮮見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)利用氯化膽堿合成的綠色DES作為液相微萃取技術(shù)中的萃取劑，利用超聲波輔助分散，建立高效液相色譜測(cè)定食用油中4 種新煙堿類殺蟲劑的檢測(cè)方法，并且測(cè)定實(shí)際樣品中的4 種新煙堿類農(nóng)藥，以期為油樣品中提取有機(jī)污染物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙二醇、甘油、正己烷（均為分析純） 北京化學(xué)試劑公司；氯化膽堿（純度99%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈、甲醇（均為色譜純） 德國(guó)Merck公司；噻蟲嗪、吡蟲啉、啶蟲脒、噻蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品（純度均大于98%） 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260高效液相色譜系統(tǒng)（配有二極管陣列檢測(cè)器）美國(guó)安捷倫公司；TDL-50B低速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；WD-9415E型超聲波清洗器 北京市六一儀器廠；Nicolet IS5傅里葉紅外光譜儀 美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 高效液相色譜測(cè)定條件

二極管陣列檢測(cè)器；波長(zhǎng)254 nm；流速1 mL/min；Zorbax extend-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相分別為甲醇（A）和水（B）；梯度洗脫：0 min，10% A，90% B；10 min，40% A，60% B；15 min，80% A，20%B；20 min，10% A，90% B；進(jìn)樣量20 μL。

1.3.2 DES的合成

以氯化膽堿作為氫鍵受體，乙二醇、甘油、尿素為氫鍵給體，按照物質(zhì)的量比1∶2混合置于10 mL玻璃離心管中，在渦旋儀中渦旋混合直到形成均勻清澈透明的液體。即氯化膽堿-乙二醇、氯化膽堿-甘油、氯化膽堿-尿素DES。同時(shí)合成了氯化膽堿-乙二醇物質(zhì)的量比1∶1、1∶3、1∶4的DES，并且保存在避光處備用。

1.3.3 超聲輔助分散液液微萃取操作過(guò)程

分別稱取10.0 mg標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容，配制成1 000 mg/L的單標(biāo)，然后分別量取1 mL單標(biāo)于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容為100 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液，單標(biāo)和儲(chǔ)備液均在-20 ℃保存。將儲(chǔ)備液用甲醇稀釋至適當(dāng)質(zhì)量濃度作為工作液，將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋到10 mg/L作為工作液用于樣品前處理。

1 mL食用油中添加一定質(zhì)量濃度的混合煙堿類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋混合均勻，然后用2 mL正己烷稀釋，加入50 μL的氯化膽堿-乙二醇（物質(zhì)的量比1∶2）配成的DES，超聲分散5 min，形成渾濁液，3 000 r/min離心10 min，DES相沉積到試管底部，用注射器除去上層液體后，再向剩余物中加入2 mL正己烷，超聲分散5 min，3 000 r/min離心10 min，除去上層的正己烷洗滌液，殘余物用甲醇定容至1 mL，吸入內(nèi)襯管中，進(jìn)行液相色譜分析。

1.3.4 超聲輔助分散液液微萃取條件優(yōu)化

為了優(yōu)化萃取條件，在1 mL菜籽油中添加煙堿類農(nóng)藥混合標(biāo)樣，使添加質(zhì)量濃度為50 μg/L。對(duì)影響萃取效率的影響因素進(jìn)行優(yōu)化，如食用油與正己烷比例、DES的種類和體積、萃取時(shí)間、離心時(shí)間等，每次實(shí)驗(yàn)均在改變一個(gè)參數(shù)其他參數(shù)保持不變的情況下進(jìn)行，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.5 方法有效性和確證

應(yīng)用優(yōu)化的超聲輔助分散液液微萃取方法進(jìn)行線性、準(zhǔn)確度和精密度測(cè)定。分別取一定量標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備液梯度稀釋為0.01、0.05、0.1、0.02、0.5 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行線性測(cè)定。在菜籽油中添加一定量的工作液使添加質(zhì)量濃度為50 μg/L，重復(fù)5 次，進(jìn)行回收率和精密度（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD））實(shí)驗(yàn)。

從本地超市購(gòu)買的葵花籽油、大豆油、胡麻油實(shí)際樣品用超聲輔助分散液液微萃取方法測(cè)定。為考察基質(zhì)效應(yīng)對(duì)該方法的影響，分別在3 種食用油中進(jìn)行質(zhì)量濃度20、50、100 μg/L和500 μg/L的添加回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 合成DES的傅里葉變換紅外光譜表征

圖1 氯化膽堿（A）、乙二醇（B）、氯化膽堿與乙二醇（1∶2）（C）的紅外光譜圖Fig. 1 FT-IR spectra of choline chloride (A), ethylene glycol (B) and DES of choline chloride and ethylene glycol at 1:2 ratio (C)

DES的合成主要作用力是分子間形成氫鍵[27-28]，如圖1所示，純化膽堿氯、乙二醇在3 279、3 393 cm-1處的特征峰分別由O—H振動(dòng)引起。在DES中乙二醇特征峰3 393 cm-1向3 377 cm-1移動(dòng)，可能是由于氧原子上電子云向氫鍵的轉(zhuǎn)移。因此O—H振動(dòng)的移動(dòng)表明氫鍵的存在和DES的形成。

2.2 超聲輔助分散液液微萃取條件優(yōu)化

2.2.1 油與正己烷比例

考察實(shí)驗(yàn)樣品中食用油、正己烷的不同比例對(duì)分析物萃取效率的影響。按照1 mL菜籽油用正己烷1 mL或者2 mL稀釋，稀釋比例為1∶1和1∶2。圖2顯示氯化膽堿-乙二醇或氯化膽堿-甘油兩種DES萃取劑，2 mL正己烷稀釋的萃取效率均高于1 mL正己烷，表明菜籽油被2 倍體積正己烷稀釋后，萃取效果較好。

2.2.2 萃取劑DES類型的選擇

DES萃取劑的選擇對(duì)萃取效率影響非常重要[31]。以乙二醇、甘油、尿素作為氫鍵給體，氯化膽堿作為氫鍵受體，均以物質(zhì)的量比2∶1混合制備的DES對(duì)菜籽油中的煙堿類殺蟲劑萃取。如圖3A所示，其他條件相同下，乙二醇與氯化膽堿形成的DES比甘油、尿素與氯化膽堿形成的DES萃取效率高。原因可能是由于甘油和氯化膽堿形成的DES的黏度高于乙二醇，阻止了目標(biāo)分析物的傳質(zhì)作用[34]。尿素形成的DES極性比乙二醇形成的小。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出乙二醇與氯化膽堿形成的萃取劑DES萃取效率最高，是最適萃取劑。

圖3 DES種類（A）和氯化膽堿-乙二醇比例（B）對(duì)萃取效率的影響Fig. 3 Effect of DES type (A) and choline chloride to ethylene glycol ratio (B) on the extraction efficiency

然后對(duì)氯化膽堿和乙二醇不同物質(zhì)的量比形成的DES對(duì)萃取率的影響進(jìn)行研究。如圖3B所示，當(dāng)氯化膽堿-乙二醇物質(zhì)的量比1∶2時(shí)回收率最大，由于在1∶1時(shí)黏度較大，不利于分析物的傳質(zhì)，當(dāng)比例再增大，極性太強(qiáng)，對(duì)極性較弱的吡蟲啉和噻蟲啉萃取率降低，因此，選擇氯化膽堿-乙二醇物質(zhì)的量比1∶2的DES作為萃取劑，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.2.3 DES體積對(duì)萃取效率的影響

圖4 DES體積對(duì)萃取效率的影響Fig. 4 Effect of DES volume on the extraction efficiency

由上確定氯化膽堿和乙二醇1∶2的DES作為萃取劑，DES的體積對(duì)萃取效率具有一定的影響。本研究分別對(duì)25、50、75、100 μL和130 μL體積萃取效率進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。由圖4可以看出，當(dāng)DES體積大于50 μL時(shí)回收率逐漸減小，可能是體積增大稀釋所致。因此，在DES的體積為50 μL時(shí)萃取效率最高。

2.2.4 超聲萃取時(shí)間和離心時(shí)間的優(yōu)化

圖5 超聲萃取時(shí)間對(duì)萃取效率的影響Fig. 5 Effect of ultrasonication time on the extraction efficiency

如圖5所示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，萃取效率不斷上升，當(dāng)時(shí)間超過(guò)8 min，響應(yīng)值不再上升，8 min萃取效率達(dá)到最高，說(shuō)明在此時(shí)間內(nèi)已達(dá)到飽和。離心的目的是使DES相與樣品進(jìn)行有效分離，本實(shí)驗(yàn)在1～20 min內(nèi)轉(zhuǎn)速4 000 r/min條件下離心。結(jié)果表明，當(dāng)離心時(shí)間為10 min時(shí)，回收率達(dá)到最高，時(shí)間延遲后，峰面積并未明顯變化，因此，離心時(shí)間選擇為10 min。

2.3 方法有效性評(píng)價(jià)

在已優(yōu)化條件下對(duì)其線性、回收率、重復(fù)性、準(zhǔn)確度、檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）進(jìn)行測(cè)定，所有實(shí)驗(yàn)在菜籽油中進(jìn)行，如表1所示。在0.01～0.5 mg/L內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)大于0.99。添加質(zhì)量濃度為50 μg/L時(shí)，重復(fù)5 次，回收率和RSD分別為81.9%～98.0%和5.5%～8.3%，LOD和LOQ以標(biāo)準(zhǔn)曲線最小質(zhì)量濃度3 倍信噪比和10 倍信噪比計(jì)算，分別為3.2～5.3 μg/L和10.8～17.7 μg/L。

表1 4 種煙堿類殺蟲劑的線性方程、相關(guān)系數(shù)、LOD、LOQ、回收率和RSDTable 1 Linear calibration equations, correlation coefficients (R2),LODs and LOQs of four neonicotinoid insecticides

2.4 樣品測(cè)定和方法驗(yàn)證

用建立的超聲輔助分散液液微萃取方法測(cè)定市購(gòu)樣品中的4 種煙堿類農(nóng)藥，均未檢出。分別對(duì)市購(gòu)樣品進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示，回收率在83.4%～100.8%之間，RSD在2.1%～8.2%之間。 結(jié)果表明，基質(zhì)對(duì)萃取效果無(wú)顯著影響，該方法對(duì)測(cè)定實(shí)際食用油中新煙堿類殺蟲劑方法具有有效性和可行性，大豆油添加樣品色譜圖如圖6所示。

表2 4 種新煙堿類殺蟲劑應(yīng)用超聲輔助分散液液微萃取在大豆油、葵花籽油和胡麻油中的添加回收率和RSD（n=3）Table 2 Recoveries and RSDs of new neonicotinoid insecticides spiked to soybean oil, sunflower seed oil and linseed oil at different concentrations (n= 3)

圖6 大豆油空白（a）和添加4 種煙堿類殺蟲劑樣品（b）色譜圖Fig. 6 HPLC chromatograms of blank soybean oil (a) and sample spiked with four neonicotinoid insecticides (b)

2.5 超聲輔助分散液液微萃取與其他方法比較結(jié)果

表3 超聲輔助分散液液微萃取與其他方法比較Table 3 Comparison of the proposed UA-DES-LLM method with other methods for the determination of neonicotinoid insecticides

為了評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)所建立的方法超聲輔助分散液液微萃取的有效性，與其他發(fā)表的檢測(cè)油樣品中目標(biāo)分析物的方法進(jìn)行比較，結(jié)果如表3所示。目前常用于植物油樣品中煙堿類農(nóng)藥前處理方法主要是QuEChERS或者其改進(jìn)方法，通常使用固相吸附劑PSA、C18、GCB等去除脂肪和雜質(zhì)，改進(jìn)方法使用Z-Sep、EMR-Lipid等增強(qiáng)去除油脂性能[36]，為了更好地去除油脂附加冷凍技術(shù)[36]。檢測(cè)大多使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，能夠進(jìn)行多殘留檢測(cè)，由于單獨(dú)使用液相色譜LOD達(dá)不到要求[38]。本方法超聲輔助分散液液微萃取使用氯化膽堿和乙二醇合成的DES作為萃取劑，減少有毒有害有機(jī)溶劑使用。同時(shí)，DES較好的色譜行為節(jié)省了凈化過(guò)程，而且能夠用于液相色譜的檢測(cè)，方法更簡(jiǎn)單，提取時(shí)間更短，得到的檢出限與公布方法的LOD相似或者更低。因此，本方法為植物油中煙堿類的檢測(cè)提供了另一種選擇。

3 結(jié) 論

本研究建立一種簡(jiǎn)單、快速測(cè)定食用油中4 種新煙堿類殺蟲劑的超聲輔助分散液液微萃取萃取方法。對(duì)合成不同類型DES作為萃取劑的萃取效率進(jìn)行研究。結(jié)果表明，由氯化膽堿和乙二醇物質(zhì)的量比為1∶2形成的DES具有最佳的萃取性能。對(duì)影響萃取效率的主要因素進(jìn)行優(yōu)化，在最佳優(yōu)化條件下，該方法具有良好的線性、滿意的回收率、重復(fù)性和較低的LOD，能夠滿足農(nóng)藥殘留分析的要求。并且成功地應(yīng)用于實(shí)際食用植物油樣品中4 種新煙堿類殺蟲劑的檢測(cè)，基質(zhì)對(duì)萃取效果無(wú)顯著影響，該方法對(duì)測(cè)定實(shí)際食用油中新煙堿類殺蟲劑方法具有有效性和可行性。因此，超聲輔助分散液液微萃取具有成本低、簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高的特點(diǎn)，有望成為從油樣品中提取有機(jī)污染物潛在的液相微萃取技術(shù)。